專利名稱：一種間日瘧紅內期疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種間日瘧紅內期疫苗及其制備方法，尤其涉及間日瘧紅內期疫苗制備中的重組質粒和重組病毒的制備，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
自1907年Laveran A發現瘧疾的病原體和Ross R發現瘧疾的傳播媒介以來，人們與這種疾病的斗爭已進行了一個多世紀。迄今為止，瘧疾仍然是一種嚴重威脅人類健康和生命的寄生蟲病。據世界衛生組織2008年全球瘧疾報告報道，2008年全球有2. 43億臨床病例，86. 3萬人因瘧疾死亡。由于瘧原蟲及蚊煤抗藥性的產生和迅速擴散，瘧疾的藥物防治面臨困境，因此，研制新型、高效、安全的瘧疾疫苗成為當前的迫切需要。目前瘧疾疫苗主要有紅內期疫苗、紅外期疫苗和傳播阻斷疫苗三種。在紅內期瘧原蟲中，由于裂殖子存在于細胞外，與宿主免疫系統直接接觸，因此這一時期原蟲已成為紅內期疫苗的主要靶點。裂殖子入侵宿主細胞是個相當復雜的過程，并由受體和配體介導。推測有多個瘧原蟲蛋白質參與該入侵過程，這些蛋白包括位于裂殖子表面的蛋白質、培養上清中可溶性蛋白質以及位于棒狀體或微線體中的蛋白質，目前研究認為MSI^s是瘧疾疫苗研究靶點。長期以來，人們都把研究重點放在惡性瘧的研究上，極少有人關注間日瘧的研究。雖然在全球范圍內惡性瘧原蟲引起的死亡人數比較多，但是間日瘧原蟲也是不容忽視的影響人們生活質量和經濟生產力的原因之一。研究表明，間日瘧裂殖子表面蛋白 4(PvMSP4)在195個病毒株中的序列只有很少的不同，而且這些不同僅存在于兩個重復序列結構中[Chaturong Putaporntip, Somchai Jongwutiwes, Liwang Cui. Limited Global Diversity of the Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein 4 Gene. Infect Genet Evo 1. 2009 September ； 9(5) : 821 - 826·]。桿狀病毒表面展示系統是近幾年發展起來的一種新的真核展示系統，通過在桿狀病毒囊膜糖蛋白gp64插入外源蛋白，二者融合表達或與特異性的錨定部位結合，將外源蛋白展示在重組桿狀病毒的表面，通過篩選表達特異蛋白的重組桿狀病毒粒子得到外源蛋白，可用來展示需糖基化、二硫鍵異構化等翻譯后修飾才表現功能活性的復雜真核蛋白及構建多肽文庫、抗體庫等。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種間日瘧疾紅內期疫苗，能夠對間日瘧原蟲的攻擊感染提供免疫保護。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種家蠶重組桿狀病毒angp64-PvMSP4，該病毒于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5605。
上述重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的制備方法，包括以下步驟
(1)基因PvMSP4(間日瘧裂殖子表面蛋白4的編碼基因)的獲得為了去除基因中的內含子，根據NCBI上PvMSP4基因序列(基因登錄號GQ912373. 1)設計兩對引物，所述PvMSP4基因序列由中間的一個內含子將其分成外顯子1和外顯子2，利用外顯子1的下游引物和外顯子2的上游引物引入相同的I酶切位點，基因序列由GGTAGC轉變成 GGATCC，但是編碼的氨基酸序列不變；以間日瘧原蟲IV159病毒株的基因組DNA為模板，通過PCR擴增兩段基因后分別進行雙酶切，并用連接酶連接后作為模板，利用外顯子1的上游引物和外顯子2的下游引物PCR擴增獲得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
(2)重組供體質粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4的構建將步驟(1)經PCR所得完整的 PvMSP4基因(全基因)插入桿狀病毒表面展示載體pFastBaCI-gp64中，轉化大腸桿菌TGl 感受態細胞，挑斑提取重組供體質粒pFaStBacI-gp64-PvMSP4，并用PCR和雙酶切進行鑒定；
(3)重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的獲得與鑒定將步驟O)鑒定成功的重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，通過轉座方式進行藍白斑篩選，抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物PCR進行鑒定；將鑒定成功的重組桿狀病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，待細胞發病后收集第一代重組病毒懸液 0-4°C保存，提取病毒基因組并用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒 Bmgp64-PvMSP4。進一步地，上述步驟(1)中外顯子1的上游引物含feoR I，外顯子2的下游引物 isxho I ；且外顯子1、外顯子2、外顯子1的上游引物、外顯子1的下游引物、外顯子2的上游引物、外顯子2的下游引物的序列分別如SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 所示。進一步地，所述步驟( 中桿狀病毒表面展示載體pFaStBaCI-gp64由PCR擴增得到的桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列、桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至轉移載體PFastBacI中獲得。本發明還提供上述重組桿狀病毒angp64-PvMSP4表達的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 11 所示。上述蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)將上述重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；
(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲和蠶蛹；
(3)收集表達的上述蛋白。本發明進一步提供上述家蠶重組桿狀病毒angp64-PvMSP4在制備間日瘧紅內期疫苗中的應用。本發明還提供一種多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟
(1)基因PvMSP4(間日瘧裂殖子表面蛋白4的編碼基因)的獲得為了去除基因中的內含子，根據NCBI上PvMSP4基因序列(基因登錄號GQ912373. 1)設計兩對引物，所述 PvMSP4基因序列由中間的一個內含子將其分成兩個外顯子1和外顯子2，利用外顯子1 (SEQ ID NO 1)的下游引物(SEQ ID NO 4)和外顯子2(SEQ ID NO 2)的上游引物(SEQ ID NO 5)引入相同的BmM I酶切位點，基因序列由GGTAGC轉變成GGATCC，但是編碼的氨基酸序列不變；以間日瘧原蟲IV159病毒株基因組DNA為模板，通過PCR擴增兩段基因后分別進行雙酶切，并用連接酶連接后作為模板，利用外顯子1的上游引物(含I)和外顯子2 的下游引物(含損ο I)PCR擴增獲得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；
(2)重組質粒pGEX-4T-l-PvMSP4，的構建為了保證目的蛋白表達，設計引物 R' (exon2) (SEQ ID NO. 7)，去掉基因序列上的GPI序列，以步驟(1)得到的基因PvMSP4為模板，以序列號為SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 7的引物為上下游引物，經PCR擴增得到無GPI 的PvMSP4基因(以下簡稱為PvMSP4，)，將其與pGEX-4T-l載體同時經^boRI/IAoI雙酶切， 將酶切回收的片段用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單菌落搖菌培養后提取重組質粒pGEX-4T-l-PvMSP4，，利用PCR和雙酶切進行鑒定；
(3)大腸桿菌中表達蛋白PvMSP4’的誘導表達、純化與多克隆抗體制備將步驟(2)鑒定成功的重組質粒pGEX-4T-l-PvMSP4，轉化大腸桿菌Rosetta感受態細胞，加IPTG誘導表達，利用GST親和層析純化目的蛋白，純化出的蛋白免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體。本發明還提供上述多克隆抗體在重組桿狀病毒angp64-PvMSP4表達和鑒定中的應用。本發明實現的技術效果如下
利用家蠶幼蟲、蛹作為生物反應器，家蠶桿狀病毒表達系統高效表達具有極高臨床應用價值間日瘧疾疫苗的方法，通過將gp64蛋白的N端信號肽和近C端跨膜區與PvMSP4基因融合表達并展示在桿狀病毒囊膜表面，形成一個帶外源病毒抗原的偽病毒，該偽病毒具有外源病毒的抗原性，可以作為基因工程疫苗，間日瘧疾疫苗尚無利用桿狀病毒表面展示技術生產，且家蠶桿狀病毒表達系統是真核表達，具有翻譯后修飾功能。由于家蠶蛹中蛋白對人體無毒性，以蠶蛹為生物反應器生產的基因工程疫苗對人體產生副作用小，且本方法適用于大規模生產，生產成本低。


圖1是本發明中提供的PvMSP4基因的結構，圖中顯示該基因由兩個外顯子和一個內含子組成，上面標示出了 GPI的位置；
圖2是本發明重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4的構建示意圖。
具體實施例方式以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。下面結合實施例詳細闡述本發明的具體內容。實施例1 基因PvMSP4的獲得
為了去除基因中的內含子，根據NCBI上PvMSP4的序列(基因登錄號GQ912373. 1)設計兩對引物，所述PvMSP4基因序列由中間的一個內含子將其分成外顯子1和外顯子2(如圖1所示)，利用在外顯子子1的下游和外顯子2的上游引入相同的I酶切位點，基因序列由GGTAGC轉變成GGATCC，但是編碼的氨基酸序列不變；分別以引物F(exonl) ,R(exon 1)和F(exon 2)、R(exon 2)[即，F(外顯子1)、R(外顯子1)、F(外顯子2)、R(外顯子2)]， 以間日瘧基因組DNA為模板，進行PCR擴增，引物序列如下F(exonl) 5，-ATAGAATTCGCCTTCGCGGGCATT-3，{EcoR I 酶切位點) R(exon 1): 5' -CGCGGATCCTGGAGTGCTATTCTGC-3 {Bam H I 酶切位點) F(exon2) : 5，-ATAGGATCCGGAGGCCAAACGGGT-3，{Bam H I 酶切位點) R(exon 2) : 5' -CCGCTCGAGATTTATGGAAGCCAAAAC-3' {Xhol 酶切位點) 具體程序和反應體系如下 反應程序
權利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒angp64-PvMSP4，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5605。
2.—種權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)PvMSP4基因的獲得根據NCBI上基因登錄號為GQ912373. 1的PvMSP4基因序列設計兩對引物，所述PvMSP4基因序列由中間的一個內含子將其分成外顯子1和外顯子2， 利用外顯子1的下游引物和外顯子2的上游引物引入相同的I酶切位點，基因序列由GGTAGC轉變成GGATCC，但是編碼的氨基酸序列不變；以間日瘧原蟲IV159病毒株的基因組DNA為模板，通過PCR擴增兩段基因后分別進行雙酶切，并用連接酶連接后作為模板，利用外顯子1的上游引物和外顯子2的下游引物PCR擴增獲得基因PvMSP4，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 8 所示；(2)重組供體質粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4的構建將步驟(1)經PCR所得完整的 PvMSP4基因插入桿狀病毒表面展示載體pFastBaCI-gp64中，轉化大腸桿菌TGl感受態細胞，挑斑提取重組供體質粒pFastBaCI-gp64-PVMSP4，并用PCR和雙酶切進行鑒定；(3)重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的獲得與鑒定將步驟O)鑒定成功的重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，通過轉座方式進行藍白斑篩選，抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物PCR進行鑒定；將鑒定成功的重組桿狀病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，待細胞發病后收集第一代重組病毒懸液 0-4°C保存，提取病毒基因組并用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒 Bmgp64-PvMSP4。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中外顯子1的上游引物含feoR I，外顯子2的下游引物含I ；且外顯子1、外顯子2、外顯子1的上游引物、外顯子1的下游引物、外顯子2的上游引物、外顯子2的下游引物的序列分別如SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 所示。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟O)中桿狀病毒表面展示載體 pFastBacI-gp64由PCR擴增得到的桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列、桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至轉移載體PFastBacI中獲得。
5.一種權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4表達的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 11 所示。
6.一種權利要求5所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲和蠶蛹；(3)收集表達的權利5所述蛋白。
7.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-PvMSP4在間日瘧紅內期疫苗制備中的應用。
8.—種權利要求5所述蛋白在間日瘧紅內期疫苗制備中的應用。
9.一種多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)重組質粒pGEX-4T-l-PvMSP4，的構建為了保證目的蛋白表達，設計引物R' (eXon2)，去掉基因序列上的GPI序列，以權利要求2步驟(1)所得到的基因PvMSP4 為模板，以SEQ ID NO. 3、R' (exon2)為上下游引物，經PCR擴增得到PvMSP4，基因，將其與PGEX-4T-1載體同時經&01 1/損01雙酶切，將酶切回收的片段用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化TGl感受態細胞，挑取單菌落搖菌培養后提取重組質粒 pGEX-4T-l-PvMSP4，，利用PCR和雙酶切進行鑒定；其中PvMSP4，為無GPI的PvMSP4基因， 引物R’ (exon2)的序列如SEQ ID NO. 7所示；(2)大腸桿菌中表達蛋白PvMSP4’的誘導表達、純化與多克隆抗體制備將步驟(1)鑒定成功的重組質粒pGEX-4T-l-PvMSP4，轉化大腸桿菌Rosetta感受態細胞，加IPTG誘導表達，利用GST親和層析純化目的蛋白，純化出的蛋白免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體。
10. 一種權利要求9所述的多克隆抗體在家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4表達和鑒定中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種間日瘧紅內期疫苗及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。本發明利用基因重組技術將間日瘧裂殖子表面蛋白4的編碼基因PvMSP4與桿狀病毒gp64的信號肽和跨膜區融合得到重組桿狀病毒，通過家蠶生物反應器生產該重組病毒后，接種家蠶五齡幼蟲和蠶蛹，進行高效表達PvMSP4蛋白，結果顯示該蛋白進行了翻譯后修飾，經過離心分離純化獲得具有生物活性的病毒粒子疫苗。本發明所提供的疫苗制備方法簡單，操作簡便，成本低，并且具有良好的生物活性。
文檔編號A61K39/015GK102533678SQ20121000560
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者單茜茜, 張耀洲, 舒特俊, 陳劍清 申請人:特菲(天津)生物醫藥科技有限公司