專利名稱：一種重組墨吉明對蝦溶菌酶及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學制藥技術領域，具體的說是利用生物技術制備墨吉明對蝦溶菌酶的方法。本發明還涉及該方法制備出來的墨吉明對蝦溶菌酶的應用。
背景技術：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細菌細胞壁中粘多糖N-乙酚胞壁酸和N-乙酞葡萄糖胺之間的β _1，4糖苷鍵的水解，導致細胞裂解，內容物逸出而使細菌死亡，是一種很有效的廣譜性抗菌劑。近來的研究發現溶菌酶的殺菌活性并不僅因為其能夠溶解細菌的細胞壁，還因為其蛋白內部存在一個或多個雙親性的蛋白螺旋結構域，它們可以刺穿細菌的細胞膜，造成細菌的正常生理代謝發生紊亂直至死亡。溶菌酶蛋白分子經高溫變性后，雖然其水解細菌細胞壁能力喪失，但由于位于分子內部的雙親性的蛋白螺旋結構域暴露在外部，其抗菌能力反而更強了。另外，溶菌酶還有保護炎癥部位的正常組織作用、提高單核細胞吞噬外來病菌、抑制細菌內毒素釋放和抑制真菌和病毒等作用。它廣泛存在于自然界動植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機體的抗病性及免疫防御系統中發揮重要作用。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強劑和防腐劑目前廣泛應用于醫藥、食品及飼料等行業。需要特別指出的是，因為人和哺乳動物細胞是沒有細胞壁結構的，也不含有肽聚糖成分，故任何來源的溶菌酶對人和哺乳動物均無毒性作用。溶菌酶的應用領域包括以下幾個方面1)溶菌酶可以作為防腐劑。它本身是一種天然蛋白質，能被人體作為C和N源吸收代謝，且對人和哺乳動物無任何毒性，因此是一種安全性非常高的食品防腐劑；2)抗生素替代品。目前濫用抗生素帶來的問題也越來越受到人們的關注，一是耐藥性問題，二是藥物殘留問題，其副作用是不可忽視的，目前急需開發一種針對不同耐藥菌株均有效的“超級抗生素”用于醫學治療和養殖產業。溶菌酶是一種天然無毒的酶制品，它對人類及大部分水生動物和畜禽動物即是體內自身的免疫因子，增強動物機體的免疫力，又可作為醫療和養殖生產中的殺菌劑，降解和殺死常見的致病菌。所以，該溶菌酶可以代替抗生素應用于臨床治療和養殖生產中?；迷谑称?、飲料和化妝品中作為添加劑使用。溶菌酶集藥理、保健和防腐三個功能于一體，作為一種天然蛋白質無任何毒副作用。例如，食品中若加入溶菌酶， 可補充人體內的非特異性免疫因子，增強人體抗感染能力，殺死腸道內的腐敗病菌，維持腸道內菌群正?；?。若加入到化妝品中，可以治療由金黃色葡萄球菌、丙酸桿菌和螨蟲等引發的痤瘡和青春痘的治療。溶菌酶大體可分為3種類型C型、G型和噬菌體溶菌酶，它們在底物種類和殺菌活性方面存在著比較大的差異。迄今所發現的絕大部分的溶菌酶均屬C型(如人溶菌酶和雞蛋清溶菌酶)。目前生產上常用的溶菌酶都是從雞蛋清中制備的。但高等動物的C型溶菌酶普遍殺菌活性不高，抗菌譜也不夠廣，不能殺滅革蘭氏陰性細菌。來自低等動物一海洋甲殼類動物中提取的溶菌酶生物化學性質不同于人和雞蛋白溶菌酶。來自于海洋類甲殼類動物的溶菌酶很少受到溫度的影響，有很寬的適應范圍。與蛋清溶菌酶相比，它具有嗜低溫、抗氧化和殺菌譜廣的特點，能特異性地分解革蘭氏陽性和陰性菌的細胞壁形成溶菌現象，具有殺菌、防腐、抗病毒等功效，在醫藥、食品、飼料及化妝品等產業具有獨特優勢和廣闊的市場前景。目前溶菌酶主要從蛋清中提取，由于來源有限，生產工藝復雜，溶菌酶產量十分有限，價格居高不下，難以滿足越來越大的市場需求。因此用基因工程手段表達溶菌酶成為很重要的手段。前期的研究者利用RT-CR和RACE-PCR技術，從墨吉明對蝦 (Fenneropenaeus merguiensis)機體中克隆得到一種溶菌酶基因(GenBank :EU591712)； 并通過生物信息軟件分析得到關于其編碼產物的結構特點信息(“Molecular cloning, characterization, expression and antibacterial analysis of a lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis", Mol Biol Rep(2009)36 :1587-1595, DOI 10.1007/ sll033-008-9355-8。

發明內容
本發明目的在于提供一種利用生物技術制備墨吉明對蝦溶菌酶的方法及其應用。本發明提供一種重組墨吉明對蝦溶菌酶，是通過以下方法制備，將墨吉明對蝦溶菌酶基因(GenBank :EU591712)(序列如SEQ ID No. 1)連接到真核表達載體pPIC9K中構建重組質粒，并將所形成的重組質粒轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經甲醇誘導表達，然后經分子篩層析柱純化后得到重組溶菌酶。所述的重組溶菌酶可作為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的抑菌劑。所述方法的具體操作步驟是1)重組fLysC質粒的構建從新鮮墨吉明對蝦中取出墨吉明對蝦腸組織，提取總RNA，并通過反轉錄PCR擴增墨吉明對蝦溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8進行PCR擴增。PCR產物純化后與真核表達載體pPIC9K分別用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，將這二片段于室溫用T4連接酶連接2-8小時，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為重組fLysC質粒。2)溶菌酶的表達與制備將重組質粒DNA用Bglll酶解，用電擊法將質粒DNA轉化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨芐青霉素LB固體培養基上培養上，篩選轉化子即為GS115/fLysC，將選出的高拷貝轉化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養基中繼續培養，觀察不同菌株對溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的重組菌株。3)重組墨吉明對蝦溶菌酶的濃縮純化將重組酵母菌株先在BMGY液體培養基中， 30°C搖瓶培養，250轉/分鐘；當OD值達到8. O士0. 5時，更換培養基，用原培養物10%體積的BMMY培養基，繼續培養；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0. 3% (ν/ν)，4天后結束培養， 離心收集培養液上清；將該培養液上清經過硫酸銨飽和沉淀然后透析去除多余硫酸銨，再經過s印hadeX-G75分子篩層析柱洗脫，用0. 05M pH8. OTris-HCI連續洗脫，然后將洗脫液在凍干機上凍干，得到重組溶菌酶干粉。所述步驟1)中PCR使用特異性引物FM-7和FM_8，引物兩端分別引入EcoRI和 Notl限制性酶切位點FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'
FM-8 5，—AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3，本發明還提供了上述重組墨吉明對蝦溶菌酶在制備抑菌劑中的應用。所述的溶菌酶可作為作為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的抑菌劑。對由上述方法制得的重組墨吉明對蝦溶菌酶進行了相關的生物學活性分析，發現該酶具有很強的廣譜抗菌作用，對常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、痢疾志賀氏菌、 副溶血弧菌、創傷弧菌、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌均具有明顯的抑菌作用，尤其是對臨床醫療和養殖生產中常見的致病細菌和弧菌殺菌力極強。并且發現該重組墨吉明對蝦溶菌酶比直接從對蝦組織中提取的溶菌酶活性提高了 35% ；與雞蛋清溶菌酶相比，抑菌譜范圍要廣很多，尤其對于雞蛋清溶菌酶不能作用的革蘭氏陰性菌抑菌效果更明
Mo本發明具有如下優點1.穩定表達。本發明的酵母表達系統可以穩定高效地表達溶菌酶。2.本發明的生產制備方法采用該基因工程菌生產溶菌酶適合大規模培養和分離提取，生產工藝不復雜，設備要求簡單，生產周期短，成本比較低，無環境污染。3.廣譜、高效抑菌作用。本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌，因而可以用于防控細菌性疾病。


圖1是實施例1中制得的重組墨吉明對蝦溶菌酶干粉的SDS-PAGE檢測結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法1.質粒提取、DNA (PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆采用“TAKARA生物科技(大連)有限公司”的相應試劑盒。2.大腸桿菌轉化用 Hanaha 方法(Sambrook and Resell :Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)酵母轉化按 hvitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Resell :Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 20013.所有限制性內切酶和鏈接酶均購自“紐英倫生物技術有限公司”，北京。4. pPIC9K 購于 Invitrogen 公司(Catalog no. V17520)實施例1 重組墨吉明對蝦溶菌酶的制備步驟1 質粒fLysC的構建從新鮮墨吉明對蝦中取出墨吉明對蝦腸組織，用TRIZOL REAGENT (Invitrogen)試劑從中提取總RNA ；用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)擴增墨吉明對蝦溶菌酶的cDNA。 根據己知不同生物種類的溶菌酶基因的序列，設計簡并引物，序列如下FM-I :5，-GCTGCATTCGAGAAATG-3，(SEQ ID N0. 2)
FM-2 :5，-AGATTTGCAGGCTTGTCACC-3，(SEQ ID NO. 3)。首先進行反轉錄反應，條件為53°C，30min;在進行PCR擴增，反應條件為94°C， 2min ；94°C，30s ；45°C, 30s ；72°C，Imin 循環 5 次；接著 94°C, 30s ；55°C, 30s ；72°C，lmin 循環25次。將PCR產物回收，并將其連接到載體pMDIS-T上，在大腸桿菌感受態細胞(DH5a) 中表達，通過藍白斑篩選帶有目的基因的質粒，提取的質粒產物經測序檢測為溶菌酶cDNA 序列，如 SEQ ID NO. 1。參照克隆得到的墨吉明對蝦溶菌酶。DNA設計一對用于真核表達的特異性引物 FM-7和FM-8，引物兩端分別引入EcoRI和Notl限制性酶切位點。FM-7 5' —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3，(SEQ ID NO. 4)FM-8 5‘ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3' (SEQ ID NO. 5)用TAKARA onestep RNA PCR Kit (AMV)進行 RT_PCR。PCR循環參數為50°C30min， 94°C 2min ；94°C 30s, 45 °C 30s, 72 °C lmin，5 個循環；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，30 個循環；最后72°C延伸lOmin。經PCR產物凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，用EcoR工和 Notl酶切擴增產物，與經同樣酶酶切的酵母表達載體PPIC9K相連接。篩選重組質粒。步驟2 重組溶菌酶的轉化和表達提取質粒DNA，用BglII酶解質粒DNA，用電擊法將質粒DNA轉化至感受態酵母菌 GSl 15中，并涂布于RDB固體培養板上，置30°C中培養2_3天至轉化重組子出現。將長出的單菌落(重組子)分別點種MM平板和MD平板，進一步篩選在MD平板上生長正常，但在MM 平板上生長緩慢的轉化子，得到高拷貝的轉化菌株。將此類酵母菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養基中，30°C培養4天左右，觀察不同菌株對溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的墨吉明對蝦溶菌酶表達菌株。步驟3 重組墨吉明對蝦溶菌酶的濃縮純化含墨吉明對蝦溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液體培養基中，30°C搖瓶培養， 250轉/分鐘。當OD值達到8. 0士0. 5左右時，更換培養基，用原培養物1/10體積的BMMY 培養基，繼續培養。每24h添加甲醇，保持甲醇濃度在0. 3%，4天后結束培養，5000rpm4°C 離心10分鐘，收集培養液上清，用于墨吉明對蝦溶菌酶的純化制備。取培養液上清，在其中分別加入固體硫酸銨至飽和度達80%，在室溫下攪拌 1小時，然后5000rpm室溫下離心20分鐘，收集沉淀，將沉淀重新懸浮在IOml 0. 05M pH8. OTris-HCl緩沖液中，并轉移至透析袋中，在1L0. 05M pH8. OTris-HCl透析以去除剩余的硫酸銨，4°C透析Mh，期間更換3次外透析液。透析過的培養上清用0. 45 μ m的濾膜過濾， 然后用s印hadeX-G75分子篩凝膠柱進行進一步純化，所使用的柱體積為80x1. 5cm。上樣結束后，用0.05M pH8. OTris-HCl洗脫未結合蛋白，共洗脫4個柱床體積。用含有0. INaCI 的0.05M pH8. OTris-Hcl溶液洗脫。將透析過的洗脫液在凍干機上凍干，得到重組墨吉明對蝦溶菌酶干粉；12% SDS-PAGE鑒定蛋白質，發現其蛋白純度可達99%以上，結果如附圖1 所示。此外，溶菌酶重組蛋白經過硫酸銨、透析和柱層析等長時間處理后，其殺菌活性未受到任何損失。實施例2 重組墨吉明對蝦溶菌酶活性測定采用濁度法測定上述制得的溶菌酶活性用60mM、pH6. 2的磷酸緩沖液配制-定濁度(A450 = 0. 6-0. 7)的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)為底物，取 0. ImL 酶液加入2. 5mL底物(20°C )中，在波長450nm處讀取反應體系^iin內每隔15s的吸光度。 以ΔΑ45(1/π η變化0.001個吸光度值為一個活性單位。酶活力=Δ A450nm/Imin X 0. OOlX 0. ImL(ΔA450nm Imin內吸光度的變化)。在不同的溫度和ρΗ條件下，對重組墨吉明對蝦溶菌酶進行了生物學分析。最適作用ρΗ值為6. 6，最適作用溫度為34°C -46°C。重組墨吉明對蝦溶菌酶酶活力為56U/mg ；同樣方法測定直接從對蝦組織中提取的溶菌酶酶活力為42U/mg，前者比后者酶活性提高了 35. 5%。實施例3 重組墨吉明對蝦溶菌酶殺菌譜的測定采用管碟法測定重組墨吉明對蝦溶菌酶的抑菌圈大小，以其半徑(IOmm)來表示。取革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),溶血性鏈球菌(Streptoccus hemolyticus),以及革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)， 副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)，創傷弧菌(Vibrio vulnificus)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila),粘質沙雷氏菌 (Serratia marcescens)，并將這些細菌在LB液體培養基中37°C，200r/min過夜培養，稀釋至0D600為0. 001左右。取IOOul以上所選菌液于牛肉膏蛋白脈培養基中涂勻后，放入無菌牛津杯，于牛津杯中加入重組墨吉明對蝦溶菌酶酶液100 μ L(蛋白含量約10 μ g)，370C 過夜培養，測量抑菌圈。取重組墨吉明對蝦溶菌酶和雞蛋清溶菌酶(做對照)，測定兩個樣品對10種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌圈大小。結果如表1所示表 權利要求
1.一種重組墨吉明對蝦溶菌酶，其特征在于通過下述方法制備將墨吉明對蝦溶菌酶基因連接到真核表達載體PPIC9K中構建重組質粒，并將所形成的重組質粒轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經甲醇誘導表達，然后經分子篩層析柱純化后得到重組溶菌酶。
2.如權利要求1所述的重組溶菌酶，其特征在于具體的制備步驟是1)重組《^《質粒的構建從新鮮墨吉明對蝦中取出墨吉明對蝦腸組織，提取總RNA，并通過反轉錄PCR擴增墨吉明對蝦溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8進行PCR擴增；PCR產物純化后與真核表達載體 PPIC9K分別用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，將這二片段于室溫用T4連接酶連接2_8 小時，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為重組fLysC質粒；所述 FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'FM-8 :5’ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3'；2)溶菌酶的表達與制備將重組fLysC質粒DNA用Bglll酶解，用電擊法將質粒DNA轉化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨芐青霉素LB固體培養基上培養上，篩選轉化子即為GS115/fLysC，將選出的高拷貝轉化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養基中繼續培養，篩選含墨吉明對蝦溶菌酶基因的重組酵母菌株；3)重組墨吉明對蝦溶菌酶的濃縮純化將重組酵母菌株先在BMGY液體培養基中，30°C 搖瓶培養，250轉/分鐘；當OD值達到8. O 士 0. 5時，更換培養基，用原培養物10%體積的 BMMY培養基，繼續培養；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0. 3% (ν/ν)，4天后結束培養，離心收集培養液上清；將該培養液上清經過硫酸銨飽和沉淀然后透析去除多余硫酸銨，再經過 sephadex-G75分子篩層析柱洗脫，用0. 05M pH8. O Tris-HCI連續洗脫，然后將洗脫液在凍干機上凍干，得到重組溶菌酶干粉。
3.—種重組墨吉明對蝦溶菌酶的制備方法，其特征在于該方法是將墨吉明對蝦溶菌酶基因連接到真核表達載體PPIC9K中構建重組質粒，并將所形成的重組質粒轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經甲醇誘導表達，然后經分子篩層析柱純化后得到重組溶菌酶。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)重組fLysC質粒的構建從新鮮墨吉明對蝦中取出墨吉明對蝦腸組織，提取總RNA，并通過反轉錄PCR擴增墨吉明對蝦溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8進行PCR擴增；PCR產物純化后與真核表達載體 PPIC9K分別用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，將這二片段于室溫用T4連接酶連接2_8 小時，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為重組fLysC質粒；所述 FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'FM-8 :5’ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3'；2)溶菌酶的表達與制備將重組fLysC質粒DNA用Bglll酶解，用電擊法將質粒DNA轉化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨芐青霉素LB固體培養基上培養上，篩選轉化子即為GS115/fLysC，將選出的高拷貝轉化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養基中繼續培養，篩選含墨吉明對蝦溶菌酶基因的重組酵母菌株；3)重組墨吉明對蝦溶菌酶的濃縮純化將重組酵母菌株先在BMGY液體培養基中，30°C搖瓶培養，250轉/分鐘；當OD值達到8. 0 士 0. 5時，更換培養基，用原培養物10%體積的 BMMY培養基，繼續培養；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0. 3% (ν/ν)，4天后結束培養，離心收集培養液上清；將該培養液上清經過硫酸銨飽和沉淀然后透析去除多余硫酸銨，再經過 sephadex-G75分子篩層析柱洗脫，用0. 05M pH8. 0 Tris-HCI連續洗脫，然后將洗脫液在凍干機上凍干，得到重組溶菌酶干粉。
5.一種權利要求1所述的重組墨吉明對蝦溶菌酶作為抑菌劑的應用。
6.按照權利要求5所述的應用，其特征在于是作為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的抑菌劑的應用。
7.按照權利要求5所述的溶菌酶的應用，其特征在于作為金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、痢疾志賀氏菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌的抑菌劑的應用。
全文摘要
一種高殺菌活力溶菌酶的制備方法及其應用。該方法是將墨吉明對蝦溶菌酶基因(SEQIDNo.1)連接到真核表達載體pPIC9K中構建重組質粒，并將所形成的重組質粒轉化畢赤酵母GS115，對轉化子進行甲醇誘導表達，收集上清，經分子篩層析柱純化后得到對蝦溶菌酶。本發明的酵母表達工藝可以穩定高效地生產溶菌酶，制備工藝不復雜，設備要求簡單，生產周期短，成本比較低，無環境污染。所制得的對蝦溶菌酶比直接從對蝦組織中提取的溶菌酶活性提高了35%，對多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌均具有高效殺菌作用，因此可以廣泛應用在醫藥、食品、農業和化妝品等行業。
文檔編號A61K38/47GK102433314SQ201210005020
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者周亞竟, 李國輝, 祈增華, 陳克平, 陳慧卿, 陳焰, 麥維軍 申請人:江蘇大學