專利名稱：一種酶法制備高活性低分子量肝素的方法
技術領域：
本發明涉及ー種酶法制備高活性低分子量肝素的方法。屬生物醫藥領域。
背景技術：
肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以I — 4糖苷鍵交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之間，平均分子量為15000Da ；肝素作為抗凝試劑和抗栓試劑已有60多年的歷史。肝素的抗凝血活性主要通過含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心結合抗凝血酶(AT- III)，誘導其發生構象改變，從而先是抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor II a)。抗凝血活性還和甘肅的分子量有夫。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用會引起出血和誘導性血小板減少、骨質疏松等副作用，從而大大的限制了肝素在臨床上的應用。此外，肝素肝素還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調血脂等方面的生活功能。低分子量肝素是由肝素通過化學法或酶法降解得到的小分子片段，分子量在3000-8000Da之間，平均分子量約為5000Da。低分子量肝素具有較高的抗栓活性，其抗凝活性則大大降低，表現出抗血栓形成時對凝血系統影響小，因而在臨床中得到廣泛的應用。與未分級肝素相比，低分子量肝素具有分子量小，按體重給藥，藥理學性質穩定，不需住院治療，生物利用度高，副作用小，體內半衰期長等優點。目前，LMWHs的制備方法(張萬忠，王云山，馬潤宇，蘇志國，生化藥物雜志，2001，22(1) 48-51)主要有化學裂解法和酶降解法。化學降解法是エ業上常采用的方法，主要有亞硝酸將揭發、β -消除降解法、過氧化氫降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和Y _照射法等。但是化學降解法肝素反應劇烈，使得肝素分子中的某些功能基團在反映過程中或多或少被破壞，因而某些生物活性功能在不同程度被破壞。而酶法降解由于反應條件溫和、對環境友好，且便于檢測，成為進年來的研究熱點。美國專利(Nielsen，US5106734,1992)利用控制232nm處吸光值對肝素控制性降解，制備出分子量相對均以的低分子量產品。于廣利等(于廣利，王群，管華詩，徐家敏，Robertム1^111^"仏青島海洋大學學報，2002，32(2)231-235)利用肝素酶對牛肺肝素進行控制酶解，得到聚合度2-20的寡糖純品。主要此外研究還表明，肝素的抗凝血活性取決于其戊糖活性中心的數量。戊糖結構中N-，6-0-及3-0-位硫酸基參與結合AT- III，與抗凝血活性有夫，而2-0-位硫酸基和艾杜糖醛酸的作用尚不清楚(I. Capila, R. J. Linhardt, Angew. Chem. Int. Ed. ,2002,41 :390-412.) 其中3-0-位硫酸基尤為重要如果缺少3-0-位硫酸基，噶怒視的抗凝血活性則會降低1000倍以上；相反，増加ー個3-0-位硫酸基，則可以將肝素的抗凝血活性提高數倍。肝素由多種生物合成酶在線粒體內合成。合成過程中會涉及多種合成酶,如2-0_，6-0-，3-0_硫酸基轉移酶(2-0ST，6-0ST，3-0ST)分別對主鏈不同位置上的羥基進行部分硫酸化(U. Lindahl， M.Kusche-Gullberg, L. kjellen, J. Biol. Chem,1998,273 :24979-24982.)，其中 3-0-位硫酸化由3-0ST完成。這些硫酸基轉移酶大多具有多種異構型式，如3-0ST就具有六種異構體。其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中心。現有研究表明肝素及低分子量肝素都是 3-0ST-1 和 3-0ST-5 很好的底物(J. Chen, M. B. Duncan, K. Carrick et.，Glycobiology, 2003，13 :785-794)。因此，用3-0ST-1和3-0ST-5對低分子量肝素選擇性修飾，使80%不具有戊糖活性中心的低分子量肝素經過反映后擁有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的數量，從而提高其抗凝血活性(理論上可以同時提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。

發明內容
本發明的目的是提供ー種酶法制備高抗凝血活性低分子量肝素的方法本發明所提供的制備高抗凝血活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用HepI (組氨酸標簽肝素酶I)控制性降解后，再采用PAPS (3’ -磷酸腺苷-5’ -磷酸硫酸)再生系統，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶對其進行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。本發明方法所采用的HepI、3-0-硫酸基轉移酶、 AST- IV均可通過高密度發酵制備；所述PAPS再生系統，以PNPS (對硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應的硫酸基供體，極大地降低了生產成本。本發明為高活性低分子量肝素的酶法エ業化提供了新的途徑。所述肝素是市售的未分級肝素。所述方法中，肝素初始為濃度1-lOOmg/mL ;優選50mg/mL。所述方法中，肝素酶I的用量O. Ι-lOIU/g肝素，優選3IU/g肝素。所述方法中，肝素酶解反應液為25mM醋酸銨，25 μ MCaCl2,0. 25 μ g/mLBSA, pH7. 4的 Digestion buffer 緩沖液。所述PAPS 再生系統中，反應液為含 I % Triton X-100,1% BSA7ImM MgCL2, ImMMnCL2, pH 為 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCL 緩沖液。所述PAPS再生系統中，PNPS的濃度為O. I-IOmM, PAP的濃度為O. l_50uM。所述方法中，AST-IV的用量為 O. l-50mg/mL ;優選 5-lOmg/mL。所述方法中，肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶的用量為O. l-50mg/mg底物；優選 l_20mg/mL 底物。所述方法中，反應溫度為10_40°C，優選30_40°C。所述方法中，酶促反應的時間為1-20小時，優選5-10小時。所述方法中，按照以下方法純化低分子量肝素終止反應后，離心分離得到上清液，將此上清液與兩倍提及的緩沖液A混合，對DEAE柱上樣；依次以緩沖液A和緩沖液B進行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素；所述DEAE分離所用的緩沖液A為喊質量百分含量為O. 5-2. 5%的NaCL水溶液，緩沖液B為含質量百分含量為
2.5-5. 0%的 NaCL 水溶液。本發明的方法采用具有高效酶活性的肝素酶I和肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶制備高抗凝血活性低分子量肝素。重組的ifepl、AST- IV及3-0ST-1均可通過高密度發酵高產量獲得，且均攜帯6個組氨酸標簽，一步純化就可得到90%以上的蛋白酶。利用AST- IV對PNPS以及PAP的雙底物進行硫酸基酶促反應，實現了 PNPS的再生系統，從而可以使用極為廉價的PNPS作為硫酸基供體，降低了高抗凝血活性低分子量肝素的成本。本發明通過控制HepI反應條件和作用時間，得到分子量分布范圍窄的低分子量肝素(平均分子量5500)。再以用3-OST-1對其進行選擇性修飾，得到了高抗凝血活性的低分子量肝(抗凝血活性比現有低分子量肝素提高3-5倍)，具有巨大的エ業應用價值。
具體實施例方式下述實施例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例I、PAPS再生系統PAPS再生系統組分濃度為PNPS的濃度為5mM，PAP的濃度為20uM ；PAPS再生系統中451'-1￥的用量為101^/禮PAPS0按以上組成所制備的溶液加入制備高活性低分子量肝素的溶液，作為肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶修飾反應的硫酸基供體。實施例2、工具酶H印I、AST- IV及3-0ST-1的制備I、重組大腸桿菌的搖瓶表達分別挑取H印I、AST- IV及3-0ST-1重組菌株單菌落于IOmL LB培養基中，每IOmL培養基中加入10 μ L氨芐青霉素(50mg/mL，終濃度為50 μ g/mL)，37°C，200rpm培養過夜。然后按I : 100接種量，取4mL菌液接種至400mL LB中，加入400 μ L卡那霉素。37°C，200rpm。大約4h，其OD 600大約到達O. 6至O. 8之間，加入誘導劑IPTG 2mL(0. 2M，使其終濃度為ImM)，22°C，200rpm,誘導12h。將上述培養物于8000rpm，4°C，離心lOmin，收集菌體，用預冷 4°C 的 BufferA(25mM Tris, O. 5M NaCl，IOmM 咪唑，pH 7. 4)重懸至 20mL，冰浴超聲，條件為400W，工作5s，間歇10s，200個循環。超聲破碎充分后，菌液變得澄清，12000rpm,4°C，離心30min，收集上清液，得粗酶液。2, HepI, AST- IV及 3-0ST-1 工具酶的ー步純化用Buffer A緩沖液平衡柱子后，將粗酶液透過O. 45um濾膜過濾后上柱，上清液以
O.7mL/min 的速度通過 Ni-NTA Agarose Fast Flow 柱子，結合 30min 后，Buffer A 沖柱子5-10 個柱體積，最后用 Buffer B(25mM Tris,0. 5M NaCl，250mM 咪唑，pH 7. 4)洗脫收集酶活性部分，然后測算酶活。實施例3、低分子量肝素寡糖的制備以上海生エ技術服務公司的未分級肝素為原料，反映條件為IOmg未分級肝素溶解在ImL的反應液中，30°C振蕩(300)反應。反應液包含50mg/mL的肝素，25mM醋酸銨，25 μ MCaCl2,0. 25 μ g/mL BSA，3IU/g 肝素，pH 7.4。A232 至 80 左右，100°C下加熱反應液 5分鐘終止反應，PlO柱子分離純化得到分子量在3000-8000的肝素寡糖溶液，透析脫鹽后凍干。 實施例4、肝素的3-0-位的選擇性硫酸化修飾 以酶解得到的肝素寡糖為原料，反映條件為Img肝素寡糖溶解在20mL反應液中于室溫振蕩(300)反應 6h。反應液包含 50mM 的 Tris-HCl (pH 7. 2), I % Triton X-100,1 %BSA, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM PNPS，40uM PAP，8mg 3-0ST-1 及 4mgAST_ IV。100°C下加熱反應5分鐘終止反應,分離得到上清液,將上清液雨量被提及的2. 0%的NaCl水溶液混合，對DEAE柱上樣；ー次以2. 0%的NaCL水溶液和3. 0%的NaCl水溶液進行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素。所得溶液用去離子水透析 24小吋，凍干得高活性低分子量肝素凍干粉。
權利要求
1.一種制備高抗凝活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用HepI (組氨酸標簽肝素酶I)控制性降解肝素，得到低分子量肝素，再采用PAPS (3磷酸腺苷-5’ -磷酸硫酸)再生系統，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶對其進行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。
2.根據權利要求I所述方法，其特點在于所述組氨酸標簽肝素酶I制備方法如下將重組質粒pET-15b-H印I轉化大腸桿菌BL21，得到可溶性表達H印I的工程菌，培養工程菌BL21 (pET-15b-H印I)，誘導表達，得到C端攜帶6個組氨酸標簽的H印I。
3.根據權利要求I所述方法，其特點在于所述肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶是攜帶6個組氨酸標簽的融合蛋白。
4.根據權利要求I所述方法，其特點在于所述肝素濃度l-100mg/mL，優選10_50mg/mL ;肝素酶I的用量0. l-10IU/g肝素，優選3IU/g肝素；所述用于降解肝素的反應液為25mM 醋酸銨，25 u MCaCl2,0. 25 u g/mL BSA, pH7. 4 的 Digestion buffer 緩沖液，反應溫度為 10-40°C，優選 30-40°C。
5.根據權利要求I所述方法，其特點在于所述PAPS再生系統中，反應液為含I%Triton X-100,1%BSA, ImM MgCI2, ImM MnCI2, pH為 5. 0-8. 0 的 50mM Tris-HCI 緩沖液，PNPS的濃度為 0. I-IOmM, PAP 的濃度為 0. l-50uM, AST- IV的用量為 0. l_50mg/mL，優選 5-lOmg/mL ;所述方法中，3-0-硫酸基轉移酶的用量為0. l-50mg/mg底物，優選l_20mg/mL底物，反應溫度為10-40°C，優選30-40°C，酶促反應的時間為1-20小時，優選5_10小時。
全文摘要
本發明公開了一種酶法制備高活性低分子量肝素的方法。本發明制備高活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，用HepI(組氨酸標簽肝素酶I)控制性降解后，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系統，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基轉移酶對其進行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。本發明方法所采用的HepI、3-O-硫酸基轉移酶、AST-Ⅳ可通過高密度發酵高產量制備；所述PAPS再生系統，以PNPS(對硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應的硫酸基供體，極大地降低了生產成本。本發明為高活性低分子量肝素的酶法工業化提供了新的途徑。
文檔編號C12P19/04GK102660610SQ201210172930
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者劉衛超, 張頔, 王敏, 王蘊聰, 陳敬華 申請人:江南大學