專利名稱：結核病的治療和預防的制作方法
技術領域：
本發明涉及分枝桿菌導致的感染如結核或麻風的治療和預防。特別是本發明涉及組合物及其使用方法。
背景技術：
結核(TB)是一種主要由被稱為結核分枝桿菌的細菌引起的傳染性疾病。該細菌主要攻擊肺(肺TB)，但其也可以攻擊脊柱，腦，腎，和其他器官或組織。如果治療不當，TB 可能會致命。每年有九百二十萬新結核病例并且有一百七十萬結核導致的死亡。此外，這些胞內細菌是數百萬例麻風的病因。其他主要由胞內物質傳播的衰弱性疾病包括皮膚和內臟利什曼病，美洲錐蟲病(恰加斯病)，瘧疾，李斯特菌病，弓形體病，組織胞漿菌，沙眼，鸚鵡熱，Q發熱，和包括退伍軍人癥的軍團病。此時，能預防暴露于這些生物體的易染個體衰弱性感染的辦法相對很少。首診出的結核分枝桿菌感染使用一線抗結核藥物(ATT)超過90% 的病例在6個月內便可治愈。然而，當TB與HIV —起出現或者有復發TB或抗藥形式ΤΒ，如多重抗藥TB (MDR-TB) 或廣泛抗藥TB O(DR-TB)時，現有藥物效果較低，而且治療患者耗時長達12-Μ個月且成功率比對藥物敏感型TB低得多。根據不同來源三分之一到一半之間的TB患者是伴隨HIV感染，其與預后非常差和高死亡率相關。與HIV合并感染的TB患者的治療是一項有挑戰性的任務。盡管有巨大的疾病負擔，過去40年沒有開發出新的抗TB化合物而現在的TB菌株對現有藥物的抗性在變強。現在至少10%的TB病例是抗藥形式。常規ATT難以治療的TB 的治療需要開發二線TB藥物。這是一個明顯的挑戰，特別是在資源貧乏的國家，因為治療費用會增加100倍。顯然需要替代的和改進的治療選擇。如果發現這樣的干預方法，對于難治療的，即抗藥TB或復發TB和/或TB-HIV患者的醫療保健和臨床處置的影響會是巨大的。明顯的努力方向是尋找抗TB的新藥物和疫苗。積極尋求基于免疫的干預方法作為常規ATT的輔助治療。抗TB的疫苗于1921年推出，由活卡介苗(BCG)-最初源于牛分枝桿菌的一種分枝桿菌的形式組成。BCG可以降低幼兒嚴重TB的風險但在青少年和成年人中預防肺TB不是非常有效，而青少年和成年人是這種疾病發病率最高的人群。由于BCG在這些情況下不算有效，有許多嘗試以發展更好的基于BCG的重組疫苗(如美國專利號5，830，475)。BCG通常是注射的形式因而廣泛使用有問題，需要專門的輸藥技能。活BCG也被用作口服疫苗。這是在Riode Janeiro的FundagSo Ataulpho de I^aiva(巴西抗結核聯盟)生產的巴西液體 BCG疫苗。其由獨特的“Moreau Rio de Janeiro” BCG菌株組成。該菌株在巴西被確定和使用已經超過70年。由于分枝桿菌恢復到能引起疾病的有毒力狀態的潛在危險，因此這樣的口服疫苗的效果是不可預測的。本領域技術人員認識到的另一個不可預測因素是在通過胃的過程中，疫苗抗原成分被胃的PH和消化酶快速滅活，因此通過腸壁的系統性同化很少或不存在。TB疫苗被同樣的嘗試作為治療方式超過100年。回到1890年，RobertKoch，結核分枝桿菌的發現者，宣布注射結核菌素可以治愈該疾病。然而，隨后包括接近2000名患者的臨床試驗顯示只有2%從該方法中受益。有使用BCG作為TB治療輔助手段的報導。在中國一項包括360名有TB的志愿者的研究中，接收BCG的患者陰性痰液轉換率為98. 3% 而化療對照中為97. 2%。盡管這不顯著，BCG組中5年后TB復發為2. 3%，而對照組中為 6.9%。相反，當在小鼠模型中嘗試有BCG的治療疫苗接種時，其導致了疾病的惡化——這是Koch首先觀察到的一種現象。顯示更有前途的治療疫苗是John Manford發現和開發的一種殺滅母牛分枝桿菌制品(美國專利4，724，144)。該免疫治療已經在世界許多國家中測試，且通常比單獨化療能取得更好的結果。例如，3個月后MDR-TB患者中所見陰性痰液轉換率為43%，而在接收化療的人群中為21%。母牛分枝桿菌在某些地理區域顯示產生了可衡量的改善，但在其他區域沒有，說明所治療宿主不同的環境和免疫經歷可能導致這種不一致。最近報導了一種包含脫毒的結核分枝桿菌細胞碎片的治療疫苗，RUTI，但現在還沒有關于其在人體中效果的數據，盡管在動物中該疫苗顯示有前途的結果。其他分枝桿菌物種被嘗試用于治療TB。 這包括草分支桿菌和M. w(—種最初開發用于麻風病的疫苗)。同樣，TB患者中的臨床結果中度且不可預期。由于誘導Koch樣反應的潛在風險，本領域技術人員有共識需要極其謹慎以開發安全有效的暴露后疫苗。因此，仍然有對更好的療法或疫苗的長期需要。此外這樣的療法需沒有不良屬性， 如患者毒性或甚至死亡，抗藥性誘因，以及需要復雜的途徑或方式來輸藥。盡管許多有前途的疫苗宣稱在動物模型中成功，通常其沒能被證明在人中是有效而安全的。因此，一種疫苗能否發展為有效的TB疫苗不明確。目前13種新候選疫苗已進入人體臨床試驗，超過40種在準備中。絕大多數，即使不是所有這些疫苗，都計劃通過注射施用，因為一般認為口服施用疫苗會導致其在消化道中的破壞。因此，現有技術沒有教導，公開，或啟示包含連同同種異型抗原的分枝桿菌病原體或多種病原體抗原或分枝桿菌抗原片段的口服組合物。發明概述本發明描述了一種片劑或丸劑形式的口服疫苗，包含病原抗原，如分枝桿菌抗原， 和來自源于與宿主自身相同物種的病原體感染或非感染組織的抗原(同種異體組分或同種異型抗原)。這些被配制進有金屬鹽作載體的丸劑。本發明的組合物克服了之前輸藥系統固有的困難，并能引導健康改良劑，即疫苗，進入及穿過人或動物受試者的粘膜。本發明的組合物通過粘膜表面施用，如通過口服途徑到達腸，以對需要其的受試者提供顯著臨床益處。本發明背離了必需用復雜的組合物克服發展有效的分枝桿菌疾病免疫治療和預防中的進展缺乏這一普遍觀念。本發明特點在于驚人的發現水解的分枝桿菌抗原臨床效果不遜于熱滅活的細菌抗原。因此，該組合物可以作為治療或預防分枝桿菌感染的疫苗。
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增強本發現吸引力的另一個特點是要求的組合物以口服劑型是有效的。為在生物學上有效，本發明抗原被嵌入或埋入藥學上可接受的基質中。而且，當組合物口服施用時不需要免疫佐劑來產生期望的效果。一方面，本發明包括固體口服組合物，其包含治療有效量的水解抗原，其中所述水解抗原源于感染了分枝桿菌的供體體液。固體口服組合物能方便的制成片劑或丸劑。體液可以包含分枝桿菌或分枝桿菌抗原。該組合物進一步包含嵌入基質如金屬鹽的同種異型抗原或異種抗原。本發明另一個更普遍的方面，本組合物包含嵌入金屬基質的酸水解抗原，同種異型抗原，或其組合。水解抗原可以被用作免疫治療或者預防制品。具體說，本發明涉及組合物，以及制備和使用所述組合物的方法。本發明進一步的方面是包含同種異型抗原和分枝桿菌抗原二者的組合物。這是另一個有助于本發明驚人方面的特征。該特征優選的實施方式是固體組合物，包含嵌入可口服金屬鹽基質的酸水解同種異型抗原，其中同種異型抗原或異種抗原是嵌入二價金屬鹽基質的人同種異型抗原，優選熱處理的。優選該組合物施用方式為口服。因此本發明優選的特點是組合物優選固體口服形式如片劑或丸劑。本發明另一個方面是制備本組合物的工藝，其一般包括水解分枝桿菌，分枝桿菌碎片，或同種異型抗原，將水解產物嵌入固體基質，并將基質配制進口服施用的組合物。本發明另一個方面，熱處理水解的抗原以使本組合物安全并殺死任何剩余的，未水解的，可能成為感染源的偶然病原體。盡管該步驟很重要，其并不關鍵，因為水解和嵌入工藝在大幅升高的溫度下完成，至少56°C，優選高于80°C，并進行延長時間如超過2小時。本發明的另一個方面，組合物無免疫佐劑下施用。盡管考慮組合物源于身體器官或體液，像全血，或血漿或血清，本發明也預期了重組的分枝桿菌和其抗原如本領域熟知的和醫學文獻引用的。這些可以是培養生長的分枝桿菌或其可以為重組形式。重組的生物體或其部分可以包括自然發生的組成這些抗原的氨基酸或核酸序列，或與自然發生序列大體相同的自然發生序列的衍生物，或以線性或三級形式模擬它們的序列，和可能有多于一種分枝桿菌的嵌合序列，例如在一個組合物中的BCG 和結核分枝桿菌。這些和其他多種形式疫苗排列被不限制的考慮且本領域公知。本發明進一步的方面包含治療患者的方法，包括對患者施用治療有效量水解的分枝桿菌感染細胞，分枝桿菌，或其碎片的步驟。除了治療分枝桿菌感染患者，本發明包括預防性施用所述疫苗以降低最終分枝桿菌感染可能性或嚴重性的方法。在額外的實施方式中，本發明涉及在脊椎動物受試者中引發適當的免疫反應(細胞或體液)的方法，包括對脊椎動物受試者施用治療有效量的嵌入金屬基質的選擇的本發明大分子。本發明也提供逆轉宿主中TB感染引起的體重損失的方法，該方法包括對宿主施用本發明組合物。本發明也提供逆轉宿主中施用常規ATT治療引起的抗結核(ATT)相關肝毒性的方法，該方法包括向宿主施用權利要求1的組合物。在優選的實施方式中，除了用本領域接受的標準賦形劑配制，疫苗不受到任何旨在增強抗原在不利的消化環境中“生存”的特殊修飾。
創新的疫苗通過整個身體免疫及在關鍵重要粘膜組織提供保護，如在眼，肺，口， 耳，腸，宮頸，子宮和直腸，病原體經常首先在這些位置進入身體，如通過氣溶膠傳播給要感染的人。在動物和患者的測試中，本發明的疫苗通過粘膜免疫細胞在中止感染需要的時間框內誘導強烈的反應。因此，作為口服疫苗，其在粘膜表面作用，也通過發起抗疾病免疫反應刺激系統免疫。本發明提供了一種驚人有效和廣泛適用的方法，來治療和預防從人到其他能受分枝桿菌感染的脊椎動物的多種宿主生物中的各種TB感染。不受限制，人和其他動物中的TB疾病可能由除結核分枝桿菌外的分枝桿菌引起。這是由于所有分枝桿菌屬于相同類的病原體，其中有些有毒而有些沒有。有許多已知的分枝桿菌生物，包括但不限于BCG，結核分枝桿菌(M. tuberculosisM.)，鳥結核分枝桿菌(M. avium)，哈瓦那分枝桿菌(M. habana)，膿腫分枝桿菌(M. abscessus)，金色分枝桿菌(M. aurum)，牛分枝桿菌(M. bovis)，母牛分枝桿菌(M. vaccae)，非洲分枝桿菌 (M. africanum)，龜分枝桿菌(M. chelonae)，偶然分枝桿菌(M. fortuitum)，fuerthensis 分枝桿菌(M. fuerthensis)，胃分枝桿菌(M. gastri)，古地分枝桿菌(M. goodi)，戈登分支桿菌(M. gordonae)，免疫原分枝桿菌(M. immunogenum)，胞內分枝桿菌(M. intracellulare)， 副結合分枝桿菌(M. paratuberculosis)，Iufu分枝桿菌(M. Iufu)，堪薩斯分枝桿菌 (M. kansasii)，慢黃分枝桿菌(M. Ientiflavum)，麻風分枝桿菌(M. leprae)，M. w,馬德里分枝桿菌(M. mageritense)，瑪爾摩分枝桿菌(M. malmoense)，海分枝桿菌(M. marinum)， 馬西里亞分枝桿菌(M. massiliense)，莫娜分枝桿菌(M. monacense)，產粘液分枝桿菌 (M. mucogenicum),新金分枝桿菌(M. neoaurum),夕卜來分枝桿菌(M. peregrinum),草分枝桿菌(M.phlei)，豬分枝桿菌(Mporcinum)，腐敗分枝桿菌(M. s印ticum)，猿分枝桿菌 (M. simiae)，恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)，蘇加分枝桿菌(M. szulgai)，土地分枝桿菌 (M. terrae)，托斯卡納分枝桿菌(M. tusciae)，不產色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)， 潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)，龜型分枝桿菌(M. chelonei)，瘰疬分枝桿菌 (M. scrofulaceum)，通俗分枝桿菌(M. triviale)，亞洲分枝桿菌(M. asciaticum)，微黃分枝桿菌(M. flavescens)，日內瓦分枝桿菌(M. genavense)，或蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)。這些分枝桿菌可以通過本領域已知的方法使用液體培養基，如Middlebrook 7H9或Saulton 合成培養基來增殖。菌株可以保持為靜止或搖動的培養物。不限于整個病原體，可以使用其片段。這樣片段的例子是源自屬于結核家族的細菌的多肽，如ESAT-6，TB10.4, CFP10, RD1-0RF5, RD1-0RF2, Rvl036, MPB59, MPB64, MPB70, MPB83, MPT32, MPT64, Ag85B (MPT59)， Ag85A，Ag85C，19kDa脂蛋白，和α -晶體蛋白，或任何上面提及抗原的至少一種T細胞表位。本發明同樣適用于細胞內病原體引起的疾病如麻風。其他通過血液傳播的類似疾病包括皮膚和內臟利什曼病，錐蟲病(恰加斯病)，弓形體病，組織胞漿菌病， 沙目艮，月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae),惡性癥原蟲(Plasmodium falciparum) (瘧疾)，尿素分解尿素原體(Ureaplasmaurealyticum)，生殖器支原體(Mycoplasma genitalium)，軍團桿菌病(軍團病)，嗜肺性軍團桿菌(Legionella pneumophilia)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)，鉤端螺旋體病，利斯特菌病，鼠咬熱(黑弗里爾熱)， 念珠狀鏈桿菌(Str印tcAacillus moniliformis)，蜱傳疾病。螺旋體博氏疏螺旋體 (Borreliaburgdorferi)，Sf^ti ^1 , ^ifftlii^i^ (Acrodermatitis Atrophicans)，Ms 螺旋體淋巴細胞瘤，回歸熱，埃立克體病，兔熱病。衣原體感染如肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)，鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)，鳥疫，鸚鵡病，鸚鵡熱，巴爾通體感染， Q熱，立克次氏體感染如落基山斑疹熱，斑疹傷寒，流行性虱傳叢林斑疹傷寒，梅毒密螺旋體 (Treponema pallidum),弧菌感染等。熱滅活的分枝桿菌抗原被配制入適合對人和動物有效疫苗施用的口服丸劑中。除了這樣的抗原，需要同種異體抗原，即來自與計劃的宿主相同物種但不是分枝桿菌抗原的同種異型抗原。同種異型抗原最方便的來源是外周血，但其他的來源也可以采用，包括天然來源或重組來源或細胞系。此外，優選抗原被配制進有金屬鹽賦形劑的丸劑。這些鹽與抗原非共價結合。代表性的金屬鹽例子包括，但不限于硼化鋁鎂，醋酸鈣鎂，磷酸二鎂，鎂加鋁，鋁化鎂，天冬氨酸鎂，苯甲酸鎂，溴化鎂，碳酸鎂，氯化鎂，六水合氯化鎂，檸檬酸鎂，二硼化鎂，二谷氨酸鎂， 重鈾酸鎂，氟化鎂，葡萄糖酸鎂，六水合鎂，氫化鎂，氫氧化鎂，碘化鎂，乳酸鎂，乙酰丙酸鎂， 硝酸鎂，氮化鎂，乳清酸鎂，氧化鎂，氯氧化鎂，含氧硫酸鎂，高氯酸鎂，過氧化鎂，磷酸鎂，吡咯烷酮酸鎂(Magnesium pidolate)，硅化鎂，硬脂酸鎂，硫酸鎂，硫化鎂，亞硫酸鎂，三硅酸鎂，磷酸一鎂，檸檬酸三鎂等。本領域技術人員同樣可以使用與其他酸反應得到的鹽，包括但不限于甲苯磺酸鹽，甲磺酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽，丙二酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，苯甲酸鹽，抗壞血酸鹽， α -酮戊二酸鹽，α -磷酸甘油鹽，甲酸鹽，富馬酸/延胡索酸鹽，丙酸鹽，乙醇酸鹽，乳酸鹽， 丙酮酸鹽，草酸鹽，氯氧化物，馬來酸鹽，水楊酸鹽，硫酸鹽，磺酸鹽，硝酸鹽，氫溴酸鹽，氫溴化物，氫碘化物等。一般來說，金屬鹽可以是硼化物，醋酸鹽，磷酸鹽，鋁化物，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，溴化物，碳酸鹽，氯化物，六水合氯化物，檸檬酸鹽，二硼化物，二谷氨酸鹽，重鈾酸鹽，氟化物，葡萄糖酸鹽，六水合物，氫化物，氫氧化物，氧化物，碘化物，乳酸鹽，乙酰丙酸鹽，硝酸鹽，氮化物，乳清酸鹽，氯氧化物，含氧硫酸鹽，高氯酸鹽，過氧化物，吡咯烷酮酸鹽，硅化物， 硬脂酸鹽，硫酸鹽，硫化物，亞硫酸鹽，三硅酸鹽等。本發明另一方面，兩種或更多種金屬可以同時使用。例如，可以以各種可接受的比率混合氯化鈣和氯化鎂并向其中嵌入水解的抗原。不限于兩種金屬來源，顯然多數來源包含多種金屬或其合金的少量混合物。例如鎂砂可能包含少量鈣和其他金屬。混合物中的鈣如碳酸鈣不干擾固體物質的環境，因為高比例的反應性鎂砂起主導作用。反應性鎂可以方便的與其他混合物組合以創造固體物質如鋁酸鈣，或其他成分例如有顯著優勢的石膏或水泥樣組合物。在另一個實施方式中，自然產生的礦物如粘土，高嶺石，白堊，硅石，石膏， 長石，鈉長石，鈣長石，正長石，磷灰石，巖鹽，方解石，白云石，碳酸鈉，菱鐵礦，黑云母，膨潤土，白云母，綠泥石，輝沸石，黃鐵礦，赤鐵礦等可以被分散并制備進抗原被混合并水解的漿體中。要求保護組合物，制備疫苗組合物的方法以及疫苗接種或治療哺乳動物/人抗結核的方法。特別地，本發明提供了一種保護非感染哺乳動物，包括人，免受TB感染的方法， 包括對非感染的哺乳動物/人施用有效量的口服疫苗制劑，其含有伴有同種異型抗原的熱滅活感染TB的細胞，TB分枝桿菌，或其碎片。本發明另一種方法提供了治療TB感染的方法，包括對需要其的哺乳動物/人施用有效量的口服組合物，所述口服組合物包含伴有同種異型抗原的熱滅活感染TB的細胞，TB分枝桿菌，或其碎片。本發明也提供了生產用于治療或預防TB細菌引起感染的口服疫苗的方法，包括熱滅活源于感染TB動物的組織，TB細菌，或其片段，以及配制進有金屬鹽的口服組合物。發明詳述對非感染宿主施用疫苗被稱為“預防疫苗接種”，而對已感染宿主施用被稱為“治療疫苗接種”。術語“預防”包括在疾病或病癥發生前試圖中止其出現。術語“治療”包括試圖緩解受折磨受試者的疾病或臨床狀況。在實驗過程中發現當結核分枝桿菌，如在三分之一健康人血液中發現的結核分枝桿菌，被配制進片劑中時，當其施用給有結核的個體或作為預防感染的方式時，這樣的制品獲得了導致更有利臨床結果的生物活性。制造這樣制劑的步驟簡單且直接。步驟之一是所謂的水解，其可以容易的通過按優選水解方式酸處理來完成。PH范圍優選低于6并更優選介于0. 5和5. 5，更優選介于1和4，更優選介于1. 0和3. 0，并甚至更優選介于1. 0和 2. 0。盡管這些范圍被給作最佳范圍，其并不阻礙本領域技術人員確定其他范圍，這仍然在本發明范圍內。水解的抗原，如蛋白的比例，占未水解的天然抗原重量的至少10%，優選至少20 %，優選至少30 %，優選至少40 %，優選至少50 %，優選至少60 %，優選至少70 %，優選至少80%，且可以是至少90%。100%水解的含義是水解反應后所有蛋白被水解成游離氨基酸，沒有任何較大殘留物，如肽殘留的情況。 水解持續時間可以是5分鐘到數小時間的任意時間，更優選其在10分鐘到5小時之間，甚至更優選在20分鐘到3小時之間。持續時間可以是更短的小時數，其由本領域技術人員熟悉的常規水解條件下簡單試驗確定。因此水解持續時間可以是30分鐘，1小時， 1. 5小時，2小時，2. 5小時，或3小時，或中間時間。用于水解的酸可以是，但不限于，無機酸，如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷酸等。有機酸的例子包括但不限于，例如，醋酸，檸檬酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸， 丙二酸，丁二酸/琥珀酸，馬來酸，富馬酸/延胡索酸，酒石酸，苯甲酸，肉桂酸，苦杏仁酸，甲磺酸，乙磺酸，水楊酸，對甲苯磺酸等。結核抗原來源不一定需要來自血液或血液衍生物如血漿或血清。痰或其他體液像尿液，胃腸分泌物，組織或腫瘤的液體，滑液，唾液，痰，囊液，羊水，腦脊液，腹腔積液，肺灌洗液，精液，淋巴液，淚液，汗液，和前列腺液可以用作結核抗原來源。這些液體可能包含白細胞，巨噬細胞或同樣有利的其他細胞。不限于液體，固體組織如肺，肝，胰腺，骨骼肌，心， 腎，腦，骨髓，腫瘤組織，皮膚，髓鞘，膠原，糞便和其他組織也可以使用。全血，或血清或血漿，或其中存有分枝桿菌病原細胞的培養液，或重組獲得的包含分枝桿菌的抗原優選用酸或堿處理。細胞系，例如像HeLa，同樣可以被用于培養分枝桿菌。 本領域技術人員可以使用其他水解劑像酶或去垢劑。水解的樣品被合并或來自一個個體， 或作為獨立的批次保存。在一個實施方式中當組合物仍然在液體溶液中及進行水解過程時，水解產物可以用金屬鹽或用形成鹽的堿金屬氫氧化物溶液沉淀。該步驟有效中止水解，因為抗原被埋入或嵌入固體物質基質并不能與水解劑反應。沉淀可以與水解同時進行，或在水解步驟后開始，依據最終產品的計劃用途而定。例如，抗原和同種異型抗原組成的水溶液，優選約90% 到約20%的蛋白，更優選約80%到約40%的蛋白溶液，使用酸處理，直到pH值為約1到約 6，優選約1到約4，更優選約1到約2。低速攪拌溶液，優選在約10到約500rpm，更優選約30到約300，甚至更優選約60到約200rmp，約60分鐘到約120分鐘，優選約45到約80分鐘，更優選約30到約60分鐘。金屬鹽隨后被加入攪拌中的溶液以產生凝固為固體團的漿。 沖洗該團約1分鐘到約60分鐘，優選約5到約45分鐘，更優選約10到約30分鐘，隨后在烤箱中在約56到約200°C，優選在約70到約150°C，更優選在約80到約140°C，更優選在約 100到約120°C加熱干燥約1小時到約72小時，優選約3到約48小時，更優選約5到約12 小時。干燥的固體團隨后被弄碎成粉末。開始沉淀并在該步驟后加入水解劑同樣有利。在另一個實施方式中金屬鹽在水解之前存在，蛋白在存在所述金屬鹽的情況下被水解，同時或伴隨沉淀。將活性成分如抗原與同種異型抗原，或沒有同種異型抗原的單獨抗原，或沒有抗原的單獨同種異型抗原嵌入工藝的代表性步驟可以包括將同種異型抗原與金屬鹽溶液接觸以產生漿，并通過將其與酸接觸使之水解，以使混合物硬化并轉變為固相或固體狀態形式——也被知為固體物質凝固的過程。這種固體形式隨后被弄碎成嵌入在活性成分中的粉末顆粒。這些步驟的順序可以被很容易的提前確定，并可以無過度實驗的實施，只要臨床研究確定有活性成分的終產品臨床有效。水解的分枝桿菌抗原和同種異型抗原可以被嵌入鹽中，包括但不限于鋰，鈹，鈉， 硅，鎂，鋁，鋁，鉀，鈣，鈦，釩，鉻，錳，鈷，鎳，銅，鋅，砷，鋯，鉬，銀，鎘，銻，鋇，鋨，鉬，或金。最適合的可溶鹽包括氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣或氯化鎂。代表性金屬例如鎂的鹽的例子是硼化鋁鎂，醋酸鈣鎂，磷酸二鎂，鎂加鋁，鋁化鎂，天冬氨酸鎂，苯甲酸鎂，溴化鎂，碳酸鎂，氯化鎂，六水合氯化鎂，檸檬酸鎂，二硼化鎂，二谷氨酸鎂，重鈾酸鎂，氟化鎂，葡萄糖酸鎂，六水合鎂，氫化鎂，氫氧化鎂，碘化鎂，乳酸鎂，乙酰丙酸鎂，硝酸鎂，氮化鎂，乳清酸鎂，氧化鎂， 氯氧化鎂，含氧硫酸鎂，高氯酸鎂，過氧化鎂，磷酸鎂，吡咯烷酮酸鎂，硅化鎂，硬脂酸鎂，硫酸鎂，硫化鎂，亞硫酸鎂，三硅酸鎂，磷酸一鎂，檸檬酸三鎂等。在本發明進一步的方面，兩種或更多金屬可以被同時使用，例如氯化鈣和氯化鎂可以以各種可接受的比例混合，水解抗原嵌入其中。本組合物與現有技術中有主要吸附到免疫佐劑如氫氧化鋁表面的抗原的組合物區別是本抗原被穩固的嵌入基質中，使其物理結構甚至在一般不利的條件中即較長時間的高溫中，能保持完整。眾所周知暴露于高溫，例如在56°C或更高加熱，像80°C—小時或更長可用于破壞偶然的病原體，但不能用于制備疫苗。然而，令人驚訝的是，本組合物，當暴露于高溫時沒有失去其抗原性并顯示出陽性臨床好處。因此，本組合物可以被安全的使用，因為可能存在于組合物中的潛在感染病毒被暴露于高溫1小時或更長有效殺滅。熱處理的優勢，盡管從消除感染性病毒的立場明顯，是從保存抗原性的立場根本不明顯——與本領域流行的共識相反的觀察結果。本組合物隨后與片劑賦形劑組合。賦形劑通常被視為加入活性成分中提供體積的惰性物質，例如在片劑中。這可以是任何下面的成分，或相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素，樹膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如褐藻酸或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或風味劑如薄荷或其他一些調味劑。 與賦形劑混合通過藥劑專家熟知的濕式或干式造粒工藝進行，得到的混合物被壓成片劑。 對壓縮有影響的賦形劑的各種性質，如水分含量，顆粒大小和分布，多態性，無定形性，晶體習性，水化狀態，混合物的潤滑劑和粘合劑水平在從業者常規知識內。壓片速度和壓片的機械方面如沖頭/模具的選擇，壓片機器可以由技工無過度實驗選擇。此外，藥劑可以含有改變其物理形式的其他各種材料，如糖，蟲膠，或其他腸道劑包衣。片劑可以被主要溶于腸液， 但基本不溶于胃液的腸道包衣材料覆蓋。優選腸道包衣材料選自商業現有的，盡管新材料可以由有實踐技能的技工選擇。優選的藥劑形式是口服固體劑型如片劑或丸劑。而且，本發明描述的藥物組合物可以被配制進任何合適的劑型中，包括但不限于，口服水分散體，口服水懸浮液，氣霧劑，控釋劑，速融劑，泡騰劑，自乳化分散體，固體溶液，脂質體分散體，凍干劑，膠囊，粉劑，延遲釋放劑，立即釋放劑，調釋劑，延長釋放劑，脈沖釋放劑，復微粒劑，混合立即釋放劑，控釋劑寸。在本發明其他實施方式中，片劑中活性成分，即通過固體劑型如片劑或丸劑施用給受試者的有同種異型抗原的抗原的量，為本領域已知的達到有需要的人或動物治療有效濃度的藥物。例如，一種或多種活性成分的量可以從約0.0001微克到約1克。在其他實施方式中，活性成分的量可以從約0.001微克到約100毫克。在其他實施方式中，活性成分的量優選可以從約0.01微克到約10000微克，從約0. 5微克到約1000微克或從約1微克到約500微克。在另一個實施方式中，藥劑以固體劑型施用，總蛋白濃度約10微克到約500微克。在另一個實施方式中，活性成分藥劑以固體劑型施用，濃度約1-100微克。在其他實施方式中活性成分的量基于組合物總重從約0.00001%到約30%，優選量介于約0. 001%到 20%，優選量介于約0.01%到10%，優選量介于約0. 1%到5%。含量也可以依據計劃的用途改變。做治療用途的含量可以比計劃做預防用途的組合物含量高約一個數量級。例如， 如果在治療組合物中分枝桿菌抗原量是60微克，那在預防形式中，劑量可以減至5或10微克。然而，這不是絕對的要求。這些以及其他關于有效劑量的含義目的不是限制而是僅以例子的方式提供。“治療有效”的活性成分的準確量通過標準臨床試驗確定，其中臨床效果通過本領域技術人員熟知的方式監測。在優選的實施方式中，分枝桿菌抗原與同種異型抗原一起存在于組合物中，其可以用于預防或治療應用來預防或積極治療結核。在多數疫苗制造中，做相當大的努力純化疫苗抗原。這是由于考慮注射時，疫苗抗原以外的抗原會引起不良免疫反應，有時還可能危及生命。因此，要求同種異型抗原與疫苗抗原一同存在于組合物中與本領域流行的一般知識相悖。分枝桿菌抗原和同種異性抗原比例由本領域已知技術確定。優選，理想的比例是自然發現的比例，例如全血中的，即分枝桿菌的量和其他宿主分子如血液中發現的總蛋白量的比例。這同樣適用于抗原在增殖的細胞，像酵母細胞或如CHO細胞的哺乳動物細胞中重組表達的情況。當組合物成分在非人物種的細胞中生長但不計劃用于人的情況時，同種異型抗原則被稱為異種抗原，其為本發明的目的可以被稱為同種異型抗原。盡管上面有關于優選比例的推理，可以故意增加同種異型抗原或抗原的量。在任何情況下，同種異型抗原的量不應太低以至于使得其被考慮為污染物，如在標準疫苗，如血漿中制得的乙型肝炎疫苗中所發現的。盡管從合并血漿中制得的乙型肝炎疫苗中污染血漿蛋白，即同種異型抗原的量依批次或制造商而改變，其通常低于1%。在甲型肝炎疫苗情況下，WHO建議污染清蛋白的量低于50納克每劑。因此，這些要求將本組合物與之前本領域中的經典疫苗組合物區分開，因為本發明中，各種同種異型抗原分子和抗原的比例總是高于1 1，優選高于10 1， 理想的高于100 1，且當清蛋白被用于計量同種異體材料的量時總是超過50納克/克。
11按計劃這里需要多于一種類型的同種異型抗原。優選需要盡可能的更廣泛多樣性。這些組合物，特別是口服輸送形式中的，可以用于需要其的宿主，如人宿主或其他需要其的物種。在某些實施方式中，施用后藥劑按約3小時到約M小時間隔提供治療有效量的組合物，可以是，例如根據需要的一天一次，一天兩次(b. i.d.)，或一天三次(t.i.d.)施用。 優選一或兩片每天的簡單用藥計劃。施用可以是單次的片劑施用，更優選至少一周上至一月至一年的重復施用，或如果認為必要進行多年。1-3個月后治療可以被停止并在中斷一個月后再次重復，盡管在某些患者中3或6個月長間隔的重復治療是不必要的。在某些情況下，優選停止一年隨后再重復。在某些個體中治療根本不必重復，因為患者被治愈并不需要進一步的用藥。在本發明的另一個方面無免疫佐劑施用組合物。盡管這是施用的優選方式，本領域技術人員可以使用本領域已知的免疫佐劑施用組合物。免疫佐劑的例子包括但不限于細菌佐劑；細胞因子佐劑；植物衍生佐劑等。本發明的組合物可以聯合抗結核藥物施用。本發明的組合物/療法可以與任何其他生物活性物質聯合使用如藥學上有效的物質，包括，但不限于，抗炎藥，鎮痛劑，鎮靜劑， 抗焦慮藥，解痙藥，抗抑郁藥，抗精神病藥，抗焦慮藥，麻醉拮抗劑，抗帕金森劑，膽堿能激動劑，化療藥物，免疫抑制劑，抗病毒藥物，抗微生物藥如抗生素，食欲抑制劑，抗膽堿能劑，抗對稱劑(antimetrics)，抗組胺劑，抗偏頭疼劑，冠狀動脈、腦或或外周血管舒張藥，激素劑， 避孕藥，抗血栓藥物，利尿劑，抗高血壓藥物，心血管藥物，阿片類藥物等。本發明的其他特征和優勢從下面提供的包含不同實施例的另外詳細公開中顯現。 下面提供的實施例展示了用于實踐本發明的不同成分和方法。實施例不限定要求的發明。 基于現有的公開本領域技術人員可以識別并采用其他成分和方法來實踐本發明，這也在本發明范圍之內。
實施例實施例1 分析口服，治療性肝炎疫苗2階段研究結果，超過94. 4%的有慢性丙型肝炎并伴有TB和HIV的患者在其痰液涂片中完全清除了桿菌(表1)。結果20名患者中的17名在治療開始后一個月內出院。通過參數和非參數測試的統計分析顯示該現象是具有高度顯著性的。本發明的疫苗片每日一次經口服施用給20名患者一個月。每名加入研究的患者患有肝臟腫大和肝損傷指標升高，在研究結束時20名患者中19名(95%)改善。降低是高度顯著的，ALT和總膽紅素分別從172. 1 士34降低到18. 2士28. 2U/L(P = 5. OE-012)和從 22. 1 士 3. 4降低到10. 9 士 2. 5ymol/L(P = 5. 7E-009)。肝臟腫大從正常大小以上3. 5 士 1. 4 降低到0. 95士 1. Icm(P = 2. 9E-009)。由于患者在TB醫院住院他們被使用標準抗TB療法(ATT)治療。令人驚訝的是，本發明的疫苗組合物顯示出比期望的痰液轉換率更高和更快；94. 4%的涂片陽性患者一個月內變成陰性。TB相關的發熱在均值/中值4. 1/3天內消退；炎癥指征如升高的紅細胞沉降率和高白細胞計數回歸正常，分別從32. 3士 11. 4到 9. 9士6. 4mm/h(P = 3. 7E-008)和從 14. 3士3. 9 到 4. 7士 1. 4X IO9L(P = 7. 1E-010)。平均體重增加為7. 7kg (P = 4. 6E-007)并且血紅蛋白水平從114士7. 1增加到123. 4士6. 6g/L(P =1.4E-007)。在任何時間都沒有觀察到有害事件。
12
表1使用TB藥物結合疫苗治療一個月的有HIV和TB共感染的HCV感染患者的基
線和結果特征。
權利要求
1.一種口服組合物，包含至少一種分枝桿菌(mycobacterium)抗原和同種異型抗原， 以使將所述組合物引入需要其的宿主能導致有利的預防或治療結果。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物含有金屬鹽載體。
3.權利要求2的組合物，其中所述金屬鹽是鎂鹽或鈣鹽。
4.權利要求1的組合物，其中所述至少一種分枝桿菌抗原源自BCG，結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)，鳥結核分枝桿菌(M. avium)，哈瓦那分枝桿菌(M. habana)，膿腫分枝桿菌(M. abscessus)，金色分枝桿菌(M. aurum)，牛分枝桿菌(M. bovis)，母牛分枝桿菌(M. vaccae)，非洲分枝桿菌(M. africanum)，龜分枝桿菌(M. chelonae)，偶然分枝桿菌 (M. fortuitum)， fuerthensis ^feff Ir (M. fuerthensis)，胃 ifeff· (Μ. gastri)，分枝桿菌(M. goodi)，戈登分支桿菌(M. gordonae)，免疫原分枝桿菌(M. immunogenum)， 胞內分枝桿菌(M. intracellulare)，副結合分枝桿菌(M. paratuberculosis)，Iufu 分枝桿菌(M. Iufu)，堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)，慢黃分枝桿菌(M. Ientiflavum)， 麻風分枝桿菌(M. leprae)，Μ. w，馬德里分枝桿菌(M. mageritense)，瑪爾摩分枝桿菌 (M. malmoense)，海分枝桿菌(M. marinum)，馬西里亞分枝桿菌(M. massiliense)，莫娜分枝桿菌(M. monacense),產粘液分枝桿菌(M. mucogenicum),新金分枝桿菌(M. neoaurum), 外來分枝桿菌(M. peregrinum)，草分枝桿菌(M. phlei)，豬分枝桿菌(M. porcinum)，腐敗分枝桿菌(M. septicum)，猿分枝桿菌(M. simiae)，恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)，蘇加分枝桿菌(M. szulgai)，土地分枝桿菌(M. terrae)，托斯卡納分枝桿菌(M. tusciae)， 不產色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)，潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)，龜型分枝桿菌 (M. chelonei)，瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum)，通俗分枝桿菌(M. triviale)，亞洲分枝桿菌(M. asciaticum)，微黃分枝桿菌(M. flavescens),日內瓦分枝桿菌(M. genavense),或蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)。
5.權利要求1的組合物，其中所述同種異型抗原源自與宿主相同物種供體的組織。
6.權利要求5的組合物，其中所述來自供體組織的同種異型抗原是來自合并的外周血。
7.治療或預防TB的疫苗，所述疫苗包含與金屬鹽一同配制入口服丸劑的熱滅活分枝桿菌抗原。
8.權利要求7的疫苗，其中所述金屬鹽是鎂鹽或鈣鹽。
9.保護非感染宿主免受分枝桿菌感染的方法，包括對非感染宿主施用有效量的口服疫苗制劑，其包含熱滅活的分枝桿菌抗原或其片段以及同種異型抗原。
10.治療TB的方法，包括對需要其的宿主施用有效量的口服組合物，所述口服組合物包含熱滅活的分枝桿菌抗原或其片段以及同種異型抗原。
11.權利要求10的方法，其中所述方法以常規用于治療TB的抗結核療法來補充。
12.生產用于治療或預防結核的口服組合物的工藝，包括水解分枝桿菌，或其碎片，以金屬鹽沉淀，并配制入固體口服組合物。
13.權利要求12的工藝，其中額外工藝步驟包括加熱步驟。
14.逆轉宿主中TB感染引起的體重損失的方法，該方法包括對宿主施用權利要求1的組合物。
15.逆轉宿主中施用常規ATT治療引起的抗結核(ATT)相關肝毒性的方法，該方法包括對宿主施用權利要求1的組合物。
全文摘要
本發明屬于免疫學和微生物學領域，更確切的說屬于分枝桿菌學領域，并涉及結核及相關疾病的免疫治療與預防。公開了用于這些目的的組合物，包括使用所述組合物的方法。
文檔編號A61P31/06GK102441162SQ201110372540
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月8日 優先權日2010年10月4日
發明者A·布林貝爾, V·吉拉西蒂卡爾 申請人:免疫產品美國股份有限公司