專利名稱：一種黃芪提取物的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬中醫藥領域，涉及一種黃芪提取物；此外，本發明還涉及該黃芪提取物的制備方法和應用。
背景技術：
糖尿病的并發癥之一 HAAF是糖尿病患者難以獲得接近正常血糖控制的重要障礙。數據顯示為了減少I型糖尿病遠期并發癥而采用的胰島素強化治療使得低血糖的發生率增加了近3倍。HAAF產生的機制主要是反復發作的低血糖大大削弱了腎上腺素、胰高糖素等反向調節激素對低血糖的應急調節，使得交感腎上腺系統對低血糖的反應明顯遲鈍，并且由于神經系統對低血糖的敏感性下降，患者自身往往對低血糖癥狀缺乏覺醒，尤其是睡眠過程中患者經常會在不自知的狀態中血糖持續走低直至死亡，這一現象被命名為低
血糖相關的自主神經系統調節失敗-簡稱HAAF(Hypoglycemia-Associated Autonomic
Failure)。HAAF的存在使得患者低血糖的發生率明顯上升，而反復發生的低血糖又會進一步加重HAAF的程度，如此以來往往會陷入一個惡性循環，嚴重影響著患者的血糖控制。國外目前以耶魯大學為首的幾所著名內分泌實驗室均在積極探討HAAF發生的機制及應對措施，但在治療方面尚無突破性進展。而治療領域則主要是尋找能夠重建機體腎上腺素、去甲腎上腺素、胰高糖素對低血糖的反應，提高機體對低血糖的預警機制的有效成分。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種黃芪提取物，可以用于治療糖尿病并發癥之一 HAAF，能夠部分重建機體腎上腺素、去甲腎上腺素對低血糖的反應，提高機體對低血糖的預警機制。本發明要解決的技術問題之二是提供上述黃芪提取物的制備方法。本發明要解決的技術問題之三是提供上述黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對低血糖荷爾蒙反向調節受損的藥物中的應用。為解決上述技術問題，本發明提供一種黃芪提取物，含有黃芪甲甙IV，其含量不低于 O. 08mg/ml。中醫學無HAAF這一病名，但是低血糖狀態的乏力、心慌、肢冷、出汗甚至昏迷等現象和中醫范疇的陽氣暴脫極為相似，屬于脫癥的一種，多因久病消渴，氣虛漸至陽虛，一個意外的原因或者治療不當陽氣脫于外，氣衰而見乏力委頓，陽衰不能斂陰，則汗液妄泄，心氣不足則心慌驚惕，甚者汗出如油，伴有肢冷、脈微、呼吸低弱甚至意識不清等見癥，均合于陽氣衰微所致。因此益氣升陽是其法，黃芪首當其屬。其次在臨床實踐中我們發現經常低血糖發作的患者往往伴有氣虛見證，經過黃芪 (包括黃芪膠囊及黃芪注射液)治療后患者的低血糖發生次數較前明顯減少，血糖相對較為穩定，因此提示黃芪能夠通過某些機制對抗HAAF。本發明的黃芪提取物，它是由一組有效成分組成，所述有效成分主要是皂甙類，特別是黃芪甲甙IV。本發明所涉及的原料藥材黃芪為中國藥典2000年版一部所收載中藥，并符合藥典質量要求。本發明還提供上述黃芪提取物的制備方法，包括如下步驟(I)將黃芪原藥材加水煎煮3次，每次I. 5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至每 Iml相當于原藥材I 2g ;(2)以75%及85%的乙醇兩次沉淀，每次均冷藏放置12小時，回收乙醇并濃縮至每Iml相當于原藥材IOg,用注射用水稀釋至每Iml相當于原藥材O. 75 Ig,冷藏放置12 小時，濾過，濾液濃縮至每Iml相當于原藥材5 6g,放冷；(3)用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5 分鐘，趁熱濾過，加注射用水，濾過，再用20%氫氧化鈉溶液調節pH值為6. 0-7. 5，濾過，灌封，滅菌，即得。本發明黃芪提取物通過上述水醇法提取制備，即水提取，醇沉淀法，并且使用兩次醇沉，使該提取液中黃芪甲甙IV的含量不低于O. 08mg/ml，PH值約為6. 0-7. 5，可直接進入大鼠靜脈系統。本發明的黃芪提取物在使用時，可以將其濃縮液滅菌后按照常規制劑方法制備成口服液，也可以將其干燥后與藥學上常用的輔料制備成顆粒劑、膠囊劑、片劑、沖劑等。所述輔料包含稀釋劑如乳糖、木糖醇、甘露醇、甲殼胺等，根據選擇劑型的不同，可以按照現有的常規制劑方法(《藥物制劑方法》，張勁主編，化學工業出版社，2005年8月出版)選擇不同的輔料。可以選擇的崩解劑如羧甲基淀粉鈉CMS-Na、微晶纖維素等；粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、聚乙二醇(PEG)等； 穩定劑如山梨酸、對羥基苯甲酸酯、乙醇、枸櫞酸等；包合劑如ο-環糊精(a-⑶)、p-環糊精 (P-CD)和N-LOK變性淀粉等；包衣劑如羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯酸樹脂等；矯味劑如蜂蜜、蔗糖等。在上述各種劑型藥物的每日劑量中，黃芪提取物的含量比例因劑型的不同又很大差別，以其中的黃芪甲甙IV作為其有效成分含量標準，要保證成人每日服藥量中含有黃芪甲甙IV 2.4mg及以上。本發明還提供上述黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對低血糖荷爾蒙反向調節受損的藥物中的應用。本發明黃芪提取物在HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實驗中能夠部分重建腎上腺素、 去甲腎上腺素對低血糖的反應曲線，胰高糖素也隨之輕度升高；在正常老鼠的低血糖鉗夾過程中也可使腎上腺素、去甲腎上腺素升高水平明顯高于對照組。證明本發明中的黃芪有效組分具有重建HAAF模型大鼠部分荷爾蒙反應的作用。同時我們也發現了該有效組分能夠激活大腦PVN、VMH、NTS等糖敏感部位的C-Fos基因蛋白表達，尤其是對下丘腦CRF神經核團的激活，從而提高了機體對低血糖的預警機制。本發明對糖尿病的并發癥之一 HAAF具有很好的治療前景。


圖I-圖3是本發明實驗例I中黃芪有效組分對HAAF模型大鼠低血糖鉗夾過程中荷爾蒙的重建示意圖，包括腎上腺素(圖I)，去甲腎上腺素(圖2)以及葡萄糖輸注率(圖 3)。圖4-圖5是本發明實驗例2中黃芪有效組分對正常大鼠腦組織糖敏感部位的激活作用示意圖，包括PVN、NTS部位的c-Fos染色，以及PVN部位CRF與c-Fos的雙重染色。圖6是本發明實驗例3中黃芪組及對照組c-Fos基因在PVN及NTS部位的表達情況示意圖。圖7是本發明實驗例3中PVN部位CRF、Fos雙重染色示意圖，圖7a中標尺長 200 μ m，圖7b中標尺長30 μ m。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述實施例I取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至每Iml相當于原藥材lg，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時，回收乙醇并濃縮至每Iml相當于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當于原藥材O. 75g,冷藏放置12小時,濾過,濾液濃縮至每Iml相當于原藥材 5g，放冷，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘， 趁熱濾過，加注射用水使成1000ml，濾過，再用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至6. O 7. 5， 濾過，灌封，滅菌，即得。實施例2取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至每Iml相當于原藥材2g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時，回收乙醇并濃縮至每Iml相當于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當于原藥材lg，冷藏放置12小時,濾過,濾液濃縮至每Iml相當于原藥材6g, 放冷，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘，趁熱濾過，加注射用水使成1000ml，濾過，再用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至6. O 7. 5，濾過，灌封，滅菌，即得。實施例3取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至每Iml相當于原藥材I. 5g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時，回收乙醇并濃縮至每Iml相當于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當于原藥材O. 9g,冷藏放置12小時,濾過,濾液濃縮至每Iml相當于原藥材
5.5g，放冷，用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘，趁熱濾過，加注射用水使成1000ml,濾過,再用20%氫氧化鈉溶液調節pH值至6. O
7.5，濾過，灌封，滅菌，即得。以下通過實驗例對本發明的有益效果作進一步的闡述實驗例I黃芪有效組分對HAAF模型大鼠荷爾蒙重建作用I、藥物該實驗組使用藥物均是按照實施例I制備的黃芪提取物，每I毫升液體含生藥2 克，黃芪甲甙IV含量不低于O. 08毫克。對照組使用的藥物是等體積無菌生理鹽水。2、實驗動物及HAAF動物模型造模SD大鼠，全部來自耶魯大學實驗動物中心。體重300g_350g，12-12小時晝夜節律
飼養，常規飲食。造模方法(參照 Feeding and neuroendocrine responses after recurrent insulin-induced hypoglycemia. Physiol Behav. 2006 Apr 15 ；87 (4) :700-6. Epub 2006 Feb 21等文獻)連續3天早上9AM給予大鼠正規胰島素腹腔注射，使之每次低血糖狀態(PG < 2. 8mmol/L)持續2小時左右。其中第一天胰島素劑量為10U/Kg，第二天胰島素劑量為 9U/Kg，第三天降至6U/Kg。具體劑量可以根據動物的實際情況予以調整。每隔15分鐘尾端采血測血糖，如血糖持續一小時仍高于2. 8mmol/L者，重新給予半量胰島素腹腔注射，同時盡量避免動物因低血糖誘發癲癇發作或死亡。實驗結束后恢復動物正常進食。3、實驗方法實驗第I天，大鼠在麻醉情況下于胸鎖關節上方開一 Icm切口，左側頸動脈和右側頸內靜脈分別放置自制心臟套管，交叉繞過頸部，動脈PVP封管，靜脈肝素鹽水封管，以備每天注射黃芪或生理鹽水使用。術后恢復3天，從實驗第4天開始每天通過靜脈留置套管給藥，比照60公斤成人體重黃芪常規用量，按照體表面積換算法，I. 5ml原液稀釋至3ml，(含生藥約3克)，對照組給等量生理鹽水。實驗第8天開始連續三天動物造模。實驗第10天動物當晚5PM開始禁食，實驗第11天進行低血糖鉗夾實驗。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正規胰島素微泵推注，通過調整葡萄糖推注速率使目標血糖維持在2. 8mmol/L左右。兩組大鼠開管后預置一小時，待其充分安靜下來，分別微泵給予黃芪注射液和生理鹽水推注30分鐘，速率20ul/min，30分鐘后接通胰島素和糖。從O分鐘開始每隔30分鐘取一次大樣以供各種荷爾蒙檢測之用，每隔10分鐘取小樣一次，檢測中心血糖， 根據血糖及時調整葡萄糖用量。鉗夾實驗共持續120分鐘。4、實驗結果經過黃芪的干預，HAAF模型大鼠在低血糖鉗夾實驗中荷爾蒙得到了很大程度的重建，具體見表I及圖I-圖3。如圖I所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實驗中顯示黃芪組腎上腺水平明顯高于對照組。如圖2所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實驗中顯示黃芪組去甲腎上腺水平明顯高于對照組。如圖3所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實驗中顯示黃芪組需糖量略低于于對照組。表I黃芪組與對照組60-120分鐘各種荷爾蒙平均水平比較(X 土SD) (pg/ml)腎上腺素去甲腎上腺素胰高糖素腎上腺皮質激素
黃芪組(n=9) 對照組(n=10)2303. 33±652. 94 1417. 20±606. 32**970. 30±623. 94 510. 20±173· 83*213. 59±138· 12 133. 17±65. 54906. 33±201. 28 693. 81 ±120. 54注與對照組比較，*p < O. 05，林P < O. 01實驗例2黃芪有效組分對普通大鼠低血糖鉗夾過程中荷爾蒙的影響I、藥物及動物來源均同實驗例I2、實驗方法手術方法同實驗例1，動物無需造模，實驗第7天開始每天通過靜脈留置套管給藥，比照60公斤成人體重黃芪常規用量，按照體表面積換算法，I. 5ml原液稀釋至3ml，(含生藥約3克)，對照組給等量生理鹽水。實驗第10天動物當晚5PM開始禁食，實驗第11天進行低血糖鉗夾實驗。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正規胰島素微泵推注，通過調整葡萄糖推注速率使目標血糖維持在2.8mmol/L左右。兩組大鼠開管后預置一小時，待其充分安靜下來開始高胰島素低血糖鉗夾實驗，實驗過程不再推注黃芪提取液，其他同實驗例I。實驗結果具體見表2及圖4-圖5。如圖4所示，正常大鼠低血糖鉗夾實驗中顯示黃芪組腎上腺素水平明顯高于對照組。如圖5所示，正常大鼠低血糖鉗夾實驗中顯示黃芪組需糖量明顯低于對照組。表2黃芪組與對照組60-120分鐘各種荷爾蒙平均水平比較^土 SD) (pg/ml)
腎上腺素去甲腎上腺素胰高糖素黃芪組(η=7)4460. 18 ±2012. 39739. 33 ±540. 97326. 11 ±207. 05對照組(η=6)2613. 06±1117· 21*564. 83±250. 41237. 28±110· 54注與對照組比較，*p < O. 05實驗例3腦組織切片染色腦組織切片PBS清洗10分鐘，放入PBT-疊氮化物(PBT-azide)溶液中，加入O. 3% 新鮮驢血清和I : 10000兔抗FOS抗體過夜。次日PBS清洗后分別放入加有生物素酰基化驢抗兔血清和O. 3%新鮮驢血清的PBT溶液中以及加有抗生物素蛋白生物素酰基化過氧化物酶混合物(ABC-Elite試劑盒，Vector實驗室；1 250)的PBT溶液中各反應一小時，最后用0.04% 3,3’ -二氨基聯苯胺四氫氯化物(DAB ；Sigma)and O. 003%過氧化氫顯色,鏡檢成功后封片，完成C-Fos的染色。腦組織切片PBS清洗10分鐘，放入PBT-azide溶液中，加入O. 3%新鮮驢血清和 I 500羊抗-FOS抗體以及I : 1000的生物素酰基化CRF抗兔血清避光過夜。次日PBS 清洗后加入含有I : 1000生物素酰基化驢抗兔血清和O. 3%新鮮驢血清的PBT中避光孵化一小時，最后加入含有O. 3%新鮮驢血清以及I : 1000亞歷山大熒光594共軛抗生蛋白鏈菌素和I : 400亞歷山大熒光488驢抗兔抗體的PBT溶液中避光反應一小時，完成C-Fos 和CRF神經核團的染色。上述染色方法均經多次驗證，染色穩定，可重復性強。結果顯示與對照組相比黃芪組下丘腦PVN、NTS部位C-Fos基因表達明顯活躍，見圖6，黃芪組CRF神經核團染色與c-Fos 雙重染色后可見其共同表達于同一細胞當中，說明其有效激活了 CRF神經核團，而對照組 CRF神經核團中則幾乎看不到c-Fos的表達，見圖7。由此我們推測黃芪注射液存在某種機制能夠通過促進PVN分泌CRF，提高機體在低血糖狀態下兒茶酚胺的水平，從而對HAAF有效。
權利要求
1.一種黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對低血糖荷爾蒙反向調節受損的藥物中的應用，所述黃芪提取物含有黃芪甲甙IV，其含量不低于O. 08mg/ml。
全文摘要
本發明公開了一種黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對低血糖荷爾蒙反向調節受損的藥物中的應用，所述黃芪提取物含有黃芪甲甙IV，其含量不低于0.08mg/ml。本發明動物實驗表明本發明中的黃芪有效組分具有重建HAAF模型大鼠部分荷爾蒙反應的作用，能夠激活大腦中PVN、NTS等糖敏感部位以及激活CRF神經核團，從而提高了機體對低血糖的預警機制。該發明對糖尿病的并發癥之一HAAF具有很好的治療前景。
文檔編號A61K36/481GK102600230SQ20121006192
公開日2012年7月25日 申請日期2009年1月20日 優先權日2009年1月20日
發明者周里鋼, 桑珍, 范曉寧 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院