專利名稱：一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗，屬于生物學領域，特別是獸用生物制品領域。
背景技術：
目前市場流行的鼻炎滅活疫苗主要有兩種類型，包括油佐劑和鋁膠佐劑疫苗。油乳劑滅活疫苗抗體持續時間較長，但是存在不同程度的副反應。鋁膠佐劑滅活疫苗不存在副反應現象，但是抗體效價低，持續時間短。本發明所述的新型佐劑制備的雞傳染性鼻炎滅活疫苗，具有安全性高、無副反應、 抗體產生快以及保護率高等優勢，不但適用于雞群常規免疫，有效預防疫病的發生，并且適用于發病雞群的緊急接種，對控制本病和防止復發有較好的作用。

發明內容
本發明的目的是用以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑，將其用于雞傳染性鼻炎滅活疫苗的生產過程中，使生產的雞傳染性鼻炎滅活疫苗具有安全性高、無副反應、抗體產生快以及保護率高等優勢，既適合于正常預防也適合于發病時的緊急接種，對控制本病和防止復發有較好的作用。實施本發明的技術路線1.本發明所涉及的雞傳染性鼻炎滅活疫苗，含有滅活的副雞嗜血桿菌A型 C-Hpg-8株濃縮菌液，和以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑。雞傳染性鼻炎滅活疫苗的制備方法，按常規方法制備的滅活的副雞嗜血桿菌A型 C-Hpg-8株濃縮菌液，用滅菌PBS稀釋一定比例后與以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑按41比例進行混合并攪拌搖勻制備而成雞傳染性鼻炎滅活疫苗。
具體實施例方式一、疫苗生產檢驗用菌種制造及檢驗用菌種為副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株，由中國獸醫藥品監察所鑒定、 保管和供應。二、疫苗制造1.疫苗制造及半成品檢驗(1)生產用種子制備1) 一級種子繁殖與鑒定取菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在含5% 10% CO2環境中37°C培養16 18小時后，挑選數個熒光性強的典型菌苔(菌落)接種于5日齡雞胚卵黃囊內，在37°C繼續孵育，收集30小時內死亡的雞胚卵黃液，經純檢合格后，作為-級種子。在-20°C以下保存，應不超過1個月，否則要再通過雞胚復壯，但不應超過6 代。
2) 二級種子繁殖取感染的雞胚卵黃液，劃線接種雞肉湯瓊脂乎板，在含5% 10% CO2條件下，37°C培養16 18小時，選熒光性強的典型菌苔(菌落)接種于雞肉湯培養基中，置37°C培養16 20小時，經純檢合格后，即為二級種子。在2 8°C保存，不得超過6 8小時。(2)制苗用培養基為半合成培養基，制造方法見附注4。(3)制苗菌液的制備1)菌液培養將IOOml種子液加入4000ml半合成培養基中，在37°C培養18 20 小時，其間接振培養瓶二次，經純撿確認無雜菌污染，加入0. 05%甲醛溶液，置2 8°C保存。2)制苗菌液的濃縮與滅活用中空纖維超濾器將純檢合格的菌液濃縮，然后再用 PH7. 2的PBS制成懸浮液，使每Iml至少含50億菌體(用生物制品國家標準品“國細菌濁度標準”進行比較，設標準管含副雞嗜血桿菌為觀億/ml)，再按體積比加入0. 15%甲醛溶液和0. 01%的硫柳汞，在2 8°C滅菌7日，經檢驗無菌生長作為制苗抗原。(4)佐劑的配制以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑的配制NaCl 5 IOg (無色立方結晶或白色結晶，上海國藥)，Na2HPO4 1. 5 2g (白色粉末，上海國藥)，KC10. 1 0.5g (無色立方晶體，常為長柱狀，上海國藥)，KH2PO4 0. 1 0.5g (為無色結晶或白色顆粒狀粉末，上海國藥)，卡波姆3 7g (白色疏松狀粉末，北京國人逸康科技有限公司)，去離子水1000ml，溶解后經121°C高壓30min滅菌后備用。常溫保存，不超過15 天。本發明的新型佐劑，其中卡波姆是含有聚烯基聚醚交聯的丙烯酸聚合物，很低的用量下(常規用量0. 25% 0.5%)就能產生高效的增稠作用，常規用量在0. 2% 0.4%， 能替代3% 7%的常規乳化劑，可將雞傳染性鼻炎抗原包裹吸附住，接種后，在雞只體內能緩慢釋放，可使抗體效價高，持續期長。Na2HPO4和KH2PO4可以調節pH，起到緩沖液的作用。NaCl和KCl的主要作用是保持一定的離子濃度，以維持活性。(5)配苗將濃縮鼻炎菌液用滅菌PBS (0. lmol/L, pH 7. 0 7. 2)稀釋一定比例后與新型佐劑按4 1比例進行混合并攪拌搖勻，保證每Iml疫苗中含有10億菌數(用生物制品國家標準品“中國細菌濁度標準”進行比較判定)。三、疫苗檢驗1.無菌檢驗按《規程》進行，無菌生長。2.安全檢驗用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗lml，觀察14日， 應無異常反應。3.效力檢驗用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1個月后，連同條件相同的對照雞4只，各眶下竇內注射C-HpS-S菌株雞肉湯16小時培養物 0. 2ml (50 100萬活菌)，觀察14日，對照雞全部發病(面部出現一側或兩例眶下竇及周圍腫脹并有流鼻涕或兼有流淚者)，免疫雞至少保護6只，或對照雞3只發病，免疫雞至少保護7只為合格。4.甲醛、硫柳汞含量測定分別按《中國獸藥典》規定方法進行，應符合《制品檢驗的有關規定》<0.4%。本發明的積極意義本發明涉及的一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗。該雞傳染性鼻炎滅活疫苗的制備方法，是按常規方法制備的滅活的副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株濃縮菌液，用滅菌PBS稀釋一定比例后與以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑按比例進行混合并攪拌搖勻制備而成雞傳染性鼻炎滅活疫苗。用本雞傳染性鼻炎滅活疫苗免疫雞后，可使接種雞只后產生的抗體效價高，抗體保護期長，攻毒保護率高等優點。實施例11 菌種制造及檢驗用菌種為副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株，由中國獸醫藥品監察所鑒定、 保管和供應。2疫苗制造及半成品檢驗(1)生產用種子制備1) 一級種子繁殖與鑒定取菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在含5% 10% CO2環境中37°C培養16 18小時后，挑選數個熒光性強的典型菌苔(菌落)接種于5日齡雞胚卵黃囊內，在37°C繼續孵育，收集30小時內死亡的雞胚卵黃液，經純檢合格后，作為-級種子。在-20°C以下保存，應不超過1個月，否則要再通過雞胚復壯，但不應超過6 代。2) 二級種子繁殖取感染的雞胚卵黃液，劃線接種雞肉湯瓊脂乎板，在含5% 10% CO2條件下，37°C培養16 18小時，選熒光性強的典型菌苔(菌落)接種于雞肉湯培養基中，置37°C培養16 20小時，經純檢合格后，即為二級種子。在2 8°C保存，不得超過6 8小時。(2)制苗用培養基為半合成培養基，制造方法見附注4。(3)制苗菌液的制備1)菌液培養將IOOml種子液加入4000ml半合成培養基中，在37°C培養18 20 小時，其間接振培養瓶二次，經純撿確認無雜菌污染，加入0. 05%甲醛溶液，置2 8°C保存。2)制苗菌液的濃縮與滅活用中空纖維超濾器將純檢合格的菌液濃縮，然后再用 PH7. 2的PBS制成懸浮液，使每Iml至少含50億菌體(用生物制品國家標準品“中國細菌濁度標準”進行比較，設標準管含副雞嗜血桿菌為觀億/ml)，再按體積比加入0. 15%甲醛溶液和0.01%的硫柳汞，在2 8°C滅菌7日，經檢驗無菌生長作為制苗抗原(參見《雞傳染性鼻炎滅活疫苗制造及檢驗規程》)。(4)佐劑的配制NaCl 5 IOg (無色立方結晶或白色結晶，上海國藥)，Na2HPO4 1. 5 2g (白色粉末，上海國藥)，KC10.1 0.5g (無色立方晶體，常為長柱狀，上海國藥)，KH2PO4 0. 1 0.5g (為無色結晶或白色顆粒狀粉末，上海國藥)，
卡波姆3 7g (白色疏松狀粉末，北京國人逸康科技有限公司)，去離子水1000ml，溶解后經121°C高壓30min滅菌后備用。(5)配苗將濃縮鼻炎菌液用滅菌PBS (0. lmol/L, pH 7. 0 7. 2)稀釋一定比例后與新型佐劑按4 1比例進行混合并攪拌搖勻，保證每Iml疫苗中含有10億菌數(用生物制品國家標準品“中國細菌濁度標準”進行比較判定)。實施例2按照《雞傳染性鼻炎滅活疫苗制造及檢驗規程》(中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程二〇〇〇年版.化學工業出版社，2000，本發明以下簡稱《規程》)上的檢驗方法對疫苗進行檢驗。1.無菌檢驗按《規程》進行，無菌生長。2.安全檢驗用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗lml，觀察14日， 應無異常反應。3.效力檢驗用2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1個月后，連同條件相同的對照雞4只，各眶下竇內注射C-HpS-S菌株雞肉湯16小時培養物 0. 2ml (50 100萬活菌)，觀察14日，對照雞全部發病(面部出現一側或兩例眶下竇及周圍腫脹并有流鼻涕或兼有流淚者)，免疫雞至少保護6只，或對照雞3只發病，免疫雞至少保護7只為合格。4.甲醛、硫柳汞含量測定分別按《中國獸藥典》規定方法進行，應符合《制品檢驗的有關規定》<0.4%。實施例31.疫苗安全性測定本疫苗經頸部皮下和胸部肌肉途徑接種2 3月齡的健康易感雞8只，每只皮下注射疫苗1ml，觀察14日，試驗雞飲食和健康狀況無異常反應，處死后注射部位解剖，無肉芽增生等副反應。2.免疫雞血清抗體的檢測疫苗經翅根肌肉免疫63日齡SPF雞，0. 5ml/只，共8只，分別在免疫后不同時間段采血分離血清，用Hpg-8株檢測抗原檢測血清抗體，以抗原抗體50%出現凝集反應的血清最大稀釋倍數定為血清的抗體效價。表1疫苗免疫后免疫雞血清抗體的檢測結果
權利要求
1.一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗，其特征在于該滅活疫苗含有滅活的副雞嗜血桿菌A型 C-Hpg-8株濃縮菌液和以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑。
2.如權利要求1所述一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于按常規方法制備的濃縮鼻炎菌液，用滅菌PBS稀釋一定比例后與以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑按41比例進行混合并攪拌搖勻制備而成雞傳染性鼻炎滅活疫苗。
3.如權利要求1和權利要求2所述一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗，其特征在于其中的以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑是按下述方法制備成取 NaCl 5 10g, Na2HPO4 1. 5 2g, KCl 0. 1 0. 5g, KH2PO4 0. 1 0. 5g,卡波姆 3 7g，溶于去離子水IOOOml中，溶解后經121°C高壓30min滅菌后備用。
全文摘要
本發明涉及的一種雞傳染性鼻炎滅活疫苗。該雞傳染性鼻炎滅活疫苗的制備方法，是按常規方法制備的滅活的副雞嗜血桿菌A型C-Hpg-8株濃縮菌液，用滅菌PBS稀釋一定比例后與以卡波姆為主要成分組成的疫苗佐劑按比例進行混合并攪拌搖勻制備而成雞傳染性鼻炎滅活疫苗。用本雞傳染性鼻炎滅活疫苗免疫雞后，可使接種雞只后產生的抗體效價高，抗體保護期長，攻毒保護率高等優點。
文檔編號A61P31/04GK102380092SQ20111037294
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者周忠號, 李平, 杜元釗, 韓建文 申請人:青島易邦生物工程有限公司