專利名稱：物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺纖維化藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明藥物新用途技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺部炎癥和肺纖維化藥物中的用途。
背景技術(shù)：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多種組分構(gòu)成的復(fù)雜混合物。新鮮毒液呈蛋清樣粘稠液體，具有特殊的腥味。不同蛇種毒液色澤各異，中華眼鏡蛇蛇毒呈淡黃色。蛇毒的干物質(zhì)中 90%以上是蛋白質(zhì)，是其毒性和生物學(xué)活性的主要成分。中華眼鏡蛇蛇毒成分主要有眼鏡蛇蛇毒因子(1% _2%)、心臟毒素(40%-50%，又名細(xì)胞毒素、膜毒素)、神經(jīng)毒素(10%) 等其它類蛋白質(zhì)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為眼鏡蛇及其毒性成分可通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)濕，并具有強(qiáng)身健體之功效。早在二十世紀(jì)初，人們就開始應(yīng)用蛇毒來緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛， 隨后出現(xiàn)一系列關(guān)于蛇毒有類似嗎啡樣鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道。隨著研究的不斷深入，現(xiàn)在蛇毒及其制品已應(yīng)用于臨床，除了鎮(zhèn)痛作用外，研究發(fā)現(xiàn)在抗風(fēng)濕、抗腫瘤以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面都有很好的療效，但是在治療肺部炎癥和肺纖維化方面的作用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺部炎癥和肺纖維化藥物中的應(yīng)用，提供了一種治療肺部炎癥和肺纖維化的新思路、新方法。需要說明的是物理改性的中華眼鏡蛇蛇毒最好，但是未改性的眼鏡蛇總毒和其中的神經(jīng)毒素、膜毒素和眼鏡蛇毒因子也是有效的。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是本發(fā)明目的是提供一種物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺纖維化和/或急慢性肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性并復(fù)性，加熱溫度在50 100°C之間，加熱時(shí)間為Imin 300min后得到的。優(yōu)選的，所述眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒、泰國眼鏡蛇蛇毒。優(yōu)選的，所述藥物中還包括未改性的中華眼鏡蛇蛇毒或選自未改性的中華眼鏡蛇蛇毒中起主要作用的神經(jīng)毒素、心臟毒素(膜毒素)和眼鏡蛇毒因子。優(yōu)選的，所述藥物的給藥劑型選自口腔速溶藥膜、口服液、片劑、膠囊、噴霧劑、注射劑和透皮吸收制劑。優(yōu)選的，所述藥物是通過物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分一起形成復(fù)方制劑或通過物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成單方制劑。優(yōu)選的，所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒選自物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒或物理改性后的其他眼鏡蛇蛇毒。本發(fā)明中眼鏡蛇蛇毒為眼鏡蛇總毒，將其物理改性后可用于制備治療肺部炎癥和肺纖維化藥物。
優(yōu)選的，所述的眼鏡蛇蛇毒為中華眼鏡蛇總蛇毒，根據(jù)成份和藥效的相同性，所述蛇毒還包括其他眼鏡蛇蛇毒。所述藥物可以制備成選自以下的劑型口腔速溶藥膜、口服液、膠囊、片劑、噴霧劑、注射劑和經(jīng)皮吸收制劑。當(dāng)然，所述藥物還包括各種單方和復(fù)方制劑。本發(fā)明涉及中華眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺部炎癥和肺纖維化藥物中的用途。本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)物理改性后的中華眼鏡蛇總毒在藥學(xué)上有效劑量(如大鼠10-3000 μ g/ kg，人1 ΙΟΟΟμ g/kg)范圍內(nèi)能減輕炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡損傷，膠原組織增生，局灶性肺不張和肺氣腫等肺纖維化癥狀，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明通過中華眼鏡蛇總毒經(jīng)物理方法處理達(dá)到減毒增效目的，物理處理后的眼鏡蛇毒有抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺部炎癥，并且對于長期反復(fù)給予脂多糖(LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化和博萊霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化均具有顯著的治療作用，其療效超過未經(jīng)處理的眼鏡蛇毒。所述藥物包括口服液、口腔速溶藥膜、膠囊、片劑、噴霧劑、注射劑和經(jīng)皮吸收制劑等，所述藥物還包括各種單方和復(fù)方制劑。本發(fā)明中的眼鏡蛇是人工飼養(yǎng)的眼鏡蛇，在無菌條件下采毒，經(jīng)冷凍干燥成淡黃色粉末，低溫保存。本發(fā)明通過中華眼鏡蛇總毒經(jīng)物理方法處理達(dá)到減毒增效目的。中華眼鏡蛇蛇毒在臨床上已用于治療風(fēng)濕和緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛等，但都用純化的神經(jīng)毒素、多種蛇毒的混合制劑或眼鏡蛇毒和其它中藥的復(fù)方制劑。鑒于中華眼鏡蛇毒毒性比較大，蛇毒中的藥用成分主要是蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和生物活性可以被理化因素改變。 蛇毒在用過氧化氫處理后，二硫鍵被打開，其毒性大大降低，但是鎮(zhèn)痛作用也幾乎消失，提示生物學(xué)活性被破壞。而蛋白質(zhì)加熱后可發(fā)生可逆性變性，變性后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，或部分大分子蛋白質(zhì)因加熱部分分解為小分子量蛋白質(zhì)。小鼠試驗(yàn)證明這種加熱變性并復(fù)性之后的蛇毒毒性明顯減少，而藥效增加。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)加熱變性的中華眼鏡蛇蛇毒對脂多糖引起的急性肺部炎癥以及長期反復(fù)給予脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化和博萊霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化有明顯的改善作用，提示對肺部炎癥和肺纖維化有很好的治療作用。這一發(fā)現(xiàn)，將對肺炎及肺纖維化的研究和藥物開發(fā)產(chǎn)生重大的影響，并有臨床實(shí)用價(jià)值，為中華眼鏡蛇蛇毒開辟臨床新的用途。所述物理改性后的眼鏡蛇總毒是通過將眼鏡蛇總毒在用去離子水溶解的情況下， 加熱溫度為50 100°C之間，時(shí)間在Imin 300min，再自然復(fù)性后得到的。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.采用經(jīng)物理改性的中華眼鏡蛇總毒，毒性低而藥效高。2.中華眼鏡蛇蛇毒不僅能改減輕內(nèi)毒素所致的急性肺部炎癥，而且對長期反復(fù)給予內(nèi)毒素產(chǎn)生的肺纖維化和博萊霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺纖維化有明顯的治療效果。3.中華眼鏡蛇蛇毒不僅能降低肺纖維化小鼠肺系數(shù)，還能有效保護(hù)肺組織，降低肺組織膠原的合成(減少肺組織羥脯氨酸(HYP)的含量)。4.中華眼鏡蛇蛇毒不僅抑制病變小鼠體內(nèi)I κ b- α的降解從而抑制NF- κ B激活、 同時(shí)還能下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子^(TGF-i^)的表達(dá)。5.中華眼鏡蛇蛇毒不僅能降低腫瘤壞死因子- α (TNF-α)水平，還能降低炎癥因子白細(xì)胞介素-I(IL-I)的水平。
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6.中華眼鏡蛇蛇毒用量少，有效范圍大，從10 3000 μ g/kg都有很好的治療肺纖維化的作用。人用劑量約為1 1000 μ g/kg。本發(fā)明公開了中華眼鏡蛇蛇毒在制備治療急性肺部炎炎及肺纖維化藥物中的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)改性中華眼鏡蛇總毒在(10-3000yg/kg)范圍內(nèi)能對急性肺部炎癥和肺纖維化有明顯的治療作用，其能減輕炎性細(xì)胞的浸潤，肺泡損傷，減少膠原增生，顯著減輕肺纖維化的病理改變和肺纖維化的癥狀。眼鏡蛇毒治療肺纖維化具有用量小、安全、可口服、 可注射、可透過口鼻粘膜和經(jīng)皮給藥等優(yōu)點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為改性中華眼鏡蛇蛇毒對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠臟器系數(shù)的影響；圖2為改性中華眼鏡蛇蛇毒對LPS誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠臟器病理學(xué)改變的影響圖3為改性中華眼鏡蛇蛇毒對小鼠血清中IL-I和TNF- α濃度的影響；圖4為改性中華眼鏡蛇蛇毒對急性肺損傷小鼠體內(nèi)I κ Β-α含量的影響；圖5為改性中華眼鏡蛇蛇毒對反復(fù)給予LPS誘導(dǎo)的肺纖維化和博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠臟器系數(shù)的影響圖6為改性中華眼鏡蛇蛇毒對小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響；圖7為改性中華眼鏡蛇蛇毒對各組小鼠體內(nèi)TGF-β i的影響。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例物理改性后的中華眼鏡蛇毒的動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)、脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷實(shí)驗(yàn)脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，可以引起機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥反應(yīng)，單次給予脂多糖5mg/kg可以制作小鼠急性肺損傷模型，將昆明小鼠隨機(jī)分為5組 (n = 10)雌性各半，體重18-22g 生理鹽水對照組、模型組、中華眼鏡蛇蛇毒加熱小劑量組 (30 μ g/kg)、中劑量組(90 μ g/kg)、大劑量組(270 μ g/kg)。在給予脂多糖(5mg/kg)后，觀察動(dòng)物的活動(dòng)狀態(tài)，呼吸頻率。在物理改性后的中華眼鏡蛇蛇毒在治療脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷試驗(yàn)中，實(shí)施例采用灌胃給藥，給藥劑量在10-3000 μ g/kg，一天一次。3小時(shí)后取血，處死動(dòng)物后取肺、肝、脾、胸腺等臟器稱重，離心后得到的血清檢測細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，部分肺組織10%甲醛固定，切片染色，其他用于檢測生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。圖1為改性中華眼鏡蛇蛇毒對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠臟器系數(shù)的影響，其中 *P<0. 05,***P<0.01與正常組比較;#P < 0. 05，###P < 0. 01與模型組比較。從圖1 中，在給予脂多糖誘導(dǎo)炎癥6小時(shí)后，與正常對照組相比，模型組的小鼠肺系數(shù)、肝系數(shù)均有明顯增大，胸腺系數(shù)和脾系數(shù)也有所增加，給藥組臟器系數(shù)均有不同程度減小。
圖2為改性中華眼鏡蛇蛇毒對LPS誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠臟器病理學(xué)改變的影響 (HE染色X400)。從圖2可知1、肺病理切片結(jié)果提示正常對照組小鼠肺表面未見病損灶，切面均質(zhì)，無液體溢出；肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡膈無水腫、炎癥等特殊改變。 LPS模型組小鼠肺組織水腫明顯，可見出血斑點(diǎn)，切面濕潤、有水腫液流出；主要病變?yōu)閺浡苑嗡[、炎癥、出血，可見滲出、間質(zhì)增寬，血管周圍水腫，間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤。蛇毒小、中、大劑量組小鼠上述肺組織病理改變明顯減輕。2、肝病理切片結(jié)果提示正常對照組小鼠肝小葉組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤，肝竇枯否氏細(xì)胞未見增生，肝細(xì)胞未見脂肪性病變。LPS模型組，肝細(xì)胞水腫，胞漿呈空網(wǎng)狀，髓樣變性明顯，均可見肝細(xì)胞索離斷，周圍肝細(xì)胞輕度水腫伴脂肪變性，肝竇缺血性改變，小葉中央周圍或匯管區(qū)見多發(fā)片狀壞死伴淋巴細(xì)胞浸潤。蛇毒小、中、大劑量組均有不同程度的改善。3、脾病理切片結(jié)果提示正常對照組脾小結(jié)大小均勻，中央動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，無明顯異常。LPS模型組脾臟白髓明顯縮小、紅髓擴(kuò)大并充血，同時(shí)脾小體結(jié)構(gòu)不完整，淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少；蛇毒各治療組雖脾小結(jié)大小不一，但白髓區(qū)明顯擴(kuò)大，紅髓血管擴(kuò)張、充血，脾中央小動(dòng)脈周圍淋巴鞘明顯擴(kuò)大，細(xì)胞增多，密度增大，病理損傷得到明顯改善。表1 改性中華眼鏡蛇蛇毒對小鼠血清中IL-I和TNF- α濃度的影響(x±SD)
權(quán)利要求
1.一種物理改性后的眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺纖維化和/或急慢性肺部炎癥的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述物理改性后的眼鏡蛇蛇毒是將眼鏡蛇蛇毒用去離子水溶解后加熱變性，加熱溫度在50 100°C之間，加熱時(shí)間為Imin 300min 后得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述眼鏡蛇蛇毒選自中華眼鏡蛇蛇毒、泰國眼鏡蛇蛇毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中還包括未改性的中華眼鏡蛇蛇毒或選自未改性的中華眼鏡蛇蛇毒中起主要作用的神經(jīng)毒素、心臟毒素(膜毒素)和眼鏡蛇毒因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的給藥劑型選自口腔速溶藥膜、 口服液、片劑、膠囊、噴霧劑、注射劑和透皮吸收制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是通過物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與其他藥物活性成分一起形成復(fù)方制劑或通過物理改性后的眼鏡蛇蛇毒與藥用輔料形成單方制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇蛇毒在制備治療肺部炎癥和肺纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)中華眼鏡蛇毒(10-3000μg/kg)范圍內(nèi)均能減輕急性內(nèi)毒素中毒的癥狀，尤其對內(nèi)毒素引起的肺部炎癥有明顯的治療作用，能減輕炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，局灶性肺不張和肺氣腫。反復(fù)小量內(nèi)毒素可引起肺纖維化，眼鏡蛇毒能顯著減輕肺纖維化癥狀，減少肺泡損傷和膠原蛋白增生。天然和物理改性的中華眼鏡蛇毒具有相似的作用，但是物理改性的中華眼鏡蛇毒作用更好。中華眼鏡蛇治療肺部炎癥具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過口鼻粘膜和透皮給藥等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K35/58GK102526114SQ20111044338
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者崔 奎, 秦正紅 申請人:蘇州人本藥業(yè)有限公司