專利名稱：Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)中的多肽技術(shù)，尤其是涉及一種來源于天然TLR2激動(dòng)劑 HP-NAP的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，本發(fā)明還涉及該多肽在開發(fā)Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人體免疫系統(tǒng)是機(jī)體防止病原體感染、清除腫瘤細(xì)胞和維持自身健康的重要防御體系，而⑶4+T輔助性淋巴細(xì)胞是執(zhí)行這一功能的重要環(huán)節(jié)。1986年Mosmarm等在研究小鼠⑶4+Th時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩種不同類型的細(xì)胞因子產(chǎn)生克隆；Thl細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN- γ等細(xì)胞因子；而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子。Thl細(xì)胞因子可以增強(qiáng)殺傷性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)免疫應(yīng)答，與機(jī)體抗腫瘤抗病毒有關(guān)；Th2細(xì)胞因子促進(jìn)抗體產(chǎn)生， 增強(qiáng)體液免疫，與移植物耐受、抑制自身免疫疾病相關(guān)。HP-NAP能上調(diào)中性白細(xì)胞及單核細(xì)胞表面β 2整聯(lián)素的表達(dá)，促進(jìn)中性白細(xì)胞及單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及穿過內(nèi)皮細(xì)胞向感染部位轉(zhuǎn)移聚集。HP-NAP—旦從菌體中釋放出來，還可以穿過胃上皮細(xì)胞到達(dá)黏膜下層并激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞釋放的IL-6 進(jìn)一步趨化和激活中性白細(xì)胞及單核細(xì)胞。2010年，Andrea Cappon等研究證實(shí)HP-NAP 可以通過促進(jìn)機(jī)體釋放一些內(nèi)源性因子(IL-1 β等)延長單核細(xì)胞的壽命，并且可以通過單核細(xì)胞依賴的方式延長中性粒細(xì)胞的壽命。2006年Amedeo等報(bào)道HP-NAP是一種TLR2 (Toll-like receptor 2)激動(dòng)劑，能夠誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和IL-23 等細(xì)胞因子，使宿主抗原特異性⑶4+T細(xì)胞由Th2向Thl免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變。因此HP-NAP可能成為逆轉(zhuǎn)Thl/Th2漂移，增強(qiáng)Thl反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于天然TLR2激動(dòng)劑HP-NAP的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，本發(fā)明另一目的在于提供該多肽在開發(fā)Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，其氨基酸序列為 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο本發(fā)明的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用免疫信息學(xué)手段，預(yù)測天然TLR2激動(dòng)劑HP-NAP最小功能結(jié)構(gòu)域，采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC/MS鑒定后，用體外細(xì)胞模型驗(yàn)證其對Thl 細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)功能。鑒定出的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽序列未見文獻(xiàn)與專利報(bào)道， 為基于Thl細(xì)胞因子調(diào)節(jié)為機(jī)理的免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)提供了制備與篩選技術(shù)。


圖1為本發(fā)明多肽的質(zhì)譜分析圖2為RT-PCR鑒定本發(fā)明多肽napP102刺激PBMCs后IFN- γ表達(dá)結(jié)果。圖3為RT-PCR鑒定本發(fā)明多肽napP102刺激PBMCs后IL-4表達(dá)結(jié)果。圖4為本發(fā)明多肽napP102與MAGE-A3共同作用后的殺傷效果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，記為napP102，依據(jù)天然TLR2 激動(dòng)劑HP-NAP的第102 - 117位的氨基酸序列進(jìn)行Fmoc固相合成，HPLC分離純化，MS進(jìn)行鑒定，其氨基酸序列為
Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ；分子量為 1853.958。本發(fā)明的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)劑(如惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑)中的應(yīng)用。本發(fā)明主要采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、IEDB, NetMHC2. 2數(shù)據(jù)庫對 HP-NAP的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，設(shè)計(jì)HP-NAP多肽序列。Kolaskar和Tongaonkar方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選獲得多肽序列采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC純化后，質(zhì)譜鑒定。肽質(zhì)譜鑒定圖見圖1。本發(fā)明多肽napP102制備的基本流程為首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參見①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。 ②.N.休厄德、H. D.賈庫布克著，劉克良等譯，肽化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年。)
人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離誘導(dǎo)及RT-PCR實(shí)驗(yàn)和LDH實(shí)驗(yàn)檢測抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細(xì)胞介素2 (IL-2，P印rotech公司) 誘導(dǎo)分化⑶4 + T細(xì)胞，進(jìn)一步在體外RT-PCR實(shí)驗(yàn)和LDH實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下
1. PBMCs的分離與誘導(dǎo)(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ； (2)離心管中加入細(xì)1 Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司)；(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4) 20°C離心(2000rmpX20min) ； (5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs); (6)吸出的白膜層用PBS CpH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用M孔板鋪板，細(xì)胞的濃度為IX 10 6/ml，每孔 Iml ； (8)第二天每孔加入50ug表位肽，同時(shí)設(shè)立PBS組作為陰性對照，PHA(10ug每孔)作為陽性對照。(9)第三天每孔加入50U IL-2，荷肽72h后收細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測IFN- γ 和IL-4表達(dá)情況。2. RT-PCR 實(shí)驗(yàn)
41)RNA的提取(1)將離心后的PBMCs，倒去培養(yǎng)液，室溫下不洗滌細(xì)胞直接加入Iml 裂解液，反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解；(2)將懸液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，室溫放置5 min，使核蛋白完全分離；(3)加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩15~30s，室溫靜置5min后，12000g，15min離心；(4)小心吸取上層水相移至新EP管中(共3層，避免吸取下面兩層)；(5)加等體積異丙醇，靜置10min，7500g，離心IOmin ； (6)棄上清，用75%乙醇洗滌，振蕩，混勻，12000g，離心 5min ;(7)棄上清，干燥 lOmin，加入 20~30μ 1，0. 01% DEPC 水溶解，55~60 "C (lOmin)，使之溶解。2)反轉(zhuǎn)錄過程
(1)在冰浴的試管中加入下列反應(yīng)混合物 總 RNA: (l~5yg)5μ 1
引物0lig0(dT) (0. 5μ g/μ 1) 1μ 1 無RNase去離子水，定容至 12 μ 1
(2)輕輕混勻后離心3巧s；
(3)反應(yīng)混合物在70°C水浴5min，然后離心34s ；
(4)將試管冰浴，再加入以下組分 5xReaction Buffer4 μ 1
RNase In hibiter (20U/μ 1) 1 μ 1
dNTP Mix (10 mmol/1)2 μ 1
M-MulvRT (20U/ul)1 μ 1 終體積為 20 μ 1
(5)反應(yīng)混合物42°C，水浴60min ；
(6)在70°C加熱lOmin，終結(jié)反應(yīng)，置冰上或冷凍保存(_20°C)。3)以cDNA為模板，應(yīng)用針對IFN-γ和IL-4的特異引物(引物見表1)，進(jìn)行PCR， 20ul 反應(yīng)體系:2XTaq PCR MasterMix 10 μ 1 ；上、下游引物各 0. 5 μ 1 ；cDNA 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1。PCR反應(yīng)參數(shù)如下
1.T=95. 0°C 0. 5min
2.T=94. 0°C30s
3.T=64. 0°C 40s -0. 7°C +0:00
R=3. 0°C /s + 0. O
4.T=72. 0°C
2
Imin REP 15 30s 0:00 Imin REP 20 IOmin
40s
5.GCTC
6.T=94. 0°C
7.T=53. 0°C
8.T=72. 0°C
9.Go to 6
10.T=72. 0°C
11.Hold on 16°C
結(jié)果見圖2與圖3，肌寸0 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，候選表位11^^102能夠誘導(dǎo)健康供者外周血 IFN-Y的表達(dá)。
表1 =IFN- γ和IL-4的特異引物
權(quán)利要求
1.一種Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽，其特征在于該多肽為16肽，其氨基酸序列為 Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Thl細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽為16肽，其氨基酸序列為Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。本發(fā)明還公開了Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽在制備Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，所述免疫調(diào)節(jié)劑為惡性腫瘤、哮喘等多肽類免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用免疫信息學(xué)手段，預(yù)測天然TLR2激動(dòng)劑HP-NAP最小功能結(jié)構(gòu)域，采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC/MS鑒定后，用體外細(xì)胞模型驗(yàn)證其對Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)功能。鑒定出的Th1細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)多肽序列未見文獻(xiàn)與專利報(bào)道，為基于Th1細(xì)胞因子調(diào)節(jié)為機(jī)理的免疫調(diào)節(jié)藥物研發(fā)提供了制備與篩選技術(shù)。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102516366SQ201210004099
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉鑫, 康巧珍, 李國棟, 李黎, 汲振余, 祁元明, 翟文杰, 高艷鋒 申請人:鄭州大學(xué)