專利名稱：：一種納豆激酶固體發酵方法
技術領域：
：本發明涉及發酵領域，具體涉及納豆激酶固體發酵方法的改進。
背景技術：
：腦血管栓塞性疾病是危害人類健康的主要疾病之一。目前臨床上使用的大多數溶栓藥物，如鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、重組組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等，但它們均在不同程度上存在一定的缺陷，如毒性強、副作用大，在體內半衰期短等，另外它們都是纖溶酶原激活劑型，即需通過激活耙酶纖維蛋白溶酶原(Plasminogen)，使之轉變為纖維蛋白溶酶，再與纖維蛋白結合,發揮溶栓作用，而其自身不能直接作用于纖維蛋白。納豆激酶(Nattokinase,NK)則不然，它來源于食品，無毒副作用，而且對纖維蛋白尤其是交聯形式的纖維蛋白十分敏感，可直接將其水解成小肽和氨基酸。研究表明納豆激酶不僅可以抑制血栓的形成，還可迅速降解纖維蛋白，增加纖維蛋白降解產物(FDP)的量，縮短血漿中的優球蛋白的溶解時間(ELT)，提高優球蛋白的纖溶活性(EFA),并能降低纖溶酶原激活因子抑制劑的活性，從而激活靜脈內皮細胞，引起t-PA的繼發性增加，同時激活尿激酶原(pro-UK)轉變為尿激酶，使內源性纖溶酶量和活性間接增強，具有雙重功能。由于納豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓劑所無法比擬的優點，因此，提高納豆激酶的生產效率和單位產物的酶活具有十分重要的意義。目前，納豆激酶的生產方法主要是發酵，其中，固體發酵占有十分重要的比例。如中國申請號為00107589.6，名稱為"納豆激酶的生產方法及其用途"的申請中，^Hf了固體發酵方法，其最終產品的得率僅為22.9U/G;中國專利申請號為01131720.5,名稱為"納豆激酶的生產方法"，提供了一種用特制浸泡液浸泡優質黃豆后進行固體發酵的方法，并在發酵過程中采用高低溫培養的方法，所得最終產品的得率為690U/G,但其操作過程繁瑣，成本較高。
發明內容本發明的目的是提供一種能提高發酵微生物菌數、單位產物酶活力高、發酵時間短、操作簡便的納豆激酶固體發酵方法。本發明的技術方案為一種納豆激酶固體發酵方法，包括以下步驟(1)滅菌選取大豆洗凈，并浸泡到大豆吸足7jof分，然后將大豆瀝干，在121。C下滅菌30min;(2)接種待步驟(1)所得滅菌大豆冷卻至4(TC以下，在無菌條件下接種，接種所用菌種為枯草芽孢桿菌；(3)發酵在一定溫度和濕度下培養12~24小時，直至每克大豆上活菌數為35~45億個；(4)干燥干燥發酵后的大豆；采用蒸汽控制所述發酵的溫度和濕度，發酵溫度控制為42~45°C,發酵濕度控制為100%。較佳地，步驟(3)中每克大豆上的活菌數為38~42億個。所述干燥溫度《55。C，干燥時間為24-30小時。眾所周知，傳統的固體發酵法產納豆激酶，采用電控制發酵的溫度和濕度，其缺陷在于，無法準確的控制濕度，容易導致培養基干燥，使發酵細菌因干燥而死亡和/或不處于最佳發酵狀態，從而降低了發酵的活菌數和細菌的發酵效率，最終使得總發酵效率降低。本發明的意義在于采用蒸汽控制發酵的溫度和濕度代替傳統的電控制，保證了發酵過程中濕度控制在100%,從而提高了處于發酵狀態的活菌數，進而提高了單位發酵酶活，提高了納豆激酶大規模產業化生產的效率。4下面將通過具體實施例和比較實驗對本發明方案做詳細的敘述。實施例1選取3000g大豆，清洗干凈，室溫下浸泡至大豆吸足水份，表面無皺折，瀝干水份，裝入在高壓滅菌鍋中，在12rC下滅菌30min;待所得滅菌大豆冷卻至4(TC以下，在無菌條件下接種枯草芽孢桿菌，繁殖一段時間后，檢測每克大豆上活菌數達到35~45億個。開始發酵，用蒸汽控制發酵罐內的溫度和濕度在如表1中所示的數值，發酵時間，也如表中所示。發酵完成后，在《55。C，干燥間24~30小時。取部分樣品測定酶活和活菌數。結果如表1所示。對比實-驗選取3000g大豆，清洗干凈，室溫下浸泡至大豆吸足水份，表面無鈹折，瀝干水份，裝入在高壓滅菌鍋中，在12rC下滅菌30min;待所得滅菌大豆冷卻至4(TC以下，在無菌條件下接種枯草芽孢桿菌，繁殖一段時間后，；險測每克大豆上活菌數達到35~45億個。開始發酵，用電控制發酵罐內的溫度和濕度在如表1中所示的數值，發酵時間，也如表中所示。發酵完成后，在《55X:，干燥間24~30小時。取部分樣品測定酶活和活菌數。結果如表1所示。表1電控制發酵溫度和濕度與蒸汽控制的單位產物酶活和活菌數比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述實施例，只是本發明的較佳實施例，并非用來限制本發明實施范圍，故凡以本發明權利要求所述的構造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均應包括在本發明權利要求范圍之內。權利要求1、一種納豆激酶固體發酵方法，包括以下步驟(1)滅菌選取大豆洗凈，并浸泡到大豆吸足水份，然后將大豆瀝干，在121℃下滅菌30min；(2)接種待步驟(1)所得滅菌大豆冷卻至40℃以下，在無菌條件下接種，接種所用菌種為枯草芽孢桿菌；(3)發酵在一定溫度和濕度下培養12～24小時，直至每克大豆上活菌數為35～45億個；(4)干燥干燥發酵后的大豆；其特征在于，采用蒸汽控制所述發酵的溫度和濕度，發酵溫度控制為42～45℃，發酵濕度控制為100％。2、如權利要求1所述的納豆激酶固體發酵方法，其特征在于步驟(3)中每克大豆上的活菌數為38~42億個。3、如權利要求1所述的納豆激酶固體發酵方法，其特征在于，所述干燥溫度《55。C，千燥時間為24-30小時。全文摘要本發明提供了一種納豆激酶固體發酵方法，包括滅菌-接種-發酵-干燥等步驟，在發酵過程中采用蒸汽控制所述發酵的溫度和濕度，發酵溫度為42～45℃，濕度為100％，提高了處于發酵狀態的活菌數，進而提高了單位發酵酶活，提高了納豆激酶大規模產業化生產的效率。文檔編號A61P7/02GK101597600SQ20091004089公開日2009年12月9日申請日期2009年7月7日優先權日2009年7月7日發明者程京燕,蘇保榮申請人:程京燕