專利名稱：微環(huán)基因載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
微環(huán)基因載體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種微環(huán)基因載體及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
基因治療是治療很多遺傳性、獲得性疾病最理想方法，目前已經(jīng)有很多臨床前實(shí)驗(yàn)成功的報(bào)道。然而，臨床上成功的例子卻鮮有報(bào)道?；蛑委煹暮诵氖菍⒅委熭d體送入靶細(xì)胞，但載體的構(gòu)建和投送方面，還有若干技術(shù)問題有待解決?；蛑委熭d體可分為兩類，即病毒載體和非病毒載體。病毒載體感染細(xì)胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突變，容易引起嚴(yán)重的反應(yīng)，包括致癌、致命，因而難以被臨床接受；此外，制造成本高也是其應(yīng)用的一大障礙。非病毒載體較安全、經(jīng)濟(jì)、轉(zhuǎn)基因的大小無限制，相對(duì)于病毒載體具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前還缺乏送入體內(nèi)細(xì)胞的有效手段。
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全球有超過全世界三億五千萬人，中國(guó)有超過一億人，是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)攜帶者。HBV可誘發(fā)肝衰竭、肝硬化及肝癌，導(dǎo)致感染者過早死亡?，F(xiàn)有的治療藥物，包括核苷酸類藥物、干擾素等，療效不能持久，需經(jīng)?；蛎刻旖o藥，價(jià)格昂貴且副作用大，應(yīng)用范圍有很大限制。疫苗注射可有效預(yù)防乙肝病毒感染擴(kuò)散產(chǎn)生新帶毒者，但對(duì)己有帶毒者無效。此外，疫苗注射覆蓋不全，且有部份受注者不產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，故每年仍有大量新病例產(chǎn)生。市場(chǎng)需要一種高效、安全、價(jià)廉、方便的新治療技術(shù)與
女口
廣叩ο下面通過基因載體表達(dá)干擾RNA (interference RNA, RNAi)，治療HBV感染的研究現(xiàn)狀，來說明基因治療的巨大潛力和現(xiàn)有問題。RNAi是最近發(fā)現(xiàn)的、生物細(xì)胞內(nèi)的一種保守的分子機(jī)制，可將含有特定結(jié)構(gòu)的雙鏈 RNA (dsRNA)，包括小發(fā)夾 RNA (smalI hairpin RNA, shRNA)和微小 RNA (microRNA,miRNA)加工成20 30喊基的RNA,形成RNA誘導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC),通過與祀mRNA淬火鏈合(annealing),將其裂解或抑制其翻譯,達(dá)到阻止蛋白質(zhì)合成的目的。這是生物調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)過程、抵抗入侵病毒的普遍機(jī)制?？茖W(xué)家們正在做出巨大的努力，試圖把這個(gè)機(jī)制轉(zhuǎn)變成治療技術(shù)，治療各種疾病。已有很多成功的臨床前實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已經(jīng)有采用RNAi的方式，在體內(nèi)、體外抑制HBV病毒復(fù)制，并且具有較好的效果的報(bào)道(McCaffrey，2003)。但該技術(shù)還存在一些問題，因而難以應(yīng)用于臨床，主要包括合成的SiRNA在肝細(xì)胞內(nèi)的存留時(shí)間短，需反復(fù)給藥，成本高；用質(zhì)粒表達(dá)RNAi，在體外短期效果很好，但體內(nèi)投遞，效率不高，僅能到達(dá)少部分肝細(xì)胞，而HBV可存在于幾乎所有的肝細(xì)胞，因而療效不彰；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA復(fù)制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使質(zhì)粒很快失去表達(dá)功能；病毒載體如AAV，肝細(xì)胞感染率很高，對(duì)HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV載體可被宿主體內(nèi)抗體中和失效，或誘發(fā)可致命的宿主免疫反應(yīng)，同時(shí)病毒基因組插入性突變，潛藏著致癌的危險(xiǎn)。因此，發(fā)展安全、高效的載體技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)用RNAi治療HBV感染的關(guān)鍵。除了RNAi,反義 RNA(antisense RNA)、誘傅 RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有強(qiáng)效的抗HBV復(fù)制的效果。但它們與RNAi —樣面臨著載體的構(gòu)筑和有效投送到靶細(xì)胞等問題。Chen 等發(fā)明的微環(huán) DNA (MC)技術(shù)(Chen, Z. Y. , et al. , Minicircle DNA vectorsdevoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expressionin vivo. Mol. Ther. , 2003.),有助于解決上述問題。MC是一個(gè)環(huán)狀表達(dá)盒子,不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA，可在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。在肝細(xì)胞內(nèi)，HBV病毒基因組也能形成環(huán)狀的DNA結(jié)構(gòu)，稱為共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA(cccDNA)。導(dǎo)致HBV感染治療困難的關(guān)鍵，是cccDNA可在肝內(nèi)存在多年，且對(duì)幾乎所有藥物不敏感。MC在結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持久性、細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性上，與HBV cccDNA相同，使MC成為安全、高效的理想載體。然而，MC也存在著投遞到體內(nèi)靶細(xì)胞效率不高的問題。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種能夠高效投遞到靶細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)基因載體。此外，還有必要提供一種上述微環(huán)基因載體的制備方法和應(yīng)用。一種微環(huán)基因載體，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述微環(huán)基因載體包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子；所述微環(huán)基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。優(yōu)選的，所述病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分為乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分。優(yōu)選的，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)、3’包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域；所述啟動(dòng)子、所述5’包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子、所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域以及所述3’包裝信號(hào)依次連接。優(yōu)選的，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域；所述包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子以及所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域依次連接，所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域和包裝信號(hào)連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或非編碼RNA。優(yōu)選的，所述非編碼RNA為小發(fā)夾RNA、微小RNA、反義RNA、誘餌RNA和核酶中的至少一種。優(yōu)選的，所述微環(huán)基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。一種微環(huán)基因載體的制備方法，包括如下步驟步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
步驟二、將啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體；步驟三、使用重組酶Φ031處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組得到所述微環(huán)基因載體。一種試劑盒，包括上述的微環(huán)基因載體以及用于將所述微環(huán)基因載體送入靶細(xì)胞的工具。通過將病毒基因組中的負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分，克隆到載體中，得到重組的嵌合的微環(huán)基因載體。只要把少量的微環(huán)基因載體送入感染了病毒的靶細(xì)胞內(nèi)，微環(huán)基因載體便可生產(chǎn)具有治療性的和感染性的重組病毒，重組病毒通過感染新的靶細(xì)胞，生產(chǎn)新的感染性的重組病毒，最終擴(kuò)散到所有的靶細(xì)胞，相對(duì)于傳統(tǒng)的基因載體，能夠高效投 遞到靶細(xì)胞內(nèi)，具有強(qiáng)大、持久的治療效果。本發(fā)明還提供上述微環(huán)基因載體的制備方法和應(yīng)用。

圖I為一實(shí)施方式的帶有治療性轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的微環(huán)基因載體MC. CMV. Ther. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為制備微環(huán)基因載體的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 (tC31的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為不帶有Ther.的空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為MCl與肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA協(xié)同生產(chǎn)重組乙肝病毒rHBV示意圖。圖5為MC. Ther. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6A為將轉(zhuǎn)基因AntiHBV、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子UB. AntiHBV和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子HI. AntiHBV分別插入到空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的示意圖。圖6B為一實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的miRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。圖6C為一實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的shRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。圖 7A 為將 AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV. AntiHBV. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7B為RC. Cp. AntiHBV的結(jié)構(gòu)示意圖。圖8A 為將 UB. AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV.UB. AntiHBV. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖8B 為 RC. Cp. UB. AntiHBV 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9A 為將 HL AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV.HI. AntiHBV. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9B 為 RC. Cp. HI. AntiHBV 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IOA為MC. CMV. EGFP. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IOB為RC. Cp. EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IlA 為 MC. CMV. UB. EGFP. RC 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IlB為RC. Cp. UB. EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖12A為MC. CMV. hAAT. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖12B為RC. Cp. hAAT的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)微環(huán)基因載體及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步的解釋說明。提供一種微環(huán)基因載體，當(dāng)這種微環(huán)基因載體被送入到感染了病毒的靶細(xì)胞內(nèi)后，可以生產(chǎn)病毒基因治療載體。靶細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物體內(nèi)的肝主質(zhì)細(xì)胞(hepatocyte)，非肝主質(zhì)細(xì)胞(nonparenchymal hepatocyte)如肝的內(nèi)皮細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞或其它器官的細(xì)胞。生產(chǎn)出來的病毒基因治療載體可以像野生的病毒一樣，感染新的靶細(xì)胞，生產(chǎn)新的感染性的重組病毒，并且本身可以表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，從而長(zhǎng)期、有效的發(fā)揮作用，
成為一種安全、高效、方便、經(jīng)濟(jì)的基因治療技術(shù)。這種微環(huán)基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。這種微環(huán)基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或非編碼RNA(noncoding RNA)?？梢赃x擇僅為表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)基因，也可以選擇包含表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物基因以及自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。非編碼RNA 可以為小發(fā)夾 RNA(small hairpin RNA, shRNA)、微小 RNA(micorRNA，miRNA)、反義 RNA(antissense RNA)、誘傅 RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)中的至少一種。微環(huán)基因載體表達(dá)的蛋白質(zhì)可以與病毒蛋白特異性結(jié)合，表達(dá)的非編碼RNA可以與病毒的祀mRNA淬火鏈合(annealing),將其裂解或抑制其翻譯,達(dá)到阻止蛋白質(zhì)的合成和病毒復(fù)制的目的。這種微環(huán)基因載體為雙鏈的DNA，可以通過如下方法制備步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。步驟二、將啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到包含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體。步驟三、使用重組酶Φ031處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組得到所述微環(huán)基因載體。通過Chen 等的微環(huán) DNA 技術(shù)(Chen, Z. Y. , et al. , Minicircle DNA vectorsdevoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expressionin vivo. Mol. Ther. , 2003.),得到微環(huán)基因載體,該微環(huán)基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子；并且可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。
通過將病毒基因組中的負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分，克隆到基因載體中，得到重組的嵌合的微環(huán)基因載體。只要把少量的微環(huán)基因載體送入感染了病毒的靶細(xì)胞內(nèi)，微環(huán)基因載體便可生產(chǎn)具有治療性的和感染性的重組病毒，重組病毒通過感染新的靶細(xì)胞，生產(chǎn)新的感染性的重組病毒，最終擴(kuò)散到所有的靶細(xì)胞，相對(duì)于傳統(tǒng)的基因載體，能夠高效投遞到靶細(xì)胞內(nèi)，具有強(qiáng)大、持久的治療效果。針對(duì)乙肝病毒(HBV),介紹一實(shí)施方式的利用HBV基因負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分的微環(huán)基因載體。本實(shí)施方式中所用的HBV的基因組為Galibert所報(bào)道的ayw菌株(Galibert,F. , et al. , Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome(suntype ayw)cloned in E. coli. Nature 1979. 281 :p. 646-650 ;GenBank 號(hào) V01640)作為模范序列，簡(jiǎn)稱ayw. Galibert,來自含有I. 2單位的HBV基因組的質(zhì)粒pTHBV2 (McCafrey，A. P.，et al. , Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatureBiotechnology, 2003. 21 (6))。根據(jù) Nassal (NASSAL,M. and A. RIEGER , A Bulged Region ofthe Hepatitis B Virus RNA Encapsidation Signal Contains the Replication Originfor Discontinuous First-Strand DNA Synthesis. JOURNAL OF VIROLOGY,1996. 70 (5)p. 2764-2773)的建議，DNA序列以核心蛋白基因啟始密碼ATG為5’端，前基因組RNA第一個(gè)堿基為第3100。如圖I所示的微環(huán)基因載體,包括巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(cytomegalovirusimmediate early promoter,CMV)、HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)(Encapsulationsignal,Enc)、3’包裝信號(hào)(3，Enc)、第一增強(qiáng)子(Enhancer I,Enhl)以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域(Replication regulatory region, RCR),上述基因主要負(fù)責(zé)HBV的包裝、復(fù)制和表達(dá)。轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子用于表達(dá)治療型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，可以記為Ther.(Therapeutic transgene)。這種微環(huán)基因載體包含的各種成分為依次連接的CMV、5’ Enc、Ther.、EnhU RCR和3’ Enc，連接CMV和Enc的序列中存在固有的重組產(chǎn)物attR。在其他的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以選擇啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子(Cp)、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子。第二型多聚酶基因啟動(dòng)子可以為CMV或UB (泛素基因的啟動(dòng)子)，第三型多聚酶基因啟動(dòng)子可以為HI。Hl啟動(dòng)子可得自“pSilencer 3.1-Hlneo”質(zhì)粒(AppliedBiosystem, Carlsbad, California, USA)。這種結(jié)構(gòu)的微環(huán)基因載體可以記為MC. CMV. Ther. RC,簡(jiǎn)稱MCI。結(jié)合圖2和圖3，以CMV啟動(dòng)子為例，對(duì)MCl的制備方法進(jìn)行說明參照Chen等的微環(huán)DNA技術(shù),提供如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 <i)C31。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒ρ2Φ031具有可誘導(dǎo)的重組酶C>C31位點(diǎn)、可誘導(dǎo)的歸巢內(nèi)切酶(homing endonuclease)
I-SceI位點(diǎn)、重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)、重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)以及多克隆位點(diǎn)。將CMV、HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分共三個(gè)DNA片段用標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)，依次插入到p2(tC31的多克隆位點(diǎn)中，三個(gè)DNA片段為(1)、CMV. Enc, CMV和5’Enc,相當(dāng)于 MC. 2013 的 16 712 共 697bp (LiSB 等,High expression of hepatitis Bvirus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system.World J Gastroenterol 13(17) :2490,2007);⑵、Enh 1，相當(dāng)于ayw Galibert 的2264 2601 共 338bp ; (3)、RCR. Enc，病毒復(fù)制調(diào)控區(qū)和 3’ Enc，相當(dāng)于 ayw Galibert 的 2913 3182/1 20共290bp。RCR. Enc中包含第一、第二重復(fù)序列(DRl和DR2，圖中未顯示)，與DNA合成有關(guān)的序列Φ (圖中未顯示)，第二增強(qiáng)子(Enh 2，圖中未顯示)，核心蛋白基因增強(qiáng)子以及前基因組RNA的3’包裝信號(hào)(3’ Enc)。 上述操作完成后，得到如圖3所示的空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC，接著將Ther.插入到5’ Enh I下游,最后利用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，attB和attP序列重組形成attR，最終得到微環(huán)基因載體，該微環(huán)基因載體即為MCI。上述三個(gè)DNA 片段均可從 pTHBV2 (McCafrey, A. P. , et al. , Inhibition ofhepatitis B virus in mice by RNA interference. Nature Biotechnology,2003. 21 (6))中得到?！?br> 得到MCI后，可以采用MCl轉(zhuǎn)染細(xì)菌ToplJiMCl進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)合圖4對(duì)MCl抑制在感染了 HBV病毒的肝主質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)和復(fù)制的機(jī)理進(jìn)行簡(jiǎn)單說明。MCl被送入到感染了 HBV病毒的肝主質(zhì)細(xì)胞后，啟動(dòng)子CMV驅(qū)動(dòng)表達(dá)重組的HBV前基因組RNA，肝主質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的HBV病毒表達(dá)病毒蛋白，并將重組的HBV前基因組RNA包裝成治療性的、感染性的重組HBV(rHBV)。rHBV的基因組是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一條較長(zhǎng)負(fù)鏈已經(jīng)形成完整的開放式環(huán)狀，另一條長(zhǎng)度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。在感染肝細(xì)胞之后，這條半環(huán)狀的DNA鏈要以負(fù)鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下延長(zhǎng)，最終形成完整的環(huán)狀。這時(shí)的乙肝病毒基因組就形成了一個(gè)完全開放式的環(huán)狀的雙鏈DNA，經(jīng)過DNA重組成為重組共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA (recombined covalent closed circular,rcccDNA),具有野生乙肝病毒重組共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA(covalent closed circular,cccDNA) 一樣的表達(dá)和復(fù)制功能。rcccDNA沒有CMV，可以記為MC. Ther. RC,簡(jiǎn)稱MC2。MC2中RCR和新形成的的Enc相連形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子(Cp)，加上上游Enhl，能夠長(zhǎng)期地、高水平地表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。HBV感染肝主質(zhì)細(xì)胞內(nèi)后會(huì)先重組形成共價(jià)鍵密閉環(huán)狀(covalent closedcircular, ccc)DNA,接著表達(dá)核心蛋白、多聚酶(polymerase, pol)、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白。重組的rHBV前基因組RNA的包裝過程包括如下步驟首先重組的rHBV前基因組RNA與pol—起,被核心蛋白包裝成不成熟的病毒粒子(nucleocapsid)。接著,重組的rHBV前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄形成兩條DNA雙鏈，其中一條較長(zhǎng)負(fù)鏈已經(jīng)形成完整的開放式環(huán)狀，另一條長(zhǎng)度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。最后不成熟的病毒顆粒被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹，大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白被加入到病毒粒子中，形成治療性的、感染性的rHBV。MC2的結(jié)構(gòu)如圖5所示，包含的各種成分為依次連接的Enc、Ther.、Enhl和RCR，RCR和Enc連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子Cp，加上促進(jìn)子Enhl，從而能夠長(zhǎng)期表達(dá)高水平的、治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域?yàn)橐腋尾《净蚪M中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分。因此,MC2中包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子，并且不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分。
MC2為另一實(shí)施方式的微環(huán)基因載體。MC2可以通過將MCl送入感染了 HBV的肝主質(zhì)細(xì)胞中后提取得到，也可以采用基因重組的手段，將相關(guān)序列插入到p2<tC31的多克隆位點(diǎn)中，最后采用制Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，大量制備含有attR的MC2。本實(shí)施方式中，Ther.為不帶有自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因AntiHBV，用于抑制HBV的復(fù)制，從而治療乙肝。根據(jù)Ther.是否帶有自身啟動(dòng)子，以及啟動(dòng)子的種類，可以得到不同的具體的MCl和MC2。 AntiHBV 表達(dá)非編碼 RNA,可以為 shRNA、miRNA、antissense RNA、decoyRNA 和ribozyme中的至少一種。本實(shí)施方式中，AntiHBV表達(dá)miRNA，具體的信息見圖6B。如圖6A所示，將轉(zhuǎn)基因AntiHBV、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子UB. AntiHBV和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子HI. AntiHBV分別插入到空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的5’ Enh I下游，再通過微環(huán)DNA技術(shù)，得到不同的MCI。如圖6B所示的本實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的miRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為RNAi兩種基本形式之一，加黑斜體部分為抗HBVsiRNA，引自Ely等(Ely, A. , T. Naidoo, and P. Arbuthnot, Efficient silencing of gene expression withmodular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles.Nucleic Acids Research,2009. 37(13) :p.e91)。如圖6C所示的另一實(shí)施方式的AntiHBV抗乙肝病毒的shRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為RNAi的另外一種基本形式。加黑斜體部分為抗HBVsiRNA，引自McCaffreyAP et al. (McCafrey, A. P. ,et al. , Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNAinterference. Nature Biotechnology,2003. 21(6))。如圖7A所示的MC. CMV. AntiHBV. RC,表達(dá)后得到的MC2如圖7B所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp，記為RC. Cp. AntiHBV。如圖8A所示的MC. CMV. UB. AntiHBV. RC，表達(dá)后得到的MC2如圖8B所示，記為RC.UB. AntiHBV0如圖9A所示的MC. CMV. HI. AntiHBV. RC，表達(dá)后得到的MC2如圖9B所示，記為RC. HI. AntiHBV0在其他的實(shí)施方式中，根據(jù)Ther.的不同，可以獲得針對(duì)不同病毒或具有不同功能的微環(huán)基因載體?！獙?shí)施方式的用于表達(dá)報(bào)告基因的微環(huán)基因載體，本實(shí)施方式中，報(bào)告基因?yàn)樵鰪?qiáng)型魚綠色熒光蛋白(EGFP)基因。根據(jù)EGFP基因自身是否帶有啟動(dòng)子，可以得到兩種類型的微環(huán)基因載體。如圖IOA所示的微環(huán)基因載體，EGFP基因自身不帶啟動(dòng)子，微環(huán)基因載體記為MC. CMV. EGFP. RC,表達(dá)后得到的MC2如圖IOB所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp，記為RC.Cp.EGFP。如圖IlA所示的微環(huán)基因載體，EGFP基因自身帶有啟動(dòng)子UB,微環(huán)基因載體記為MC. CMV. UB. EGFP. RC,表達(dá)后得到的MC2如圖IlB所示，記為RC. Cp.UB.EGFP。如圖12A所示的一實(shí)施方式的用于表達(dá)抗胰蛋白酶(humanalpha-lantitrypsin, hAAT)的微環(huán)基因載體，記為MC. CMV. hAAT. RC。表達(dá)后得到的MC2如圖12B所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp，記為RC. Cp. hAAT。本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括如上所述的微環(huán)基因載體以及用于將該微環(huán)基因載體送入靶細(xì)胞的工具。在一般的實(shí)施例中，可以選擇用脂質(zhì)體(Lipofectamine)與微環(huán)基因載體混合，將微環(huán)基因載體送入靶細(xì)胞。下面通過具體的試驗(yàn)，來驗(yàn)證上述制備的微環(huán)基因載體的表達(dá)功能。I、測(cè)定MCl表達(dá)EGFP的功能。試驗(yàn)分成四組
(I) ,MC. CMV. EGFP. RC (圖 10A)；(2)、MC. CMV. UB. EGFP. RC (圖 11A)；(3)、MC. CMV. UB. antiHBV. RC (圖 8A);(4)、Lipofactamin 2000 對(duì)照組。各種DNA載體,每種4 μ g,按供應(yīng)商提供的程式加上Lipofactamin 2000后,轉(zhuǎn)染6-井培養(yǎng)孟huh7細(xì)胞；Lipofactamin對(duì)照組僅用Lipofectamin處理。48小時(shí)后，用突光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第1、2組，魚綠色熒光蛋白陽性效率分別為8. 5%和13. 4%，而第3、4組陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MCl能按照設(shè)計(jì)，表達(dá)EGFP基因。Lipofectamine 2000 是美國(guó) Invitrogen 的產(chǎn)品(Carlsbad, California, USA) 2、測(cè)定MCI表達(dá)抗乙肝非編碼RNA抑制HBV表達(dá)和復(fù)制功能。(I)、MC2009+MC. CMV. AntiHBV. RC (圖 7A)；(2)、MC2009+MC. CMV. UB. AntiHBV. RC (圖 8A);(3、MC2009+MC. CMV. HI. AntiHBV. RC (圖 9A)；(4)、MC2009+pBS. KSII。MC2009是一個(gè)帶有兩個(gè)相連拷貝的ayw. Galibert乙肝病毒基因組，可以生產(chǎn)完整的乙肝病毒顆粒(Li SB 等，High expression of hepatitis B virus basedvector with reporter gene in hepatitis B virus infection system. World JGastroenterol 13 (17) :2490,2007)。2μ g 的 MC2009，力卩上 6 μ g 的 MC. CMV. AntiHBV. RC、MC. CMV. UB. AntiHBV. RC、MC. CMV. HI. AntiHBV. RC 或pBS. KSII，溶解到 2ml 的生理鹽水中，用標(biāo)準(zhǔn)的尾靜脈高壓注射法，注入小鼠肝臟。四天后，抽血用ELISA方法檢測(cè)HBsAg，用qPCR方法檢測(cè)乙肝病毒DNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中的HBsAg，水平分別為1624±582、922±352、1257±395和4865±1580ng/ml。與對(duì)照第四組相比，對(duì)HBsAg的抑制率分別為66. 6_、81. I-和74. 2%，血清中HBV DNA的水平分別減少51. 1-,70. 7-和56. 5%0這些結(jié)果，表明表達(dá)抗乙肝非編碼RNA，對(duì)乙肝病毒的表達(dá)和復(fù)制有抑制作用。結(jié)果表明，三種抗乙肝MCl都有抑制乙肝病毒表達(dá)和輔助的作用。本實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為10周大，雌性，N0D/SCID種。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種微環(huán)基因載體，其特征在于，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述微環(huán)基因載體包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子；所述微環(huán)基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。
2.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分為乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分。
3.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)、3’包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域； 所述啟動(dòng)子、所述5’包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子、所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域以及所述3’包裝信號(hào)依次連接。
4.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域； 所述包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子以及所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域依次連接，所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域和包裝信號(hào)連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或非編碼RNA。
7.如權(quán)利要求6所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述非編碼RNA為小發(fā)夾RNA、微小RNA、反義RNA、誘餌RNA和核酶中的至少一種。
8.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)基因載體，其特征在于，所述微環(huán)基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。
9.一種權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的微環(huán)基因載體的制備方法,其特征在于,包括如下步驟 步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； 步驟二、將啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體； 步驟三、使用重組酶OC31處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組得到所述微環(huán)基因載體。
10.一種試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的微環(huán)基因載體以及用于將所述微環(huán)基因載體送入靶細(xì)胞的工具。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微環(huán)基因載體，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述微環(huán)基因載體包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。通過將病毒基因組中的負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分，克隆到載體中，得到重組的嵌合的微環(huán)基因載體。只要把少量的微環(huán)基因載體送入感染了病毒的靶細(xì)胞內(nèi)，微環(huán)基因載體便可生產(chǎn)具有治療性的和感染性的重組病毒，重組病毒通過感染新的靶細(xì)胞，生產(chǎn)新的感染性的重組病毒，最終擴(kuò)散到所有的靶細(xì)胞，相對(duì)于傳統(tǒng)的基因載體，能夠高效投遞到靶細(xì)胞內(nèi)，具有強(qiáng)大、持久的治療效果。本發(fā)明還提供上述微環(huán)基因載體的制備方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102888426SQ20111020242
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者陳志英, 何成宜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院