專利名稱：精氨酸發酵聯合酶轉化制備瓜氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及瓜氨酸的制備方法，具體涉及一種利用本公司研發的精氨酸發酵菌種 Acl89-20所產生的含L-精氨酸發酵液經惡臭假單胞菌Ac88轉化為L-瓜氨酸的方法。
背景技術：
L-瓜氨酸是一種具有廣泛應用潛力的特種氨基酸，是公認的用途最廣泛的天然氨基酸之一。它在人體內直接代謝產物為精氨酸(體內產生一氧化氮的唯一前體)，具有增強人體免疫力，維持關節健康、壯陽、平衡血糖、吸收有害自由基和降低膽固醇等功效，因而被廣泛用于保健品或食品添加劑。現有的瓜氨酸的生產方法都是使用含有精氨酸脫亞氨基酶的菌體，例如糞腸球菌、惡臭假單胞菌等，使用游離菌體或者菌體固定化的方法把L-精氨酸成品轉化為L-瓜氨酸，因而使瓜氨酸的成本受制于精氨酸成品的價格。目前還尚未見有直接發酵法生產瓜氨酸的方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種精氨酸發酵聯合酶轉化制備瓜氨酸的方法。利用精氨酸發酵法和瓜氨酸酶轉化法聯合制備瓜氨酸是目前最接近于發酵法直接制備瓜氨酸的工藝路線，本發明由精氨酸的發酵液直接轉化為瓜氨酸，從而合并了兩種氨基酸的純化過程，減少了純化的損失，提高了產品收率，使得瓜氨酸的生產成本大大降低。本發明的精氨酸發酵聯合酶轉化制備瓜氨酸的方法，利用含有精氨酸脫亞氨基酶的菌液投入含有精氨酸的發酵液，將發酵液中的精氨酸直接轉化為瓜氨酸，最后分離純化得到合格的瓜氨酸。具體包括以下步驟1)精氨酸發酵液的制備利用本公司研發的精氨酸發酵菌種Acl89_20，(谷氨酸棒桿菌，Corynebacterium glutamicum，微生物保藏號CGMCC No. 3693，保藏時間2010年3月25日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)發酵產生含精氨酸60 80g/L的發酵液。其中，種子培養基配方葡萄糖3wt%, KH2PO4O. 05wt %, K2HPO4 · 3Η200· 15wt%, (ΝΗ4) 2S040. 5wt %、MgSO4 · 7H20 0. 04wt %、維生素 H (VH) 25 μ g/L、玉米菜(C. S. L) 3_5wt %、 酵母膏 0. 5wt%、脲 0. IOwt % ο發酵培養基配方葡萄糖12. 5wt%、(NH4)2S044wt%、脲 0. Iwt % ,KH2PO4O. 15wt%, K2HPO4 · 3H20 0. 05wt %、維生素 H(VH)50y g/L、VB1lmg/L、玉米漿(C. S. L)4wt %、酵母膏 0. 2wt%、泡敵(聚醚3010)萬分之1 千分之1。發酵條件pH:6. 7 7.0，溶解氧20% 25% (以發酵前溶氧值為100%計)，流加補糖，發酵周期78小時，發酵液中精氨酸含量60 80g/L。2)含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體的培養
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利用本公司研發的菌種Ac88 (惡臭假單胞菌，Pseudomonas putida,微生物保藏號CGMCC No. 3694，保藏時間2010年3月25日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏地址背景市朝陽區北展西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)制備含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體。其中，培養基配方葡萄糖2wt %，蛋白胨Iwt %，酵母膏2wt %，精氨酸0. 5wt %，磷酸氫二銨0. 5wt %，磷酸二氫鉀0. Iwt %。培養條件pH 6. 4，溶解氧5% 15% (以發酵前溶氧值為100%計)，發酵周期 30小時(包括種子罐)。菌體分離將上述培養好的發酵液，經0. 2μπι的陶瓷膜過濾器過濾，使濕菌體體積為總發酵液體積的20%，即得到含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體。3)精氨酸直接轉化瓜氨酸將步驟2)得到的惡臭假單胞菌濕菌體按濕菌體對需轉化的精氨酸發酵液 1 25 30體積比，投入步驟1)得到的含精氨酸的發酵液中，并加入總體積0.05襯％的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為催化劑進行酶轉化，即得到含有瓜氨酸的發酵液。轉化條件:ρΗ 5. 5 6. 5，溫度37°C，轉化周期24小時。4)瓜氨酸產品的提純將步驟3)得到的含瓜氨酸的發酵液，經過0. 2 μ m陶瓷膜過濾器過濾去除菌體， 清液經001X7陽離子交換樹脂，瓜氨酸被交換至樹脂上，樹脂經清洗后用17wt%濃度氨水對樹脂進行洗脫，洗脫液經濃縮驅除多于氨后，加入活性炭脫色，60°C真空濃縮至20 25wt%濃度，冷卻至0 5°C結晶，經離心機分離結晶，結晶經60°C真空烘干，得到瓜氨酸純品。本發明的優點是由精氨酸的發酵液直接轉化為瓜氨酸，從而合并了兩種氨基酸的純化過程、提高了產品收率、大大降低了瓜氨酸的生產成本。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。下述實例中的原材料如果沒有特殊說明，均購自上海國藥集團試劑商店，規格為
化學純。30L自控發酵罐購自上海保興生物設備工程有限公司。往復式搖床購自上海世平實驗設備有限公司型號SPH-331。HPLC型號為島津1000。陶瓷膜過濾器為九五高科實驗裝置(膜過濾精度為0. 2 μ m)。實施例130L自控罐精氨基發酵過程利用本公司研發的精氨酸發酵菌種Acl89_20發酵產生含精氨酸60 80g/L的發酵液。其中，種子培養基葡萄糖 3wt %、KH2PO4O. 05wt %、K2HPO4 · 3H20 0. 15wt (NH4) 2S040. 5wt %、MgSO4 · 7H20 0. 04wt %、維生素 H (VH) 25 μ g/L、玉米漿 3_5wt %、酵母膏 0. 5wt% JlO. IOwt % ο
IOOOml搖瓶配置200ml培養液，共配置6瓶，接種后置于30°C環境內培養24小時， 往復式搖床搖轉200r/min。發酵培養基初糖12. 5wt% JlO. IwtKH2PO4O. 15wt%,K2HPO4 · 3Η200· 05wt%, 維生素11作!1)5(^8/1、￥^11^/1、玉米漿(C. S. L)4wt%、酵母膏 0. 2wt%、泡敵(聚醚 3010) 萬分之1 千分之1，補糖液中加酵母膏0. 3wt%,L-組氨酸0. 02wt% (均對初定容12L)。30L自控發酵罐，6個搖瓶并瓶后共1. 2L發酵種子液，接入發酵罐，68小時發酵后， 測得精氨酸含量為64g/L，pH 6. 6 6. 9，溶解氧控制在20% 25%，放罐體積17. 5L。實施例2惡臭假單胞菌菌體培養和濃縮利用本公司研發的菌種Ac88制備含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體。其中，培養基葡萄糖2wt %，蛋白胨Iwt %，酵母膏2wt %，精氨酸0. 5wt %，磷酸氫二銨 0. 5wt %，磷酸二氫鉀 0. Iwt %。IOOOml搖瓶配置200ml發酵液，合計6瓶，接種后置于30°C環境內，往復式搖床， 轉速200r/min，培養24小時。發酵液共計1. 2L，用本實驗室陶瓷膜過濾器濃縮濕菌體到原體積20%的濕菌體 240ml ο實施例3精氨酸直接轉化瓜氨酸將上述240ml濕菌液加入6L精氨酸發酵液中，鹽酸調整pH至6. 0,并加入3. Ig CTAB。于37°C條件下轉化24小時，得含瓜氨酸轉化液6. 24L。實施例4瓜氨酸產品的提純用陶瓷膜過濾器去除瓜氨酸轉化液中的菌體，并在菌體濃縮到原體積20%時加入等體積洗水，共加入洗水3. 7L，然后棄濃菌液，得含瓜氨酸清液8. 7L，由HPLC外標法測定瓜氨酸含量為4wt% (收率90% )。取上述含量4襯％瓜氨酸發酵清液1. 5L，以25ml/min流速過流，直徑55mmX400mm 的001X7樹脂柱。隨后用5L清水洗柱，配置17wt%濃度氨水溶液2L，以lOmin/min流速過柱，收集流出液從PH 5. O上升10. O段，共1.5L，60°C真空濃縮至300ml，加水至1000ml， 加入IOg活性炭40°C 2小時脫色后，濾除活性炭，清液濃縮至200ml，置于5°C冰箱過夜，抽濾瓶抽濾收集濕晶體，置于60°C真空烘箱烘干后得干晶體41. 5g( —次結晶收率69% )。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
權利要求
1.一種精氨酸發酵聯合酶轉化制備瓜氨酸的方法，其特征在于，利用含有精氨酸脫亞氨基酶的菌液投入含有精氨酸的發酵液中，然后將發酵液中的精氨酸直接轉化為瓜氨酸， 最后分離純化得到合格的瓜氨酸，具體包括以下步驟1)精氨酸發酵液的制備利用本公司研發的精氨酸發酵菌種AC189-20，微生物保藏號CGMCC No. 3693，發酵產生精氨酸發酵液；2)含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體的培養利用本公司研發的菌種Ac88， 微生物保藏號CGMCC No. 3694，制備含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體；3)精氨酸直接轉化瓜氨酸；4)瓜氨酸產品的提純。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1)的發酵條件為pH6. 7 7. 0，溶解氧20% 25%，流加補糖，發酵周期78小時，得到的發酵液中精氨酸含量為60 80g/L。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)的培養條件為pH6. 4，溶解氧5% 15%，發酵周期30小時，包括種子罐。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述溶解氧以發酵前溶氧值為 100%計。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將步驟2)得到的惡臭假單胞菌濕菌體按濕菌體對需要轉化的精氨酸發酵液1 25 30體積比，投入步驟1)得到的含精氨酸的發酵液中，并加入總體積0. 05wt%的十六烷基三甲基溴化銨作為催化劑進行酶轉化，轉化條件為pH 5. 5 6. 5，溫度37°C，轉化周期24小時，即得到含有瓜氨酸的發酵液。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，將含有瓜氨酸的發酵液經過濾除菌、 洗脫、脫色、濃縮結晶，離心分離，即制得純品。
全文摘要
本發明公開了一種精氨酸發酵聯合酶轉化制備瓜氨酸的方法，包括以下步驟1)利用本公司研發的精氨酸發酵菌種Ac189-20，微生物保藏號CGMCC No.3693，發酵產生含精氨酸60～80g/L的發酵液；2)利用本公司研發的菌種Ac88，微生物保藏號CGMCC No.3694，制備含精氨酸脫亞氨基酶的惡臭假單胞菌濕菌體；3)精氨酸直接轉化瓜氨酸；4)瓜氨酸產品的提純。本發明由精氨酸的發酵液直接轉化為瓜氨酸，從而合并了兩種氨基酸的純化過程，減少了純化的損失，提高了產品收率，使得瓜氨酸的生產成本大大降低。
文檔編號C12P13/10GK102220390SQ20101014769
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者李文濂, 李煒 申請人:上海聚瑞生物技術有限公司