專利名稱：免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法，尤其涉及免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中重組質粒和重組病毒的制備， 屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)由 Barry J. Marshall 和 J. Robin Warren于1983年首次發現，是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的革蘭氏陰性菌， 是慢性活動性胃炎、十二指腸潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界衛生組織/國際癌癥研究機構(WH0/IARC)將幽門螺桿菌定為I類致癌原。目前全球近50%的人口感染了幽門螺桿菌，在發展中國家其感染率可高達70%以上，嚴重影響了人類的健康。現有的治療幽門螺桿菌的手段主要是聯合應用抗生素及抑酸劑，但存在耐藥性廣泛，副反應大，治療費用高且易復發等缺點。免疫治療可能是有效控制幽門螺桿菌的最有效、最有前景的方法之一，幽門螺桿菌疫苗的研制已經成為目前研究的熱點。目前已發現尿素酶(UreA和UreB)、空泡毒素(VacA)、熱休克蛋白(HspA和HspB)、中性粒細胞激活蛋白(NAP)、細胞毒素相關蛋白 (CagA)、黏附素(Adhesin)等亞單位蛋白或其融合蛋白均可以作為免疫原刺激機體產生保護性免疫反應，其中尿素酶B亞單位(UreB)由于缺乏尿素酶活性卻保留了其免疫原性、在幽門螺桿菌中高度保守而被確定為幽門螺桿菌疫苗研究的首選抗原。為了增強幽門螺桿菌蛋白的免疫原性一般將其與粘膜佐劑聯合應用，目前幽門螺桿菌疫苗常用免疫佐劑是霍亂毒素(Cholera toxin, CT)和大腸桿菌不耐熱毒(Heat-labile enterotoxin, LT),但都具有明顯腸毒性，現在多采用CT的B亞單位(CTB)以及LT的B亞單位(LTB)代替全毒素作為免疫佐劑。在口服蛋白亞單位疫苗生產中蛋白亞單位抗原的表達量成為制約其成本的關鍵因素，因此尋找低成本表達抗原蛋白的方法勢在必行。目前家蠶生物反應器主要是利用家蠶桿狀病毒表達系統實現對外源基因的表達。其優勢主要有I)表達量高利用桿狀病毒POlh基因和PlO基因的強啟動子驅動外源基因的高效表達；2)可容納大的外源基因桿狀病毒基因組在大小上差異很大(88 165kbp)，病毒可以容納較大的外源基因片段而不影響自身正常的復制和包裝；3)適合于表達毒性蛋白由于重組桿狀病毒極晚期基因啟動子驅動的外源基因的表達是在子代芽殖、有感染力病毒成熟之后進行的，因此，表達具有細胞毒性的蛋白不會影響病毒的復制；4)具轉錄、翻譯后加工家蠶桿狀病毒表達系統具有很強的轉錄、翻譯后加工能力，表達產物在結構、生物活性、免疫原性和糖基化修飾等方面與天然蛋白具有很強的相似性；5)安全性好昆蟲桿狀病毒只在無脊椎動物細胞中復制，對脊椎動物和植物細胞而言并非病原體，因此昆蟲桿狀病毒表達系統對使用者是安全無害的 (家蠶桿狀病毒的表達宿主有家蠶細胞、家蠶幼蟲和蠶蛹，但家蠶幼蟲和蠶蛹使用范圍較廣，因其便于注射操作)。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-^rM)，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒iBombyx mori nucleopolyhedrovirus')，媒氣編CGMCC No. 5580。上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker- r￡沿)的制備方法，包括以下步驟
(1)由PCR擴增的方法獲得口服免疫佐劑CTB基因序列與幽門螺桿菌抗原蛋白《rM 基因序列，并且在口服免疫佐劑CTB基因與抗原蛋白IireB基因之間加入一段連接肽序列 Linker,構建 CTB-Linker-arei 融合基因；
(2)步驟(I)所得CTB-Linker-arM融合基因用BamHI和EcoR I進行雙酶切后回收， 連接到載體PBacPAKS，使該融合基因置于多角體蛋白基因啟動子控制之下，轉化TG1大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，得到重組轉移質粒pBacPAK8- (CTB-Linker-yre^)；
(3)取步驟(2)所得的重組轉移質粒pBaCPAK8-(CTB-Linker- rM)和線性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉染BmN細胞，通過空斑篩選法篩選陽性，即得到所述家蠶重組桿狀病毒 BmNPV- (CTB-Linker-wr^)。上述步驟I)中利用PCR技術在口服免疫佐劑基因下游連入一段連接肽序列 Linker :AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重疊延伸 PCR 技術將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與幽門螺桿菌抗原蛋白基因進行融合。上述連接肽序列Linker是編碼為(Gly4Ser)n的柔性肽段,其中I彡η彡6。上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-wre^)表達的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 7 所示。上述蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)將權利要求I所述的重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfrM)感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；
(2)針刺接種法接入家蠶蠶蛹或幼蟲；
(3)收集表達的權利5所述蛋白。本發明進一步提供上述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應用。本發明還提供上述蛋白在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應用。本發明具有以下有益效果
(I)人們對家蠶的馴養已有數千年的歷史，積累了豐富的經驗，并且現代家蠶人工飼料養殖技術使得家蠶一年四季都可以養殖，大大降低了以家蠶幼蟲和蠶蛹作為為宿主進行外源基因的表達的成本；(2)抗原蛋白在家蠶生物反應器中高效表達，解決了口服蛋白亞單位疫苗生產中抗原蛋白需求量的制約瓶頸，而且將口服免疫佐劑與抗原蛋白融合表達作為分子內免疫佐劑增強了免疫效果；小鼠口服實驗表明蠶蛹表達的融合蛋白在小鼠血清中產生了明顯的免疫效應，為下一步利用蠶蛹生產幽門螺桿菌口服蛋白亞單位疫苗提供了基礎。(3)利用家蠶生物反應器將口服免疫佐劑蛋白與抗原蛋白融合表達，并在兩者之間加入連接肽片段融合蛋白中口服免疫佐劑作為分子內佐劑比單獨應用更能增強抗原蛋白的免疫原性，并且連接肽片段保證了融合蛋白中兩蛋白亞單位的構象不發生改變；本疫苗采用口服給藥，減輕了注射給藥的痛苦，且蠶蛹粉有促進蛋白抗原口服吸收的作用，增強蛋白抗原的免疫原性。


圖I為CTB基因PCR擴增的電泳分析圖；M DNA標記；1 :陰性對照；2 =PCR產物；
圖2為CTB-Linker PCR擴增的電泳分析圖；M DNA標記；1 :陰性對照；2 =PCR產物； 圖3為《τΜ基因PCR擴增的電泳分析圖；M DNA標記；I :陰性對照；2: PCR產物； 圖4為CTB-Linker-arMPCR融合的電泳分析圖；M :DNA標記；1 :陰性對照；2 :融合PCR 產物；
圖 5 為 pBacPAK8-(CTB-Linker-areW)的 PCR-雙酶切鑒定圖；M :DNA 標記；1 PCR 產物；2 :雙酶切產物；
圖6為BmNPV- (CTB-Linker-wr^)的PCR鑒定圖；M DNA標記;I :陰性對照；2 :引物為M13 F、M13 R的PCR產物；3 :引物為CTB上游引物、M13 R的PCR產物；4 :引物為CTB上游引物、ureB下游引物的PCR產物；
圖7為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在BmN細胞中表達產物的SDS-PAGE分析圖；M 預染分子量標準蛋白；1 :正常細胞總蛋白；2 :正常細胞上清；3 :正常細胞沉淀；4 :發病細胞總蛋白；5 :發病細胞上清；6 :發病細胞沉淀；
圖8為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在BmN細胞中表達產物的Western blotting 分析圖；M :預染分子量標準蛋白；1 :正常細胞總蛋白；2 :正常細胞上清；3 :正常細胞沉淀； 4 :發病細胞總蛋白；5 :發病細胞上清；6 :發病細胞沉淀；
圖9為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蠶蛹中表達產物的SDS-PAGE分析圖；M :預染分子量標準蛋白I:正常蠶蛹勻漿上清；2:正常蠶蛹勻漿沉淀；3:發病蠶蛹勻漿上清； 4 :發病蠶蛹勻漿沉淀；
圖10為r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白在蠶蛹中表達產物的Western blotting分析圖；M :預染分子量標準蛋白；1 :正常蠶蛹勻漿上清；2 :正常蠶蛹勻漿沉淀；3 :發病蠶蛹勻漿上清；4 :發病蠶蛹勻漿沉淀；
圖11為小鼠口服蠶蛹表達的r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白后血清中特異性抗幽門螺桿菌UreB IgG抗體滴度圖。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。以下結合實施例對本發明做詳細說明本實例在意本發明技術方案為前提的條件下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程(以下所用抗體均為進口試劑，其他均為國產分析純試劑)。實施例I :CTB-Linker-tfrM融合基因(如SEQ ID NO 1所示)的構建
首先利用重疊延伸PCR技術將口服免疫佐劑CTB基因和幽門螺桿菌ureB基因進行融合；為了保證融合基因表達后兩蛋白亞單位空間結構不受影響，在CTB基因和《TM之間連入了
一段連接肽序列(Linker)(如SEQ ID NO 6所示)
AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，編碼(Gly4Ser)3 的柔性肽段， 保證融合蛋白中兩蛋白亞單位空間結構不受影響。這一連接肽最初是由Husotn等人于 1988年根據Fab片段X射線衍射分析資料設計，后來發現該肽段較長且柔軟，能夠降低融合蛋白中各個蛋白亞間的空間位阻，從而更有利于融合蛋白各個結構域的正確折疊而成為通用連接肽，廣泛應用于融合蛋白的表達(圖I、圖2、圖3、圖4)。I. CTB基因的擴增
根據GenBank登錄號U25679. I公布的CTB的基因序列設計一對引物用于擴增CTB基因，并在上游引物(如SEQ ID N0:2所示)的5’端加入BamH I酶切位點(下劃線表示)。 下游引物(如SEQ ID NO 3所示)帶有連接肽的部分片段(劃線部分表示)。 CTB 上游引物5 ’ -CGCGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3 ’ ；
CTB 下游引物5’ -ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3’ ；
利用設計的CTB引物，以重組桿狀病毒BmNPV-CTB-INS (該重組桿狀病毒已經由中國200310121132. I專利申請“表達CTB和人胰島素融合蛋白的重組家蠶桿狀病毒及其應用”公開，并且在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏編號為CGMCC No. 1033)基因組DNA為模板擴增CTB基因(見圖I)，瓊脂糖凝膠電泳回收CTB基因片段。2. CTB-Linker 基因的構建設計一段連接肽序列
AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC,以 CTB 上游引物和此連接肽序列作為引物，以回收的CTB片段為模板進行PCR擴增(Τ0Υ0Β0公司的KOD-plus)，將連接肽序列連接在CTB基因的3’端，瓊脂糖凝膠回收擴增的片段，即為連接有連接肽序列的 CTB-Linker (見圖 2)。3.基因的擴增
根據GenBank登錄AY714224. I公布的ureB的基因序列設計一對弓I物擴增ureB基因。 上游引物(如SEQ ID NO :4所示)帶有連接肽的部分序列(劃線部分表示)；下游引物(如 SEQ ID NO 5所示)的5’端加入EcoR I酶切位點(下劃線表示)。 Γ 沿上游引物GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTATTAGCAGAAAAGAATATG ureB 下游引物CCGGAATTCCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG ；
利用設計的ureB引物，以重組桿狀病毒BmNPV-UreB (蘇州大學貢成良教授贈予，已由 2009年中國蠶學會第六屆青年學術研討會論文集(2)中的“幽門螺桿菌尿素酶B亞單位在家蠶桿狀病毒系統中的表達”公開)基因組DNA為模板擴增《TM基因(見圖3)，瓊脂糖凝膠電泳回收ureB基因片段。4. CTB-Linker- r￡沿融合基因的獲得
以CTB上游弓丨物和ureB下游引物作為引物，以回收的CTB-Linker和ureB基因為模板進行重疊延伸PCR(見圖4)，瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的片段，即為CTB-Linker-^rM融合基因(如SEQ ID NO 1所示)。實施例2 :重組轉移質粒pBacPAK8-(CTB-Linker-tfri i )的構建
對實施例I所得CTB-Linker-arM融合基因的5 ’和3 ’端分別用BamH I酶和EcoR I酶 (Fermentas公司)進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后片段；同時用BamH I酶和EcoR I酶對pBacPAK8載體(Invitrogen公司)進行酶切并用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后片段； 然后用T4連接酶(Fermentas公司)將回收的融合基因連接到酶切后的pBacPAK8載體，使重組基因置于多角體蛋白基因啟動子控制之下，轉化TG1大腸桿菌感受態細胞(InvitiOgen 公司)，篩選陽性克隆，得到重組轉移質粒pBacPAK8- (CTB-Linker-wr^)(見圖5)，對其進行基因測序，由測序結果可知融合基因成功克隆至pBacPAKS載體。實施例3 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)的構建 I.線性化病毒DNA的獲得
家香桿狀病毒Bm_BacPAK6 (Clontech公司)接種培養的BmN細胞(Invitrogen公司)， 27°C培養72 h后，收集病毒培養液，提取Bm-BacPAK6病毒基因組DNA，并用內切酶對 Bm-BacPAK6病毒基因組進行酶切使之線性化。2.重組轉移載體質粒與線性化病毒DNA的共轉染
(1)將生長狀態良好的BmN細胞鋪于50ml培養瓶中，27°C培養4 12 h使細胞貼壁；
(2)取A離心管加入重組轉移載體質粒pBacPAK8-(CTB-Linker-tfrM)5μ1、線性化病毒 DNA 20 μ (約 I Pg)，用 HBS (20mM HEPES, N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸； 15mM NaCl)將總體積補足至50 μ ，混勻；
(3)取B離心管加脂質體ΙΟμΙ，用HBS將總體積補足至50μ1；
(4)將A和B混合均勻，室溫放置15min，吸去培養瓶中已貼壁細胞的上清，用無血清培養基(1XSF-900 II SFM(Invitrogen 公司))洗兩次，每次 2 ml ；
(5)加入2ml無血清培養基，將上述的ΙΟΟμΙ混合液滴入，輕輕移動培養瓶使混合液均勻分布；加入2 ml無血清培養基，將上述的ΙΟΟμΙ混合液滴入，并輕輕轉動培養瓶，混合液均勻分布；
(6)27°C繼續培養Γ 6天，在顯微鏡中能觀察到細胞出現感染癥狀，將共轉染細胞的培養液轉接至另一瓶生長狀態良好的細胞，待感染細胞破裂后，收集上清，并分裝置于4°C 保存。3.家蠶重組桿狀病毒的篩選
(1)分別將IX IO5個生長狀態良好的家蠶細胞均勻鋪于4個35 mm培養皿中，貼壁培養 6 12 h 用完全培養基(1XSF-900 II SFM :1XFBS, l:10(v:v), Invitrogen 公司)分別以10_3、10_4、10_5、10_6梯度稀釋重組病毒液，吸去培養皿中的培養基，分別加入各稀釋度的病毒液I ml，27 °C培養I h ；
(2)吸去感染液，將預先保溫于40°C水浴中的2%低熔點瓊脂糖和完全培養基(SF-900II SFM : I XFBS, 1:10 (v: v), Invitrogen公司)按I: I (v: V)混合后，在每個平皿中各鋪入2 ml混合液，待凝膠凝固后將平皿倒置27°C培養2-5天，其間每隔6 h需在顯微鏡下觀察，以免多個空斑融合成片；
(3)在顯微鏡下觀察空斑出現后，用藍色記號筆在小培養皿上做好標記，再在超凈臺上用滅菌槍頭挑出空斑，釋放在200μ1培養基中，取80μ1接種于事先培養有BmN細胞的96空斑，并做好標記，繼續培養34天,在出現明顯感染癥狀的孔中加入 μ x-gal (Invitrogen 公司)，27°C繼續培養24h，挑選白色孔，進入下一輪空斑篩選，經過3 4輪的篩選后可獲得純化的該家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)。4.家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-UrM)的鑒定 (I) PCR鑒定
提取重組桿狀病毒基因組DNA，并以此為模板，分別以M13 F和M13 R (通用引物)、目的基因上游引物和M13 R、目的基因上游引物和下游引物為引物進行PCR擴增，根據擴增片段的大小判斷是否陽性(見圖6)。(2) SDS-PAGE 和 Western blotting 分析鑒定
將經PCR鑒定呈陽性的家蠶重組桿狀病毒接種BmN細胞，27°C培養72 h，待細胞發病 (顯微鏡觀察)后收集細胞并對細胞表達產物進行SDS-PAGE和Western blotting分析，結果顯示，在76kDa位置有特異性條帶(見圖7、圖8)，說明該家蠶重組桿狀病毒在家蠶BmN 細胞中成功表達。實施例4 :免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗的獲得 I.免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗的分離及純化
測定實施例3所得家蠶重組桿狀病毒BmNPV- (CTB-Linker-yr^)的滴度后接種家蠶蠶蛹或幼蟲(品種為箐松X皓月)，蠶蛹發病后低溫凍存，SDS-PAGE和Western blotting 分析結果顯示，r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白(如SEQ ID N0:7所示)在蠶蛹中成功表達 (圖9、圖10) ;ELISA檢測結果顯示，該融合蛋白在蠶蛹中的表達水平為O. 12 mg/g蠶蛹。將凍存的蠶蛹與磷酸鹽緩沖液(pH7. 4，4°C )按500g: IL的比例用勻漿機進行勻衆，勻衆2 min,冰浴2 min,重復操作10次；然后2(TC, 6000 rpm離心30min,去除沉淀后將上清液用9層脫脂棉紗布過濾去除油脂，重復操作3次；然后4°C，12000 rpm離心 30 min,去除沉淀后將上清液用9層脫脂棉紗布過濾進一步去除油脂，重復操作3次；將所得上清液用超濾系統30kDa超濾膜包超濾濃縮至200ml，然后于凍干機中凍干后低溫 (_80°C)保存。然后，將蠶蛹凍干粉用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)以50mg:lml比例溶解，采用 ELISA法對融合蛋白進行定量。2. 口服疫苗的效果(小鼠口服實驗鑒定融合蛋白的免疫原性)
ICR小鼠，健康雌性，61周齡，體重18 22 g，由天津市奧易德實驗用品有限公司提供。 將24只小鼠隨機分為3組，I組為正常蠶蛹粉對照組；II組為UreB標準品對照組JII組為 r(CTB-Linker-UreB)融合蛋白實驗組。小鼠免疫前禁食禁水12h，飼喂針灌服胃酸中和液 (0.2 M的碳酸氫鈉溶液)0.5 ml/只,30 min開始灌服抗原。標準品對照組口服UreB蛋白標準品200 Pg/只(UreB標準品購自上海領潮生物科技有限公司，用磷酸鹽緩沖液pH7. 4 稀釋至200 Pg/ml,小鼠灌胃I ml/只)；r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白實驗組口服融合蛋白蠶蛹凍干粉2 g(約含200 Pg融合蛋白，溶于Iml磷酸鹽緩沖液pH7. 4中，小鼠灌胃Iml/只)；正常蠶蛹粉對照組灌服2 g正常蠶蛹凍干粉(正常蠶蛹凍干粉處理方法與融合蛋白蠶蛹凍干粉處理方法相同)。小鼠每周免疫I次，共免疫4次。第一次免疫前眼底靜脈叢取血作為陰性血清對照；以后每次免疫前眼底靜脈叢取血，共取4次。每次所取血液37°C 孵育30 min, 3000 g離心10 min,收集血清于-20O保存備用。ELISA分析血清中抗體滴度，鑒定r (CTB-Linker-UreB)融合蛋白的免疫原性，步驟如下
(1)將UreB蛋白標準品用ELISA包被液(O.05 M碳酸鹽緩沖液，pH9. 6)稀釋至5 μδ /ml, 200 μ /孔，包被96孔板，4°C孵育過夜；
(2)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min，3次)；
(3)用1%BSA的磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)37°C孵育I h;
(4)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次)；
(4)小鼠血清用磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·4)以I:50(V:V)比例稀釋后，再以I :3(v:v)比例系列(初始稀釋比例是1:50，接下來按1:3比例稀釋系列后就是1:150，1:450，1:1350， 1:4050，1:12150，共 6 個梯度)稀釋，37°C孵育 I h;
(5)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次)
(6)用磷酸鹽緩沖液(PH7.4)按I:5000 (v:v)比例稀釋辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠 IgG 二抗，200 μ /孔，37°C孵育 I h;
(7)用含O.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 4)洗板(每次5 min, 3次);
(8)加底物每孔加入TMB顯色液(Solarbio公司)200μ1，避光顯色10min;
(9)終止反應每孔加入50μ1，2 M硫酸終止反應；
(10)酶標儀測定吸光值OD492(圖11)。ELISA結果分析小鼠口服蠶蛹表達的r (CTB-Linker-arM)融合蛋白后血清中特異性抗幽門螺桿菌UreB抗體滴度分析顯示蠶蛹表達的融合蛋白有較好的免疫原性，可以作為幽門螺桿菌口服疫苗的抗原。以上所述，僅為本發明的優選實施例，應當指出，對于本技術中的普通技術人員來說，在不脫離本發明的核心技術特征的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些潤飾和改進也應屬于本發明的專利保護范圍。
權利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfrM)，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No. 5580。
2.一種權利要求I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfr￡^)的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)由PCR擴增的方法獲得口服免疫佐劑CTB基因序列與幽門螺桿菌抗原蛋白《rM 基因序列，并且在口服免疫佐劑CTB基因與抗原蛋白IireB基因之間加入一段連接肽序列 Linker,構建 CTB-Linker-arei 融合基因；(2)步驟(I)所得CTB-Linker-arM融合基因用BamHI和EcoR I進行雙酶切后回收， 連接到載體pBacPAKS，使該融合基因置于多角體蛋白基因啟動子控制之下，轉化TG1大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，得到重組轉移質粒pBacPAK8- (CTB-Linker-yre^)；(3)取步驟(2)所得的重組轉移質粒pBaCPAK8-(CTB-Linker- rM)和線性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉染BmN細胞，通過空斑篩選法篩選陽性，即得到所述家蠶重組桿狀病毒 BmNPV- (CTB-Linker-wr^)。
3.根據權利2所述的方法，其特征在于，步驟I)中利用PCR技術在口服免疫佐劑基因下游連入一段連接肽序列Linker AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC,然后利用重疊延伸 PCR 技術將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與幽門螺桿菌抗原蛋白基因進行融合。
4.根據權利3所述的方法，其特征在于，所述連接肽序列Linker是編碼為(Gly4Ser)n 的柔性肽段，其中I彡η彡6。
5.一種權利要求I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。
6.一種權利要求5所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權利要求I所述的重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-arM)感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；(2)針刺接種法接入家蠶蠶蛹或幼蟲；(3)收集表達的權利5所述蛋白。
7.一種權利I所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-(CTB-Linker-tfr￡^)在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應用。
8.—種權利要求5所述的蛋白在免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗制備中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制備方法及其產品，屬于生物醫藥技術領域。本發明利用PCR技術在口服免疫佐劑基因下游連入連接肽序列片段，然后利用重疊延伸PCR技術將連有連接肽序列的口服免疫佐劑基因與蛋白抗原基因進行融合，然后構建融合基因的重組家蠶桿狀病毒并利用家蠶生物反應器進行目的蛋白的表達。本發明采用家蠶生物反應器表達了口服免疫佐劑與幽門螺桿菌抗原融合蛋白，不僅實現了蛋白的高效表達，而且將口服免疫佐劑與抗原蛋白融合表達作為分子內免疫佐劑增強了免疫效果。
文檔編號A61P31/04GK102604993SQ20121000547
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者張耀洲, 舒特俊, 陳劍清, 高國 申請人:天津耀宇生物技術有限公司