專利名稱：一種針對人TNF-α分子的自體疫苗的構建方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及基因克隆、基因重組、外源基因在原核細胞中的表達、目的蛋白的純化等技術領域，進一步涉及一種在體內能夠誘導出針對人 TNF-α分子自身抗體的蛋白疫苗的構建方法。
背景技術：
1. TNF- α分子及抗TNF- α治療的相關研究1.1TNF-α 分子1975年Carswell等發現，卡介苗和細菌內毒素感染的小鼠血清中有一種高活性的腫瘤細胞毒因子，可使腫瘤發生出血性壞死，但對正常組織細胞無殺傷活性，將其命名為腫瘤壞死因子——TNF- α。人TNF- α基因位于6號染色體，基因長41Λ，含4個外顯子，與 MHC基因連鎖，其前體由232個氨基酸組成，含有76個氨基酸的信號肽。小鼠基因位于17 號染色體，由4個外顯子和3個內含子組成，前體由235個氨基酸組成。人和小鼠TNF-α前體有79%同源性，成熟型人TNF-α由157個氨基酸組成，分子量約為17KDa，較小鼠成熟型 TNF在73位多一個組氨酸殘基。人和小鼠的成熟型TNF-α均含有兩個半胱氨酸(人69、 101位；鼠69、100位)，可以形成分子內二硫鍵。從細胞株培養上清中分離純化的TNF-α 在非還原條件下分子量大小不等，在還原條件下分子量為17KDa，與理論分子量一致。這可能是因為TNF-α以不同程度的聚合體形式存在的原因。目前已證實TNF-α活性形式是由 17KDa的亞基組成的同源三聚體。TNF-α是一種多功能的細胞因子。它除了能在體內、外殺傷腫瘤細胞外，還具有誘導炎癥反應、抗病毒感染、調節機體免疫、促進細胞增殖和活化等多種功能。TNF-α對腫瘤具有直接抑制和細胞溶解作用，但不同腫瘤株對TNF-α的敏感性不同。TNF-α抗腫瘤機制不完全清楚，目前的研究結果表明TNF-α抗腫瘤的機制主要有(1)通過與腫瘤細胞TNF-α的表面受體結合而發揮細胞毒作用。目前已知的受體有兩種，TNFR I和TNFR II，均為跨膜糖蛋白。TNFR I通過其胞漿區的約80個氨基酸殘基的死亡區結構域(death domain, DD)介導腫瘤細胞的凋亡。(2)通過對血管內皮細胞的作用，誘導凝血因子的表達，增加纖溶酶原抑制劑的分泌，從而促進血管內凝血及血栓的形成，造成腫瘤組織的局部缺血而壞死。(3)通過介導殺瘤效應細胞的作用和誘導腫瘤局部的炎癥反應，促進殺瘤效應細胞的作用。在抗病毒方面，TNF-α可以選擇性的殺傷病毒感染的細胞，并對不同的病毒感染具有不同的作用。如對VSV、HSV等病毒具有抑制作用，但是對HIV具有促進作用。另外， TNF-α是重要的炎癥因子，一方面它可以刺激內皮細胞表達MHC I類抗原和多種黏附分子的表達，促進IL-1、IL-6的表達，刺激內皮細胞和白細胞釋放一系列炎癥介質。另一方面 TNF-α可促進中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞黏附在內皮細胞上，從而參與炎癥反應。 TNF-α還能夠促進T、B細胞增殖，促進抗體產生；活化單核巨噬細胞，提高其殺傷活性；上調巨噬細胞MHC II類分子，提高抗原呈遞能力等。1.2 抗 TNF-α 治療研究發現，TNF-α在體內持續、高水平的表達時在多種疾病中發揮重要的作用， 如惡液質、胰島素抵抗、感染性休克、炎癥反應、自身免疫性疾病等。研制TNF-α拮抗藥物為治療TNF-α水平增高相關疾病提供了一條好的途徑。傳統的用于治療體內TNF-α的過量表達相關疾病的藥物主要有非甾類抗炎藥 (NSAIDS)，緩解疾病的抗風濕藥物(DMARD)，皮質留類、免疫抑制劑和止痛劑。近年來相繼問世的新藥有氨甲喋呤、來氟米特等。但上述藥物均具有較明顯的毒副作用。目前研究主要集中于TNF-α拮抗生物制劑，其療效顯著、副作用小。已發明的 TNF-α 拮抗藥物有 infliximab、etanerc印t、adalimumab、CDP571 和 CDP870。前三種藥物已通過FDA批準。Kanerc印t，是基因重組sTNFR75與人IgGFc段的融合蛋白，可同時抑制TNF-α和TNF-β，1998年11月被FDA批準用于治療青少年RA和腰肌炎。Infliximab，是TNF-α中和性人鼠嵌和抗體，1999年被FDA批準用來治療RA，后又用來治療Crohn病。Adalimumab是完全人源化的TNF-α中和性IgGl單克隆抗體，可用于治療RA和Crohn病。近年來的臨床研究表明抗TNF- α在臨床治療RA取得了較好的療效。2002年美國風濕病學會發布的RA治療最新指南指出，早期RA患者和使用DMARDS治療無效的患者對etanerc印t有效。使用足量氨甲喋呤不能控制的進行性活動性的RA患者， etanercept和infliximab聯合使用有效，目前推薦單獨使用infliximab或與氨甲喋呤聯合治療。TNF- α拮抗藥物治療除了可用于RA外，也可應用于其它TNF- α水平增高相關疾病的治療，如，惡病質、克隆病、強直性脊柱炎、銀屑病關節炎等。雖然，在臨床上TNF- α單克隆抗體和可溶性受體具有較好的療效，但是，這些藥物存在有用藥量大、需長期反復使用、易引起超敏反應的缺陷。除此之外，昂貴的藥費也是阻礙此類藥物廣泛應用的原因。據統計，臨床上每位接受etanerc印t治療的病人平均年花費為1. 5萬美元，接受Infliximab或Adalimumab治療的病人平均年花費為9萬美元，如此昂貴的藥費即使在發達國家也是難以負擔的。2.治療性疫苗2.1研究進展近年來，針對人類自身蛋白的單克隆抗體在治療急、慢性疾病的過程中顯示出了良好的效果。但是，造價的昂貴和使用上的不便限制了單克隆抗體的廣泛應用，因此，由被動地接受這種抗體蛋白轉向尋求針對人類自身蛋白的主動免疫疫苗，即用主動免疫的治療方式替代被動免疫，成為蛋白藥物的發展方向。目前，治療性疫苗的研究已成為一個熱點， 涉及很多疾病，如慢性病毒感染、腫瘤、阿爾茨海默病、糖尿病、高血壓、肥胖癥以及風濕性關節炎等。治療性疫苗使人的免疫系統發生有利于患者的反應。大部分的疫苗可以分為兩大類一類是誘導機體發生體液免疫反應，產生抗體；另一類是誘導機體發生細胞免疫反應， 產生細胞毒性T細胞(CTLs)。后一類治療性疫苗主要用于腫瘤和病毒感染性疾病的治療。絕大多數的預防性疫苗都是通過誘導抗體的產生來保護機體的，這就證明通過誘導抗體來治療感染性疾病是一種有效的治療方法。與預防性疫苗相比，治療性疫苗的發展相對緩慢，但是近幾年單克隆抗體在治療疾病方面所取得的巨大成功預示著治療性疫苗有著廣闊的發展前景。實際上，已經有動物試驗表明誘導出一定水平的內源性特異性抗體來治療疾病是可能的，如針對血管緊張素的疫苗可以治療高血壓；針對IL-9的疫苗可以治療嗜酸性細胞增多癥；針對IL-5的疫苗可以治療哮喘；針對N-methyl-D-aspartate receptor-1 (NMDARl)的疫苗可以治療中風。另外，針對一些性激素如人絨毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotro-pin HCG)的免疫可以降低婦女體內的激素水平而達到避孕效果；針對促性腺素釋放激素(&iRH)的疫苗可以用于治療晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治療性疫苗誘導出針對胃泌素(gastrin)的抗體可以延長病人的生命。那么，治療性疫苗的研究中存在哪些問題呢？最近在針對阿爾茨海默病的治療性疫苗的研制過程所發生的情況似乎對這個問題做了回答。阿爾茨海默病是一種看起來非常適合用治療性疫苗進行治療的疾病，這種病的發病過程長達數年甚至數十年。如果能用治療性疫苗誘導出持續時間較長的抗體的話，那么無疑是一種理想的治療方法，尤其是這種病人經常忘記吃藥。阿爾茨海默病的特征是大腦中斑塊的沉積，這種斑塊中含有A β -肽，這種A β -肽是從淀粉樣蛋白的前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)衍生來的。在編碼APP的基因發生突變導致Αβ-肽的生成增加的人群中，阿爾茨海默病在早年就開始發生了。表達這種突變的APP的轉基因小鼠大腦內有大量的斑塊沉積，這種斑塊與阿爾茨海默病病人腦中發現的斑塊相似。用Αβ -肽加上強免疫佐劑來免疫這種轉基因小鼠會使小鼠腦中的斑塊減少，小鼠的精神表現明顯好轉。隨后，一種針對阿爾茨海默病的治療性疫苗開始了臨床試驗，在臨床I期試驗證明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的臨床II期緊跟著開始了，但是沒有想到的是6 %的試驗對象由于產生無菌性腦炎而被迫停止試驗。隨后研究證實，這種副作用與抗體的滴度沒有關系，實際上，一名沒有產生抗體反應的受試病人也得了無菌性腦炎。另外，在一名病人的大腦中發現有大量的淋巴細胞浸潤。這些研究結果與一種假說相一致，那就是在病人中發現的副作用是由于Αβ-肽特異性的T淋巴細胞引起的，而不是由于抗體引起的。這就要求能夠研制出不引起T淋巴細胞介導的自身免疫的第二代疫苗。那么，這種針對阿爾茨海默病的治療性疫苗的效果如何呢？在前面提到的臨床II期試驗中，在誘導出抗A β -肽抗體的病人中有一部分認知力的減弱確實推遲了，有一些病人甚至在接受治療的這一年中意識狀態有了好轉。如果在疫苗設計時能夠解決其安全性問題， 那么在不久的將來，針對阿爾茨海默病的治療性疫苗就會出現。另一類稍有不同的疫苗對安全性的要求更低一些，那就是針對上癮藥物的疫苗。 在動物試驗中針對可卡因和尼古丁的疫苗降低了這些藥物在大腦中的水平，消除了它們的成癮癥狀，試驗動物在接受了免疫后對藥物不再依賴。在臨床I期試驗中，可卡因疫苗被證明有良好的耐受性，并且可以誘導出良好的抗體反應，目前正在進行有效性驗證。2. 2誘導自身抗體的理論研究針對自身蛋白的治療性疫苗是如何誘導自身免疫系統產生針對自身蛋白的抗體呢？要產生足夠高的滴度的特異性抗體以治療相關疾病，治療性疫苗必須克服三個障礙Τ 細胞耐受、B細胞耐受、在沒有佐劑和抗原長效制劑的情況下誘導出抗體。眾所周知，人體免疫系統主要是對外來入侵者發動攻擊的，而對機體本身是不攻擊的，這可能是由于機體具有能夠識別“非我”與“自我”的能力。免疫系統的這種特性通常被稱為耐受或無反應性。耐受發生在B細胞和T細胞水平。一般來說，T細胞耐受更嚴格一些。對許多抗原來說，在發生T細胞耐受的同時，正常的B細胞株卻在體內存在。實際上，有三種機制導致了免疫耐受細胞株剔除，即特異性的淋巴細胞從淋巴細胞群中被徹底剔除；免疫無能，即特異性的淋巴細胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴細胞存在，但是由于沒有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。對T細胞來說，誘導耐受和無能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但誘導耐受也可以在外周進行。B細胞耐受主要在骨髓中誘導，但也可在外周誘導。通常，對于普遍表達的豐富抗原的免疫耐受更容易闡明。在針對外來抗原的免疫反應中，T細胞和B細胞互相配合才能有效地產生抗體當受到外來抗原免疫時，特異性的B細胞結合抗原，產生起始的激活信號。另外，B細胞內吞抗原，在其表面呈現抗原肽和MHC II類分子的復合物。通常，B細胞不能激活TH細胞。要激活TH細胞，樹突狀細胞是必不可少的，樹突狀細胞攝取抗原，并在其細胞表面呈遞抗原肽和MHC II類分子的復合物，激活TH細胞。激活后的TH細胞識別B細胞表面呈現的抗原肽和MHC II類分子的復合物，引起B細胞增殖、抗體的產生以及抗體類別的轉換。如果因為免疫耐受而缺乏TH細胞的協同作用，那么就不會產生抗體。在針對自身蛋白的疫苗的設計過程中，如果將自身抗原與外源蛋白或多肽載體融合或偶聯在一起，就有可能繞過TH細胞耐受自身抗原特異性的B細胞就能夠攝取該自身抗原以及與其相連的載體蛋白，并在其表面呈現載體肽與MHC II類分子的復合物，由于TH細胞對載體蛋白沒有免疫耐受，所以能夠被激活，從而協同自抗原特異性的B細胞產生針對自身抗原的特異性抗體。與T細胞耐受相比，B細胞耐受要寬松得多。實際上，在許多情況下，自身特異性 B細胞在體內以正常的頻率出現，如果受到抗原和TH細胞的共同作用就會被激活。所以對許多可溶性自身蛋白來講，體內存在其特異性B細胞株，尤其當這種蛋白不是非常富余表達的時候更是這樣。對于這類蛋白或多肽，將其與載體蛋白相連，繞過T細胞耐受，就有可能產生有效的疫苗。實際上，利用這種策略，針對多種自身激素的抗體反應已經被誘導出來了。3. TNF- α自體疫苗的研究進展目前，TNF-α疫苗研究主要集中在篩選TNF-α抗原表位、融合蛋白疫苗和DNA疫苗幾個方面。Sioud等用人TNF純化類風濕關節炎病人的抗血清，得到具有TNF-α中和活性的TNF-α自身抗體，用此抗體篩選噬菌體隨機九肽庫，用篩選得到的噬菌體顆粒免疫小鼠，誘發了鼠抗人TNF-α抗體，研究表明重組噬菌體可作為疫苗研究的有效工具。Dalum等用T輔助細胞表位和TNF- α融合表達的蛋白免疫二型膠原誘導的關節炎小鼠模型，結果小鼠的癥狀得到了緩解，為類風濕關節炎和慢性感染疾病的治療開辟了一條新途徑。Blank 等用編碼TNF-α的DNA免疫抗磷脂綜合癥的小鼠，在小鼠體內誘發了抗TNF-α抗體，這些抗體可以阻滯TNF-α引起的內皮細胞活性，抑制了單核細胞對活化的內皮細胞的黏附，與對照組相比可以明顯的改善抗磷脂綜合癥小鼠的癥狀。Waterston等比較了 TNF-α單克隆抗體和TNF-α自體疫苗在治療腫瘤轉移的效果，結果表明兩者在小鼠體內都可成功的減少肺腫瘤的轉移。近來Waterston等通過一期臨床試驗評估了 TNF-α自體疫苗的免疫原性和安全性，不幸的是盡管疫苗誘發的血清抗體可以識別變性的人TNF-α分子，但是卻不能中和天然狀態的人TNF-α分子，分析原因可能是因為抗原的純化過程中使抗原變性的原因。
以上研究表明，雖然TNF-α自體疫苗也是一種治療TNF-α表達過高相關疾病的好方法，但是，篩選有效的T細胞輔助表位，適合的表位插入位置以及適合純化方法都成為 TNF-α自體疫苗研究的關鍵性問題。針對以上問題，我們在前期的工作中以小鼠為模型，針對小鼠的TNF-α分子篩選了外源T細胞輔助表位的在小鼠TNF- α分子中的插入位置，并且篩選比對了不同的T細胞輔助表位。結果發現小鼠TNF-α分子128-140位氨基酸為最佳的外源分子的插入位置， PADRE為最為有效的插入表位。針對以上研究基礎，本發明主要針對其對應的人TNF-α分子的自體疫苗進行構建、表達、純化研究，旨在獲得一種有效的針對人TNF-α分子的自體疫苗。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種制備人TNF-α自體疫苗分子的方法，此分子能夠誘導出針對人TNF-α分子的特異性抗體，為TNF-α表達過高的相關疾病提供一種新的治療藥物。為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是一種體內誘導出針對人 TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法，其特征在于，將融合基因(TNF-ai_⑽一 PADRE-TNF-α 142_157)克隆入原核表達載體ρΕΤ2^的Nde I和Ml I多克隆位點之間，將獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21，誘導后表達產物為包涵體，經包涵體洗滌，凝膠過濾柱層析，透析復性，即可獲得純化的目的融合蛋白，將該一種體內誘導出針對人TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗，在不使用佐劑的情況下免疫小鼠可產生高滴度抗人TNF-α自身抗體，其中所述融合基因序列為5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA
GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’其基因的構建按以下步驟完成根據人TNF- α氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列(AKFVAAWTLKA)，設計 hTNF-PADRE基因序列，基因序列中PADRE的插入位點為TNF-α的1 位后面，即用PADRE 編碼序列取代人TNF129_141位氨基酸的編碼序列；其中TNF- α的1-1 位氨基酸編碼序列通過PCR擴增獲得，并且在上游引入Nde I酶切位點(CATATG)，其中含有翻譯起始密碼子；下游引入Mim I酶切位點(CAATTG)；人工合成PADRE-TNF- α 142_157的編碼序列，上下游分別引入Mun I和Sal I (GTCGAC)酶切位點， 另外在合成片段中將基因進行了兩個點突變(Τ439 — A、C440 — G)；兩段基因通過Mun I酶切位點進行連接，融合基因克隆入載體pET22b的Nde I和 Sal I酶切位點之間；
將上述表達載體轉化大腸桿菌BL21，測序正確的質粒命名為pET22b-hTNF_PADRE， 工程菌命名為pET2^-hTNF-PADRE/BL21 ；其所述基因序列如下5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAANde ICCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGMun IPADREAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’。突變位點Sal I所述基因構建的工程菌的蛋白表達，按以下步驟完成挑取工程菌單菌落接種于 5mL新鮮LB培養基中，所述的LB培養液含Ampl00mg/L，37°C搖床培養過夜，次日以1 100 的比例再次轉接到LB培養液中，在37°C搖床培養3h，至對數生長中期0D_為0. 4 0. 6， 加入ImM IPTG誘導，繼續培養4h，離心收集菌體。所表達的融合蛋白的純化復性，按以下步驟完成取含pET22b-hTNF-PADRE重組質粒的菌株大量誘導菌液，5000rpm離心lOmin，收菌，超聲裂菌；4°C，12000rpm，離心20min，分別收集上清液和沉淀；取IOg發酵菌體，按Ig濕重對7ml的比例，將菌體徹底重懸于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2 懸進行裂解；加入1. 5M NaCI,2% Triton X_100、20mM EDTA至初體積3倍，室溫洗滌30min， 離心后再分別用 3 倍體積的 4M Urea, 2 % Triton X-100,20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍體積的20mM EDTA，0. IM Tris洗滌；經洗滌的包涵體以Ig濕重對IOml的比例，溶于 50mmol/LTris. Cl pH 7. 0,5mmol/L β -巰基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L 鹽酸胍的緩沖液中，4°C攪拌過夜，12000r/min離心30min,收集上清，即為目的蛋白粗提液；Sephacryl S-100 (1.6cmX 100cm)凝膠層析，以工作液(7mol/L 鹽酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7.0， lmmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫， 流速lml/min，分部收集，測定蛋白質含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分；將純化目的蛋白組分對尿素進行梯度透析復性，梯度為，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干；HPLC檢測復性后蛋白純度。所述方法獲取的融合蛋白，在不使用佐劑的情況下免疫小鼠可產生高滴度抗人 TNF-α自身中和性多克隆抗體。該抗體對于II型膠原誘導的類風濕性關節炎、LPS誘導的惡液質等小鼠模型具有良好的保護和治療作用。該疫苗產生的抗體有望用于預防和治療類風濕性關節炎和惡液質等。構建一種hTNF-α自體蛋白疫苗，其特征在于，制得的該疫苗含有hTNF_ α全序列，其中1四-141位氨基酸的編碼序列被增強疫苗免疫原性的TT83ch844 (QYIKANSKFIGITEL)、 HEL46_61 (NTDGSTDYGILQ INSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)等 T 輔助細胞表位肽所替換。
該疫苗能誘導機體產生高滴度的hTNF-α特異性的抗體，該抗血清在體外可以中和人TNF-α對細胞的殺傷作用。可以誘發高滴度抗人TNF-α自身抗體，為TNF-α 表達過高的相關疾病的免疫治療提供一種新的蛋白質藥物。上述hTNF-α自體多肽疫苗的制備方法，其特征在于，根據計算機軟件輔助和hTNF-α截短體表達分析hTNF-α的表位肽結構域，最終以人TNF-α為模板，擴增 TNF- α ^128 位氨基酸的編碼序列；人工合成 TT83Q_844-、HEL46_61_、PADRE-和 TNF-α 142_157 基因片段，擴增片段和合成片段之間通過引入Mim I (使得TNF-α的129-141位氨基酸被 PADRE等替代之外沒有引入任何外源氨基酸)酶切位點進行連接并克隆入原核表達載體 pET22b的Nde I和Ml I多克隆位點之間。由于野生型基因不表達，所以我們通過分析轉錄后mRNA的二級結構，引入了一個同義突變(兩個點突變)，使得原本不表達的目的基因的表達水平可高至菌體總蛋白的20%。表達產物為包涵體，經包涵體洗滌，凝膠柱層析，透析復性和純化，即可獲得純化的目的蛋白PADRE-hTNF- α，該疫苗能誘導機體產生高滴度的 hTNF-α特異性的抗體，該抗體可以中和天然hTNF-a對于細胞的殺傷活性，當用于動物時對于惡液質以及類風濕性關節炎小鼠模型具有良好的保護作用。制備的具體內容是(以h TNF-PADRE為例)1.合成 TNF- a ^128-PADRE-TNf- a 142_157 基因序列其氨基酸序列為VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQG CPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEK⑶RLSAEINRPDYLDF AESGQVYFGIIAL按照Gene-bank公布的hTNF- α的基因序列，5，端插入Nde I酶切位點，3，端并插入Mim I酶切位點，依據大腸桿菌偏愛的密碼子，合成引物擴增獲得目的基因hTNF-α H28155 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTG-3，合成PADRE-TNF- α 142_157的基因序列如下(兩端分別加入Mun I和Ml I酶切位點)，3’端引進終止密碼子TGA:5' -AATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGTCT
GGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAG-3’同時合成T細胞輔助表位PADRE的基因序列并在兩端引入EcoR I和BamHI酶切位點，在5’端引入起始密碼子ATG。合成的序列如下2.構建重組質粒 pET22b-PADRE_TNF-α以Nde I和Ml I兩個限制性內切酶消化pET22b載體，1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切大片段，并與經過Nde I和Mim I酶切的hTNF-α H28PCR產物以及合成 PADRE-TNF- α 142_157的退火產物進行連接，Τ4連接酶在16°C連接過夜，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，鋪板、培養，挑取單克隆，進行酶切鑒定。得到含有目的基因片斷的陽性克隆，稱為 pET22b-TPT。3.重組蛋白的誘導表達、純化與鑒定3. lpET-22b-PADRE-TNF- α /BL21 工程菌的誘導表達挑取工程菌單菌落接種于5mL LB培養液(含Ampl00mg/L)中，37°C搖床培養過夜， 次日以1 100的比例轉接到含Amp的LB培養液中，在37°C搖床培養池至對數生長中期 (OD600為0. 4 0. 6)，加入ImM IPTG誘導表達后分別lh、2h、3h、4h、5h、6h收集菌體，以確定合適的誘導后時間，小規模培養及誘導后離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和存在形式。3. 2pET-22b-PADRE-TNF- α /BL21 工程菌的發酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，37°C培養10h，然后轉種至含200ml LB的三角瓶中，37°C培養過夜。次日，將種子液接種于5L發酵罐。控制發酵溫度 37°C、轉速250 450rpm/min、通氣量3 5L/min、ρΗ7· 3。培養至OD600 = 8左右時，加入 3mM IPTG進行誘導，繼續培養4h，終止發酵，收集菌體、稱重，-20°C冰箱保存備用。取少量菌體處理后，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。3. 3目的蛋白包涵體的分離和洗滌取IOg發酵菌體，按Ig濕重對7ml的比例，將菌體徹底重懸于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2 懸進行裂解；加入1. 5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初體積3倍，室溫洗滌30min，離心后再分別用3倍體積的4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和8倍體積的 20mM EDTA，0. IM Tris洗滌。離心后的包涵體用7M鹽酸胍進行溶解(加入20mM的β -巰基乙醇)。最終的包涵體通過kphacryl-100凝膠過濾層析進行純化，純化后的蛋白質進行尿素梯度離心復性已獲得天然結構，從而可誘導高親和力的中和抗體。3. 4表達產物變性條件下的純化和復性經洗滌的包涵體以Ig濕重對IOml的比例，溶于5(toimol/L Tris. Cl pH 7.0， 5mmol/L3 -巰基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L鹽酸胍的緩沖液中，4°C攪拌過夜，12000r/min 離心30min,收集上清，即為目的蛋白粗提液。S印hacrylS-100 (1. 6cmX 100cm)凝膠層析， 以工作液(7mol/L 鹽酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，分部收集，測定蛋白質含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分。將純化目的蛋白組分對尿素進行梯度透析復性，梯度為，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干。HPLC檢測復性后蛋白純度。3. 5重組蛋白的鑒定3. 5. 1免疫原性及純度的鑒定純化的蛋白樣品經15% SDS-PAGE，然后從凝膠電轉移至硝酸纖維膜，BSA封閉后， 用一抗(小鼠抗人TNF-α單克隆抗體)結合lh，二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP)結合30min， 最后用ECL系統顯色，蒸餾水沖洗終止反應。結果顯示hTNF-TT，hTNF-HEL, hTNF-PADRE可以特異的和小鼠抗人TNF-α單克隆抗體結合。純化得到的TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE進行純度鑒定。色譜柱為排阻色譜柱(7. 5mmX 300mm G2000SW column (TOSOH))，流動相液為 PBS，流速為 0. 5ml/min，檢測波長為 ^Onm。結果純度均大于95%。3. 5. 2殘留天然TNF- α細胞殺傷活性實驗將生長狀態良好的小鼠細胞調至106/ml的細胞懸液，96孔培養板中每孔加入ΙΟΟμ 1細胞懸液，50ml/lC02、37°C培養過夜，棄上清，每孔加入系列稀釋的復性后的 TNF-TT,5% C02、37°C培養16h，棄上清，每孔加入30 μ L的濃度為500 μ g/mL結晶紫染色 3-5min,用流水小心沖去結晶紫，甩干殘余水分，每孔加入脫色液100 μ L，酶標儀570nm處測定吸光值。人TNF-α作為陽性對照，純化的GST蛋白作為陰性對照。結果顯示TNF-TT、 TNF-HEL, TNF-PADRE均無天然人TNF- α的細胞毒性。3. 5. 3動物免疫3. 5. 3. IBalb/c小鼠分組與免疫方案分組將25只雄性Balb/c小鼠分成5組，分別為佐劑組，hTNF組，hTNF-TT組， hTNF-HEL組和hTNF-PADRE組。在第4次免疫后10天摘眼球采血，測定血清中hTNF抗體效價。免疫方案背部皮下多點注射；30 μ g抗原/只；第1次使用完全佐劑，第2、3次和第4 次使用不完全佐劑，佐劑溶液總體積為200 μ L/只，分別隔周注射。3. 5. 3. 2 抗血清 ELISA 鑒定在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測定血清抗hTNF抗體效價。3. 5. 4TNF-PADRE對TNF- α誘導的惡病質模型的治療3. 5.4. 1分組并免疫小鼠Balb/c小鼠，雄性，共30只，體重18_20g，按體重隨機分兩組，每10只一組，組間體重統計學無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50 μ g/ml，200 μ 1/只。B 組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液體積為 200 μ 1/只，分別隔周注射。3. 5.4. 2模型的誘導免疫的小鼠按體重每組各取5只，體重27_28g，組間體重無統計學差異，每天腹腔注射小鼠TNF- α 1 X IO5IU/只，每天稱量小鼠體重。免疫的小鼠按體重每組各取10只，體重27-30g，組間體重無統計學差異，每天腹腔注射小鼠TNF- α 2 X IO5IU/只，統計小鼠的生存期。3. 5. 5TNF-PADRE對II型膠原誘導的類風濕性關節炎小鼠模型的治療3. 5.5. 1誘導劑的制備將II型膠原溶于0. IM醋酸制成^^/!!^的溶液，與等體積的完全弗氏佐劑(弗氏不完全佐劑加入終濃度ang/mL的卡介苗)混合后以注射器反復推吸乳化，配制成II型膠原終濃度為ang/mL的乳劑。3. 5. 5. 2動物的免疫從上海斯萊克動物中心購買5周齡的DBA-I近交系小鼠40只，隨機分為四組， 每組10只。第一組免疫方法為皮下多點免疫，免疫劑量為100 μ L生理鹽水/只，隔周免疫一次，共免疫四次。第二組免疫方法與第一組相同。第三組免疫方法為皮下多點免疫 hTNF-PADRE，免疫劑量為50ug/只。第四組為模型誘導當日免疫用于研究疫苗的治療效果。隔周免疫一次，共免疫四次。3. 5. 5. 3模型的誘導和治療免疫后10天，第一組小鼠每只尾根部皮內注射100 μ L生理鹽水；其余三組小鼠每只尾根部皮內注射100 μ L誘導劑。誘導21天后第一組小鼠每只尾根部皮內再次注射50 μ L 生理鹽水；其余三組小鼠每只尾根部皮內再次注射50 μ L相同的誘導劑。小鼠發病率統計第二次誘導后次日即開始統計II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的發病率。結果如圖8所示，與對照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的發病率。小鼠關節炎病變評分標準第二次誘導后次日即開始開始觀察前后足腫脹程度并評分，以每只鼠前后關節病變評分為急性關節炎分數。關節炎指數(arthritis index,Al) 評分標準如下0分-無紅腫；1分-關節稍腫；2分-關節輕度紅、腫、熱；3分-關節中度紅、腫、熱，輕度功能障礙；4分-關節重度紅、腫、熱，嚴重功能障礙，無法負重，晚期畸形。 累積4個踝關節的得分即為每只小鼠的關節評分。雙尾T檢驗檢驗組間差異。結果如圖8 所示，與對照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的小鼠關節炎病變評分。4.本發明的效果經實驗證實本發明的效果如下(1)篩選并構建了人TNF-PADRE融合蛋白疫苗。(2)該疫苗保持了 TNF的免疫原性，去除了 TNF的天然生物活性。(3)獲得了該疫苗的純化工藝。(4)通過動物實驗證實該融合蛋白能夠在小鼠體內誘導出高滴度抗體。(5)初步證明了該蛋白作為腫瘤疫苗可在一定程度上可以減輕TNF誘導的惡病質小鼠模型的癥狀，減輕二型膠原誘導的類風濕性關節炎小鼠的癥狀。


圖Ia是天然TNF的mRNA結構(部分復雜結構進行了放大)。圖Ib是引入兩個點突變優化后的mRNA結構。圖加是PADRE_hTNF142_157基因合成，其中，“ 1，，是克隆載體酶切圖，其中的小片段為目的序列，“ 2 ”是DNAMarker。圖沘是MNF1M8擴增圖，其中，“ 1 ”是DL2000DNA marker，“ 2 ”是陰性對照，“ 3 ”是
MNF1^8陽性擴增條帶(箭頭所示)。圖3是pET22b-hTNF-TT/HEL/PADRE表達載體質粒酶切圖，其中，“1”是 DL2000DNAmarker, “2” “4” 是 pET22b-hTNF_TT/HEL/PADRE 質粒 Nde I 和I 酶切結^ ο圖 4 是 pET22b-hTNF-TT/BL21， pET22b-hTNF_HEL/BL21 和 pET22b_hTNF_PADRE/ BL21誘導表達結果，其中，“ 1 ”、“ 3 ”、“ 5 ”是未誘導菌體總蛋白，“ 2 ”、“ 4 ”是pET22b_hTNF_TT/ BL21 和 pET22b-hTNF-HEL/BL21 誘導，“6” “8” 是 pET22b_hTNF_PADRE/BL21 誘導 1 3 小時。圖5是hTNF-PADRE的純化結果，其中，“1”、“3”、“5”泳道為包涵體洗滌以后的結果，“ 2 ”、“ 4 ”、“ 6 ”泳道為純化后結果。圖 6 是 hTNF-TT、hTNF-HEL、hTNF-PADRE 純化蛋白的 Western-blot 鑒定，其中，“Μ，， 是蛋白質標準分子量marker，“ 1 ”、“2”、“3”是hTNF_TT/HEL/PADRE誘導后菌體總蛋白。圖7是hTNF-TT、hTNF-HEL、hTNF-PADRE的殘存天然生物活性鑒定。圖8是hTNF-PADRE對惡液質模型小鼠的保護作用。圖9是hTNF-PADRE自體疫苗分子對二型膠原誘導的類風濕性關節炎小鼠的保護作用，其中，TNF-PADRE1為疫苗提前免疫的預防RA的效果，TNF-PADRE2是在誘導RA模型后給予疫苗的治療效果。以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細描述。
具體實施例方式依照本發明的技術方案制備的人TNF治療性自體疫苗，用編碼 TT830-S44 (QYIKANSKFIGITEL), HEL46^61 (NTDGSTDYGILQINSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替換人TNF-α 129位至141位氨基酸的核酸序列，從而獲得hTNF_TT、hTNF_HEL、 hTNF-PADRE融合蛋白，純化后免疫小鼠，比較這三種分子誘導針對hTNF- α抗體的滴度和中和hTNF- α活性的能力，篩選出hTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用hTNF-PADRE重組蛋白免疫小鼠不僅可以減少天然TNF-α誘導的惡病質小鼠體重的減輕，同時還可以延長 mTNF-α誘導的惡病質小鼠的生存期；延長LPS誘導的急性肺損傷小鼠的生存期；減輕II 型膠原誘導的類風濕性關節炎的癥狀。其次重組人TNF-PADRE融合蛋白從而有可能在人體內產生抗人TNF-a自身抗體，為TNF-a表達過高的相關疾病的免疫治療提供一種新的蛋白質藥物。實現本發明疫苗的篩選，疫苗構建和純化，免疫動物，抗體檢定以及動物實驗工作，按以下步驟完成1.疫苗的制備和篩選我們在前期的工作中以小鼠為模型，針對小鼠的TNF- α分子篩選了外源T細胞輔助表位的在小鼠TNF-α分子中的插入位置，并且篩選比對了不同的T細胞輔助表位。結果發現小鼠TNF-a分子128-141位氨基酸為最佳的外源分子的插入位置，PADRE 為最為有效的插入表位。針對以上研究基礎我們用編碼TT83ch844 (QYIKANSKFIGITEL)， HEL46^61 (NTDGSTDYGILQINSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替換人 TNF-a 129 位至141位氨基酸的核酸序列，并在人TNF基因的439、440位引入兩個點突變(圖Ia是天然TNF的mRNA結構，圖Ib是引入兩個點突變優化后的mRNA結構)，從而獲得hTNF-TT、 hTNF-HEL、hTNF-PADRE融合蛋白，具體方法如下1. lpET22b-TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE/BL21 工程菌的構建1. 1. 1TNF-TT, TNF-HEL, TNF-PADRE 基因的擴增和合成根據計算機軟件輔助和hTNF- α截短體表達分析hTNF- α的表位肽結構域，最終以人TNF- α為模板，擴增TNF- a ^128位氨基酸的編碼序列；人工合成TT83(1_844_、HEL46_61_、 PADRE-(替代TNF-a 129_141)和TNF-a 142_157基因片段，擴增片段和合成片段之間引入Mim I 酶切位點(使得TNF-α的129-141位氨基酸被PADRE等替代之外沒有引入任何外源氨基酸)。最后獲得的重組疫苗融合基因(TNF-a H28-PADRE-TNF-α 142_157)克隆入原核表達載體pET22b的Nde I和Ml I多克隆位點之間。由于野生型基因轉錄后的mRNA 二級結構比較復雜，不利于重組疫苗的表達，所以我們通過分析轉錄后mRNA的二級結構，引入了一個同義突變(兩個點突變1^439 — A、C440 — G)，使得目的基因的mRNA結構更趨于簡化和低能量狀態(圖Ia是天然TNF的mRNA結構，圖Ib是引入兩個點突變優化后的mRNA結構)。 基因序列見1. 1.4。1. 1. 2BL21感受態細胞的制備取BL21甘油菌種按1 100的比例接種入的LB培養基中，37 °C振蕩培養過夜，次日轉接一次，繼續培養至0D_約0. 4左右。(無菌操作)將菌液冰浴lOmin，離心 (3000rpmX5min,4°C )后棄去上清，加入1/2體積預冷的IOOmmol/L CaCl2，輕輕吹起沉淀，冰浴40min，離心(3000rpmX5min，4°C )，棄上清后加入1/25體積的含25%甘油的 IOOmmol/L CaCl2，吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，_70°C保存備用。1. 1. 3感受態細胞的轉化、培養將大腸桿菌感受態細胞從-70°C中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有目的基因的pET22b，輕微混勻，繼續冰浴30min，然后42°C熱休克45s，最后再冰浴5min。然后鋪板， 37 °C培養過夜。1. 1.4質粒的提取和鑒定在質粒轉化后37°C過夜培養的培養皿上挑取邊緣整齊，生長狀態良好的克隆，接種到IOml含Amp的LB培養基中，37°C、200rpm培養他，用質粒提取試劑盒提取質粒，用Nde I和Mi I雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有插入片斷以及插入的片斷是否與預期的長度一致(圖2a、圖2b是質粒的構建，為了獲得目的蛋白hTNF-PADRE，首先按照大腸桿菌偏愛密碼子合成PADRE與hTNF142_156位氨基酸的編碼序列 < 圖加>，然后合成引物擴增 MWV128位氨基酸的編碼序列 < 圖2b> ；兩個片段克隆入pET22b載體獲得重組疫苗的表達質粒。圖3是原核非融合表達質粒pET22b-hTNF-PADRE的酶切圖譜。圖2a、圖2b中的兩個片段與經過Nde I和Ml I酶切的pET22b載體連接，轉化BL21感受態細胞后挑取陽性克隆提取質粒。重組質粒經限制性內切酶Nde I和Ml I酶切鑒定，得到相應的片斷與預期大小相一致)，將酶切鑒定陽性的克隆送上海博亞公司進行DNA測序。相應的陽性工程菌分別命名為 pET22b-hTNF-TT/BL21，pET22b-hTNF_HEL/BL21 和 pET22b_hTNF_PADRE/BL21。全長人TNF-TT的基因序列(劃線部分為TT表位的核酸序列，加粗部分分別為 NdeI、Mun I禾口 Nde I酶切位點)5’ -CATATGTGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTCGAACTTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’全長人TNF-HEL的基因序列為(劃線部分為HEL表位的核酸序列，加粗部分分別為Nde I、Mun I和Nde I酶切位點)
5，-CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGAACACTGACGGTTCCACCGATTACGGCATTCTGCAGATCAACTCCCGCCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’全長人TNF-PADRE的基因序列為(劃線部分為PADRE表位的核酸序列，加粗部分分別為Nde I、Mun I和Nde I酶切位點)5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’1.2重組疫苗蛋白表達、純化和鑒定1. 2. lpET-22b-PADRE-hTNF α /BL21 工程菌的誘導表達含重組表達質粒的大腸桿菌BL21單菌落接種于5ml新鮮LB培養液(含氨芐青霉素100mg/L)中，搖床37°C培養過夜，次日以1 100的比例接種于新鮮LB培養液(含氨芐青霉素100mg/L)中，37°C繼續培養至細菌密度達到OD6tltl = 0. 4 0. 6，加入ImMIPTG，誘導表達后分別lh、au3h、4h收集菌體，以確定合適的誘導時間，小規模培養及誘導后離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和存在形式，結果表明在理論分子量位置有新生蛋白質條帶(圖4)。1. 2. 2pET-22b-PADRE-hTNF α /BL21 工程菌的發酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，37°C培養10h，然后轉種至含200ml LB的三角瓶中，37°C培養過夜。次日，將種子液接種于5L發酵罐?？刂瓢l酵溫度 37°C、轉速250 450rpm/min、通氣量3 5L/min、ρΗ7· 3。培養至OD600 = 8左右時，加入 ImM IPTG進行誘導，繼續培養4h，終止發酵，收集菌體、稱重、-20°C冰箱保存備用。取少量菌體處理后，用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。結果表明蛋白質以包涵體形式表達。1.2.3重組包涵體蛋白的純化和復性取IOg發酵菌體，按Ig濕重對7ml的比例，將菌體徹底重懸于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2;!:進行裂解；加入1.5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初體積3倍，室溫洗滌30min，離心后再分別用 3 倍體積的 4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍體積的 20mM EDTA，0. IM Tris洗滌。經洗滌的包涵體以Ig濕重對IOml的比例，溶于50mmol/LTris. Cl pH 7.0,5mmol/L β -巰基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L鹽酸胍的緩沖液中，4°C攪拌過夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液。S印hacryl S-100 (1. 6cmX 100cm) 凝膠層析，以工作液(7mol/L鹽酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，分部收集，測定蛋白質含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分。將純化目的蛋白組分對尿素進行梯度透析復性，梯度為，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干。SDS-PAGE和HPLC檢測復性后蛋白純度(圖5)。2.重組蛋白質的鑒定2. 1免疫原性(Western blot)及純度(HPLC)的鑒定純化的蛋白樣品經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后拆下凝膠，按照 Bio-Rad產品說明，將凝膠靠近陰極一側、PVDF膜靠近陽極一側，在預冷的轉移緩沖液 (25mmol/L Tris-HCl, 192mmol/L Glycine，20% 甲醇)中 100V 恒壓轉移 lh，將蛋白轉移至 PVDF 膜上。轉移結束后，取出 PVDF 膜，洗滌液 TBSTQOmmol/L Tris .HCl pH7. 5,150mmol/ LNaCl,0. 05% Tween20)清洗后浸入封閉液(含2% BSA的TBST)中室溫孵育lh。用一抗 (小鼠抗人TNF-α單克隆抗體，1 5000稀釋)室溫孵育lh，TBST洗膜3次，每次5min;再以二抗(山羊抗小鼠IgG_HRP，l 2000稀釋)室溫孵育30min，TBST洗膜3次，每次5min， TBS (不含有Tween20)洗膜3次，每次5min。最后用ECL系統顯色，蒸餾水沖洗終止反應。 結果顯示hTNF-TT，hTNF-HEL, hTNF-PADRE可以特異的和小鼠抗人TNF- α單克隆抗體結合 (圖 6)。對純化得到的TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE進行純度鑒定。色譜柱為排阻色譜柱 (7. 5mmX 300mm G2000SW column (TOSOH)),流動相為 PBS，流速為 0. 5ml/min,檢測波長為 ^Onm。結果純度均大于95%。2. 2殘留天然TNF- α細胞殺傷活性實驗將生長狀態良好的小鼠細胞調至106/ml的細胞懸液，96孔培養板中每孔加入100μ 1細胞懸液，50ml/lC02、37°C培養過夜，棄上清，每孔加入系列稀釋的復性后的 TNF-TT,5% C02、37°C培養16h，棄上清，每孔加入30 μ L的濃度為500 μ g/mL結晶紫染色 3-5min,用流水小心沖去結晶紫，甩干殘余水分，每孔加入脫色液100 μ L，酶標儀570nm處測定吸光值。人TNF-α作為陽性對照，純化的GST蛋白作為陰性對照。結果顯示TNF-TT、 TNF-HEL, TNF-PADRE均無天然人TNF- α的細胞毒性(圖7)。3.動物免疫3. IBalb/c小鼠分組與免疫方案及抗血清ELISA鑒定分組將25只雄性Balb/c小鼠分成5組，分別為佐劑組，hTNF組，hTNF-TT組， hTNF-HEL組和hTNF-PADRE組。在第4次免疫后10天摘眼球采血，測定血清中hTNF抗體效價。免疫方案背部皮下多點注射；30 μ g抗原/只；第1次使用完全佐劑，第2、3次和第4 次使用不完全佐劑，佐劑溶液總體積為200 μ L/只，分別隔周注射。在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測定血清抗hTNF抗體效價。所需溶液的配制包被緩沖液碳酸鹽緩沖液Na2CO3 0. 32g (終濃度 0. 015mol/L)
NaHCO3 0. 59g (終濃度 0. 035mol/L)純水定容至200ml (pH 9. 6) 有效期兩周
洗滌液含 0. 05 % Tween-20 的 PBS (pH 7. 4)封閉液含1 % BSA的洗滌液稀釋液含0. 5 % BSA的洗滌液底物緩沖液Nei2HP04.12H20 1. 84g檸檬酸0. 51g純水定容至 100ml (pH 5. 0)底物顯色液0PD8mg30% H2O230 U 1底物緩沖液IOml終止液^2SO4lmol/L操作方法包被取96孔ELISA板，將抗原溶解于包被緩沖液中U g/ml)，加入板孔中 (IOOiil/孔)，4°C包被過夜。ヰ倒掉包被液，加入封閉液，37°C封閉池；ヰ棄去封閉液，用洗 滌液洗6次，毎次aiiin ；ヰ加入10倍倍比稀釋的抗血清(從100倍起)，100 ii 1/孔，37°C孵 Ih ；ヰ棄去抗血清，用洗滌液洗6次，毎次aiiin ；ヰ加入HRP標記的抗小鼠的ニ抗，100 U 1/ 孔，37°C孵育Ih ；ヰ棄去ニ抗，用洗滌液洗6次，毎次aiiin;ヰ加入底物顯色液，IOOiU/ 孔，37°C，顯色10-20min ；—加入終止液，100 yl/孔，終止反應廣酶標儀讀數，測定每孔在 490nm的吸光值。3. 2TNF-PADRE對TNF- a誘導的惡病質模型的治療3. 2.1分組并免疫小鼠Balb/c小鼠，雄性，共30只，體重18_20g，按體重隨機分兩組，每10只一組，組間 體重統計學無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50 u g/ml，200 U 1/只。B 組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液體積為 200 iil/只，分別隔周注射。3. 2. 2模型的誘導免疫的小鼠按體重每組各取5只，體重27_28g，組間體重無統計學差異，每天腹腔 注射小鼠TNF- a 1 X IO5IU/只，每天稱量小鼠體重。免疫的小鼠按體重每組各取10只，體重27_30g，組間體重無統計學差異，每天腹 腔注射小鼠TNF-a2X105IU/只，統計小鼠的生存期(圖8)，與生理鹽水組相比較，該重組 疫苗對于TNF誘導的DBA小鼠的惡液質模型具有顯著的保護作用。小鼠的體重沒有顯著性 變化(陰性對照組體重減輕)；生存率明顯優于生理鹽水組。3. 3TNF-PADRE對II型膠原誘導的類風濕性關節炎小鼠模型的治療3. 3. 1誘導劑的制備將II型膠原溶于0. IM醋酸制成％ig/mL的溶液，與等體積的完全弗氏佐劑(弗氏 不完全佐劑加入終濃度ang/mL的卡介苗)混合后以注射器反復推吸乳化，配制成II型膠 原終濃度為ang/mL的乳剤。3. 3. 2動物的免疫
從上海斯萊克動物中心購買5周齡的DBA-I近交系小鼠40只，隨機分為四組， 每組10只。第一組免疫方法為皮下多點免疫，免疫劑量為100 μ L生理鹽水/只，隔周免疫一次，共免疫四次。第二組免疫方法與第一組相同。第三組免疫方法為皮下多點免疫 hTNF-PADRE，免疫劑量為50ug/只。第四組為模型誘導當日免疫用于研究疫苗的治療效果。 隔周免疫一次，共免疫四次。3. 3. 3模型的誘導和治療免疫后10天，第一組小鼠每只尾根部皮內注射100 μ L生理鹽水；其余三組小鼠每只尾根部皮內注射100 μ L誘導劑。誘導21天后第一組小鼠每只尾根部皮內再次注射50 μ L 生理鹽水；其余三組小鼠每只尾根部皮內再次注射50 μ L相同的誘導劑。小鼠發病率統計第二次誘導后次日即開始統計II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的發病率。結果如圖9所示，與對照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的發病率。小鼠關節炎病變評分標準第二次誘導后次日即開始觀察前后足腫脹程度并評分 (圖9)，以每只鼠前后關節病變評分為急性關節炎分數。關節炎指數(arthritis index, Al)評分標準如下0分-無紅腫；1分-關節稍腫；2分-關節輕度紅、腫、熱；3分-關節中度紅、腫、熱，輕度功能障礙；4分-關節重度紅、腫、熱，嚴重功能障礙，無法負重，晚期畸形。 累積4個踝關節的得分即為每只小鼠的關節評分。雙尾T檢驗檢驗組間差異。結果如圖9 所示，與對照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導的小鼠類風濕關節炎的小鼠關節炎病變評分。
權利要求
1.一種體內誘導出針對人TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法，其特征在于，將融合基因(TNF- α H28-PADRE-TNf- α 142_157)克隆入原核表達載體pET22b的Nde I和 Sal I多克隆位點之間，將獲得的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21，誘導后表達產物為包涵體，經包涵體洗滌，凝膠過濾柱層析，透析復性，即可獲得純化的目的融合蛋白，將該一種體內誘導出針對人TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗，在不使用佐劑的情況下免疫小鼠可產生高滴度抗人TNF-α自身抗體，其中所述融合基因序列為5’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGGTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其基因的構建按以下步驟完成根據人TNF- α氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列(AKFVAAWTLKA)，設計hTNF-PADRE基因序列，基因序列中PADRE的插入位點為TNF-α的1 位后面，即用PADRE編碼序列取代人TNF129_141位氨基酸的編碼序列；其中TNF-α的1-1 位氨基酸編碼序列通過PCR擴增獲得，并且在上游引入Nde I酶切位點(CATATG)，其中含有翻譯起始密碼子；下游引入Mim I酶切位點(CAATTG)；人工合成PADRE-TNF- α 142_157的編碼序列，上下游分別引入Mun I和Sal I (GTCGAC)酶切位點，另外在合成片段中將基因進行了兩個點突變(Τ439 — A、C440 — G)；兩段基因通過Mun I酶切位點進行連接，融合基因克隆入載體pET22b的Nde I和Sal I酶切位點之間；將上述表達載體轉化大腸桿菌BL21，測序正確的質粒命名為pET22b-hTNF-PADRE，工程菌命名為pET2^-hTNF-PADRE/BL21 ；其所述基因序列如下5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAA Nde ICCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGG CGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAG GTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCA TCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAG MunIPADREAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’。 突變位點Sal I
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，按權利要求2所述基因構建的工程菌的蛋白表達，按以下步驟完成挑取工程菌單菌落接種于5mL新鮮LB培養基中，所述的LB培養液含Ampl00mg/L，37°C搖床培養過夜，次日以1 100的比例再次轉接到LB培養液中，在 37°C搖床培養3h，至對數生長中期OD6tltl為0. 4 0. 6，加入ImM IPTG誘導，繼續培養4h，離心收集菌體。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，按權利要求3所表達的融合蛋白的純化復性，按以下步驟完成取含pET2^-hTNF-PADRE重組質粒的菌株大量誘導菌液，5000rpm離心lOmin，收菌，超聲裂菌；4°C，12000rpm，離心20min，分別收集上清液和沉淀；取IOg發酵菌體，按Ig濕重對7ml的比例，將菌體徹底重懸于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI，20mM MgCl2 懸進行裂解；加入 1. 5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初體積3倍，室溫洗滌30min，離心后再分別用3倍體積的 4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍體積的 20mM EDTA，0. IM iTris洗滌；經洗滌的包涵體以Ig濕重對IOml的比例，溶于50mmol/LTris. Cl pH 7.0， 5mmol/L β -巰基乙醇，lmmol/L EDTA, 7mol/L鹽酸胍的緩沖液中，4°C攪拌過夜，12000r/ min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液；Sephacryl S-100 (1. 6cmX 100cm)凝膠層析，以工作液(7mol/L鹽酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl) 充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，分部收集，測定蛋白質含量，并以SDS-PAGE確定目的蛋白所在位置，收集純度較高的洗脫組分；將純化目的蛋白組分對尿素進行梯度透析復性，梯度為，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干；HPLC檢測復性后蛋白純度。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，按權利要求4所述方法獲取的融合蛋白，在不使用佐劑的情況下免疫小鼠可產生高滴度抗人TNF-α自身中和性多克隆抗體。該抗體對于II型膠原誘導的類風濕性關節炎、LPS誘導的惡液質等小鼠模型具有良好的保護和治療作用。該疫苗產生的抗體有望用于預防和治療類風濕性關節炎和惡液質等。
全文摘要
本發明公開了一種體內誘導出針對人TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構建方法，采用分步克隆方法構建hTNF-TT830-844，hTNF-HEL46-61，hTNF-PADRE的融合基因，并通過在天然人TNF基因中引入點突變(T439→A、C440→G)優化mRNA二級結構，融合基因克隆入pET22b原核表達載體，在大腸桿菌BL21菌株中獲得高效表達。通過計算機輔助分析在hTNF的表位肽結構域之間引入三種T輔助細胞表位肽與hTNF-α融合而克服機體對于自體蛋白的免疫耐受，使得機體發生高水平的體液免疫反應，產生的高水平hTNF-α中和性多克隆抗體在體外可以中和hTNF-α對L929細胞的殺傷活性；其中hTNF-PADRE的免疫原性最強，在不使用免疫佐劑的情況下即可誘發高水平的抗體，該疫苗對于II型膠原誘導的類風濕性關節炎、LPS誘導的惡病質等小鼠模型具有良好的保護和治療作用。
文檔編號A61K39/395GK102370979SQ20111030394
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者萬一, 張英起, 王增祿, 薛曉暢, 趙寧 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學