專利名稱：用于治療TNFα-相關病癥的多變劑量方案的制作方法
用于治療TNF a -相關病癥的多變劑量方案本申請是名稱為“用于治療TNF a-相關病癥的多變劑量方案”、申請日為2005年04月11日、申請號為200580019165. 2的發明專利申請的分案申請。相關串請本申請要求下列申請的利益2004年4月9日提交的美國臨時申請US 60/561，139 ;2004年4月12日提交的美國臨時申請US60/561, 710 ;和2004年5月7日提交的美國臨時申請US 60/569, IOO0將這些專利申請各自的全部內容引入本文作為參考。本申請涉及美國專利US 6，090，382、US 6，258，562和US6, 509，015。本申請還涉及2001年3月7日提交的美國專利申請；2003年11月22日提交的美國專利申請US10/302, 356 ;2002年6月5日提交的美國專利申請US 10/163657 ;2002年4月26日提交的美國專利申請US 10/133715 ;2002年8月I 6日提交的美國專利申請US 10/222140 ；2003年10月24日提交的美國專利申請US10/693233 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/622932 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/623039 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/623076 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/623065 ；2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/622928 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US10/623075 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/623035 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/622683 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/622205 ；2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/622210 ;2003年7月18日提交的美國專利申請US 10/623318 ;和美國專利申請2003年4月24日提交的US10/422287。將這些專利和專利申請各自的全部內容引入本文作為參考。
背景技術：
細胞因子，諸如白細胞介素-I (IL-I)和腫瘤壞死因子(TNF)為各種細胞，諸如單核細胞和巨噬細胞產生的分子，已經將它們鑒定為炎癥性過程的介體。細胞因子，包括TNF調節作為損傷或感染結果的炎癥反應的強度和期限。TNF水平升高在病理性炎癥中起重要作用。也稱作(TNFa)的TNF涉及各種人疾病和病癥的病理生理學，包括膿毒癥、感染、自身免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病(例如，參見Moeller等(1990)細胞因子2 :162 ；Moeller等的美國專利US5, 231，024 ；Moeller, A.等的歐洲專利公開號EP260610B1 ；Vasilli (1992)Annu. Rev. Tmmuno1. 10 411 ；Tracey 和 Cerami(1994)Annu. Rev. Med. 45 491)。TNF涉及銀屑病。TNF-誘導的蛋白的表達和在牛皮癬斑片中存在活化的T淋巴細胞，但未涉及到皮膚這一事實提示其涉及該病的發病機制。根據皮膚表現存在幾種類型的銀屑病斑塊狀銀屑病、滴狀牛皮癬、紅皮性牛皮癬、泛發性膿皰性牛皮癬和局限性膿皰牛皮癬。不過，斑塊狀銀屑病為最常見的類型。治療銀屑病取決于該病的程度。局部用皮質甾類常用于輕度到中度的局限性病例。角質層分離劑和煤焦油也用作外用藥并且光療常用于更為泛發性的疾病。其它全身療法，諸如甲氨喋呤、環胞菌素和合成的類視黃醇是有效的，但通常因其可能蓄積的毒性作用而只能交替給藥。
TNF還涉及克羅恩病?；谂R床、內窺鏡檢查、放射照相和組織學標準診斷克羅恩病?？肆_恩病的治療具有挑戰性。治療基于疾病的定位、程度和嚴重性。最新的化合物和方案無法完全減輕炎癥性過并且具有明顯的副作用。發明概述對以安全和有效方式治療TNFa活性為有害的TNFa-相關病癥存在需求。本發明包括用于改善治療TNF a活性為有害的TNF a -相關病癥的多變劑量方法。本發明描述了用于治療TNFa活性為有害的病癥的多變劑量方法，包括對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的TNFa抑制劑，以便在誘導期內達到TNFa抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的TNFa抑制劑，使得治療發生。本發明還描述了用于治療克羅恩病的多變劑量方法，包括對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的TNF a抑制劑，以便在誘導期內達到TNF a抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的TNFa抑制劑，使得治療發生。本發明的多變劑量還可以用于治療潰瘍性結腸炎或銀屑病。在另一個實施方案中，本發明的多變劑量可以用于治療作為混合了牛皮癬性關節炎的銀屑病。本發明包括誘導克羅恩病消退的多變劑量方法，包括對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的TNF a抑制劑，以便在誘導期內達到TNF a抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的TNFa抑制劑，使得治療發生。在額外的實施方案中，本發明包括減少牛皮癬斑片的多變劑量方法，包括對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的TNFa抑制劑，以便在誘導期內達到TNFa抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的TNFa抑制劑，使得治療發生。在一個實施方案中，所述的TNFa抑制劑為依那西普或英夫利昔單抗。在本發明的一個實施方案中，所述的TNFa抑制劑為TNFa抗體或其抗原結合片段。在本發明的另一個實施方案中，所述的TNFa抑制劑為人TNFa抗體或其抗原結合片段。在一個實施方案中，所述的抗體為分離的人抗體或其抗原結合部分，它以均通過表面等離振子共振測定的I X KT8M或I X KT8M以下的Kd和I X 10_3s_1或I X 10_3s_1以下的Koff速率常數解離自人TNF a，并且在標準體外L929試驗中以I X 10_7M或I X 10_7M以下的IC5tl中和人TNFa細胞毒性。在另一個實施方案中，所述的抗體具有如下特性a)以I X KT3s-1或I X lO、-1以下的Ktjff速率常數解離自人TNF a，正如通過表面等離振子共振測定的；b)具有輕鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列或通過在1、4、5、7或8位上的單一丙氨酸取代或在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1_5個保守氨基酸取代而從SEQ ID NO 3中修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的單一丙氨酸取代或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1_5個保守氨基酸取代而從SEQ ID NO :4中修飾的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述的抗體具有包括SEQ ID NO :I的氨基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)和包括SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。在另一個實施方案中，所述的抗體為D2E7。本發明的方法可以用于治療TNF a-相關病癥，這些病癥選自自身免疫性疾病、傳染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、惡性腫瘤、肺病、腸病、心臟疾患、膿毒癥、脊椎關節病、代謝紊亂、貧血、疼痛、肝病、皮膚病、指甲病和血管炎組成的組。在一個實施方案中，所述的自身免疫性疾病選自類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、變態反應、多發性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征組成的組。在另一個實施方案中，所述的TNF a -相關病癥選自炎性骨病癥、骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴發型肝炎、凝固障礙、灼傷、再灌注損傷、瘢痕形成、瘢痕組織形成、牙周病、肥胖和放射毒性組成的組。在另一個實施方案中，所述的TNF a -相關病癥選自貝切特病、 強直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩病相關病癥、青少年類風濕性關節炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、牛皮癬性關節炎和慢性斑塊狀銀屑病組成的組。在本發明的一個實施方案中，所述的TNFa -相關病癥為克羅恩病。在另一個實施方案中，所述的病癥為潰瘍性結腸炎。在另一個實施方案中，所述的病癥為銀屑病。在另一個實施方案中，所述的病癥為混合了牛皮癬性關節炎(PsA)的銀屑病。在另一個實施方案中，所述的TNFa -相關病癥為類風濕性關節炎。在一個實施方案中，治療劑量為誘導劑量的40-60%。在一個實施方案中，本發明多變劑量方案中使用的誘導劑量在約20_200mg的范圍。在另一個實施方案中，誘導劑量在約80-160mg的范圍。在一個實施方案中，本發明多變劑量方案中使用的治療劑量在約20_120mg的范圍。在另一個實施方案中，治療劑量在約40-80mg的范圍。在本發明的一個實施方案中，誘導劑量包括約160mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括約80mg。在本發明的一個實施方案中，誘導劑量包括約80mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括約40mg。在一個實施方案中，本發明多變劑量方案中使用的誘導劑量在20_200mg的范圍。在另一個實施方案中，誘導劑量在80-160mg的范圍。在一個實施方案中，本發明多變劑量方案中使用的治療劑量在20-120mg的范圍。在另一個實施方案中，治療劑量在40-80mg的范圍。在本發明的另一個實施方案中，誘導劑量包括160mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括80mg。在本發明的一個實施方案中，誘導劑量包括80mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括40mg。在一個實施方案中，在誘導劑量后約2周給予治療劑劑量。在一個實施方案中，經皮下給予TNF a抑制劑。在另一個實施方案中，將TNF a抑制劑與甲氨喋呤聯合給藥。例如，可以給予2. 5mg-30mg劑量的甲氨喋呤。在一個實施方案中，根據受試者的克羅恩病活性指數(CDAI)評分的減小確定治療克羅恩病的多變劑量方法的閾水平。在一個實施方案中，將治療銀屑病的多變劑量方法的閾水平測定為選自牛皮癬斑片減少、受試者牛皮癬面積嚴重性指數(PASI)改善和受試者的臨床醫師整體評價(PGA)評分改善組成的組的治療作用。本發明描述了誘導克羅恩病消退的多變劑量方法，包括對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的D2E7，以便在誘導期內達到TNFa抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的D2E7，使得治療發生。在另一個實施方案中，本發明包括減少牛皮癬斑片的多變劑量方法對有此需要的受試者給予至少一種誘導劑量的D2E7，以便在誘導期內達到TNFa抑制劑的閾水平；且隨后在治療期內對所述受試者給予至少一種治療劑量的D2E7，使得治療發生。本發明提供了用于治療TNFa活性有害的病癥的試劑盒，包括a)至少一個包括誘導劑量的TNFa抑制劑的容器；b)至少一個包括治療劑量的TNFa抑制劑的容器；和c)在誘導期內給予誘導劑量的TNFa抑制劑并且在治療期內給予治療劑量的TNFa抑制劑的技術說明書。本發明還提供了用于治療TNFa活性有害的病癥的試劑盒，包括至少一個含有誘導劑量的TNFa抑制劑的容器，其中包裝有用于在誘導期內給予誘導劑量的技術說明書。本發明還提供了用于治療TNFa活性有害的病癥的試劑盒，包括至少一個含有治療劑量的TNFa抑制劑的容器，其中包裝有用于在治療期內給予治療劑量的技術說明書。在本發明的一個實施方案中，所述的試劑盒用于治療選自下列組成的組的病癥自身免疫性疾病、傳染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、惡性腫瘤、肺病、腸病、心臟疾患、膿毒癥、脊椎關節病、代謝紊亂、貧血、疼痛、肝病、皮膚病、指甲病和血管炎。在一個實施方案中，所述的自身免疫性疾病選自類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、變態反應、多發性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和腎病綜合征組成的組。在另一個實施方案中，所述的TNF a-相關病癥選自貝切特病、強直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特發性肺纖維化(IPF)、再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩病相關病癥、青少年類風濕性關節炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、牛皮癬性關節炎和慢性斑塊狀銀屑病組成的組。在本發明的一個實施方案中，所述的試劑盒用于治療選自克羅恩病、潰瘍性結腸炎、混合了牛皮癬性關節炎的銀屑病和銀屑病組成的組的病癥。在另一個實施方案中，試劑盒中的TNF a抑制劑為TNF a抗體或其抗原結合片段。在一個實施方案中，所述的抗體為分離的人抗體或其抗原結合部分，它以均通過表面等離振子共振測定的I X KT8M或I X KT8M以下的Kd和I X 10_3s_1或I X 10_3s_1以下的Koff速率常數解離自人TNF a，并且在標準體外L929試驗中以I X IO^7M或I X IO^7M以下的IC5tl中和人TNFa細胞毒性。在另一個實施方案中，所述的抗體具有如下特性a)以I X KTY1或I X lO、—1以下的Ktjff速率常數解離自人TNF a，正如通過表面等離振子共振測定的；
b)具有輕鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列或通過在1、4、5、7或8位上的單一丙氨酸取代或在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1_5個保守氨基酸取代而從SEQ ID NO 3中修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的單一丙氨酸取代或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1_5個
保守氨基酸取代而從SEQ ID NO :4中修飾的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述的抗體具有包括SEQ ID NO :I的氨基酸序列的可輕鏈可變區(LCVR)和包括SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。在另一個實施方案中，所述的抗體為D2E7。、在一個實施方案中，本發明試劑盒中的TNFa抑制劑為依那西普或英夫利昔單抗。在一個實施方案中，試劑盒中配的治療劑量為誘導劑量的40-60%。在一個實施方案中，試劑盒中配的誘導劑量在約20_200mg的范圍。在另一個實施方案中，試劑盒中配的誘導劑量在80-160mg的為。在一個實施方案中，試劑盒中配的治療劑量在約20_120mg的范圍。在另一個實施方案中，試劑盒中配的治療劑量在40-80mg的為。在一個實施方案中，試劑盒中配的誘導劑量包括約160mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括約80mg。在另一個實施方案中，誘導劑量包括約80mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括約40mg。在一個實施方案中，試劑盒中配的誘導劑量包括160mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括80mg。在另一個實施方案中，誘導劑量包括80mg。在另一個實施方案中，治療劑量包括40mg。在另一個實施方案中，所述的容器為預裝注射器。在另一個實施方案中，所述的試劑盒包含在誘導劑量后約2周給予治療劑量的技術說明書。本發明還提供了用于治療TNFa活性有害的病癥的方法，包括對有此需要的受試者給予單劑量的TNFa抑制劑，以便治療該病癥。在一個實施方案中，所述的TNFa抑制劑為抗-TNFa抗體或其抗原結合部分。在另一個實施方案中，所述的TNFa抑制劑為抗-TNF a抗體或其抗原結合部分，包括例如人抗體或其抗原結合部分，它以均通過表面等離振子共振測定的I X KT8M或I X KT8M以下的Kd和I X 10_3s_1或I X 10_3s_1以下的Koff速率常數解離自人TNF a，并且在標準體外L929試驗中以I X 10_7M或I X 10_7M以下的IC5tl中和人TNF a細胞毒性。在一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原-結合部分解離自具有5x KT4JT1或5x KT4JT1以下的Ktjff速率常數的人TNFa。在另一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原-結合部分解離自具有I X KT4s-1或I X KT4s-1以下的Ktjff速率常數的人TNF a。在另一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原-結合部分在標準體外L929試驗中中和具有1X10_8M或1X10_8M以下的IC5tl的人TNFa細胞毒性。在另一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原-結合部分在標準體外L929試驗中中和具有I X 10_9M或I X 10_9M以下的IC5tl的人TNF a細胞毒性。在另一個實施方案中，在另一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原-結合部分在標準體外L929試驗中中和具有I X IO^10M或I X IO^10M以下的IC5tl的人TNFa細胞毒性。所述的人抗體或其抗原-結合部分還可以為重組抗體或其重組抗原-結合部分。在一個實施方案中，所述的人抗體或其抗原結合部分為D2E7。在另一個實施方案中，單劑量選自約80mg、40,mg和20mg組成的組。在另一個實施方案中，通過皮下注射進行給藥。在本發明的一個實施方案中，所述的TNFa-相關病癥為克羅恩病。在另一個實施方案中，所述的病癥為潰瘍性結腸炎。在另一個實施方案中，所述的病癥為銀屑病。在另一個實施方案中，所述的病癥為混合了牛皮癬性關節炎(PsA)的銀屑病。在另一個實施方案中，所述的TNF a -相關病癥為類風濕性關節炎。附圖簡述附圖I提供了表示在一段時間內使用多變劑量方案的患有克羅恩病消退的患者(CDAI < 150)的百分比的結果。附圖2表示在一段時間內接受多變劑量方案的克羅恩病患者的平均CDAI評分的減少的不意圖。附圖3表示接受多變劑量治療的克羅恩病患者的消退和臨床反應。附圖3A以圖示提供了在4周時具有>70點CDAI減少的患者百分比。P-值代表與安慰劑組的比較。附圖3B提供了在一段時間內具有彡70的CDAI減少的患者百分比的示意圖；*p = 0.015與安慰劑組比較，且、=0. 008與安慰劑組比較。附圖4表示接受多變劑量治療的克羅恩病患者的消退和臨床反應。附圖4A以圖示提供了在4周時具有彡100點CDAI減少的患者百分比(P-值代表與安慰劑組的比較)。附圖4B表示在一段時間內具有彡100的CDAI減少的患者百分比的示意圖；*p = 0. 002與安慰劑組比較。附圖5提供了接受多變劑量治療與安慰劑的克羅恩病患者的平均CRP水平比較。附圖6提供了在4周時根據IBDQ評分確定的多變劑量方案在治療克羅恩病中的功效的結果(P-值代表與安慰劑組的比較)。附圖7表示在使用各多變D2E7劑量和安慰劑治療后12周時具有> PASI50/75/90反應的銀屑病患者的百分比。附圖8提供了在12周治療內平均PASI (銀屑病面積和嚴重性指數)改善百分比的結果(eow =每隔一周；* = p < 0. 001與安慰劑比較)。附圖9表示患有銀屑病和PsA的患者在第12周和第24周時的功效反應的比較示意圖。附

圖10表示患有銀屑病，但無PsA的患者在第12周和第24周時的功效反應的比較示意圖。發明詳述I.定義為了更用于理解本發明，首先定義某些術語。本文所用的術語"人TNF a "(本文縮寫為hTNFa或單純的hTNF)用以指作為17kD分泌形式和26kD膜結合形式存在的人細胞因子，其生物活性形式由非共價結合的17kD分子的三聚體組成。例如，hTNFa的結構進一步描述在下列文獻中Pennica,D.等(1984)Nature312:724-729 ；Davis, J. M.等(1987)Biochemistry 26 :1322-1326 ;和Jones, E. Y.等(1989)Nature 338:225-228。本文所用的術語人TNFa用以包括可以提供標準重組表達方法制備或商購(R&D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN)的重組人 TNF a (rhTNF a )。TNF a 也稱作 TNF。本文所用的術語"TNFa抑制劑"包括干擾TNF a活性的活性劑。TNFa抑制劑的實例包括依那西普(Enbrel ，Amgen)、英夫利昔單抗(Remicade ，Johnson和Johnson)、人抗-TNF 單克隆抗體(D2E7/HUMIRA ,Abbott Laboratories)、CDP571 (Celltech)和CDP870 (Celltech)以及其它抑制TNF a活性的化合物，使得當對患有TNFa活性有害的病癥或處于患有該病癥風險中的受試者給藥時，該病癥得以治療。本文所用的該術語還包括本文所述以及在如下文獻中描述的各抗-TNFa人抗體和抗體部分美國專利 US 6，090，382 ;6，258，562 ；US 6，509，015 和美國專利申請順序號 US 09/801185 和US 10/302356，可這些文獻各自引入本文作為參考。本文所用的術語"抗體"用以指由四個多肽鏈，即提供二硫鍵互聯的兩個重⑶鏈和兩個輕(L)鏈組成的免疫球蛋白分子。每個重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每個輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可以進一步被分成如下區高變區，稱作互補決定區(CDR);與更保守的區一起散在的區，稱作構架區(FR)。VH和VL各自由三個CDRs和四個FRs組成，其氨基-末端到羧基-末端按照下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發明的抗體更具體地描述在美國專利US 6，090，382 ；US 6，258，562 ;和US 6，509，015以及美國專利申請順序號US09/801185和US 10/302356中，將這些文獻各自完整的引入本文作為參考。本文所用的術語抗體的"抗原-結合部分"(或單純的"抗體部分")指的是保持特異性結合抗原(例如hTNFa)的能力的抗體的一個或多個片段。已經證實可以用全長抗體的片段執行抗體的抗原結合功能。術語抗體的"抗原-結合部分"中的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH I結構域組成的單價片段；(ii) F (ab' )2片段，即包括在絞鏈區上通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH I結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v) dAb片段(Ward等(1989) Nature 341 :544-546)，它由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此夕卜，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但是可以使用重組方法，通過合成接頭連接它們，所述的合成接頭能夠將它們形成單蛋白鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱作單鏈 Fv (scFv);例如，參見 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883)。這類單鏈抗體也包括在術語抗體的"抗原-結合部分"中。還包括其它單鏈抗體形式，諸如雙抗體。雙抗體為二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單多肽鏈上表達，但使用過短而無法使同一鏈上的兩個結構域配對的接頭，由此促使這些結構域與另一鏈的合并結構域配對并且生成兩個抗原結合部位(例如，參見 Holliger, P.等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ;Poljak,R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。本發明的抗體部分更具體地描述在美國專利US6, 090, 382 ；US 6，258，562 ;和 US 6，509，015 以及美國專利申請順序號 US 09/801185 和 US10/302356中，將這些文獻各自完整的引入本文作為參考。通過重組DNA技術或完整免疫球蛋白的酶或化學裂解產生結合片段。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、單鏈和單鏈抗體。應理解非"雙特異性"或"雙功能"免疫球蛋白或抗體的免疫球蛋白或抗體各自帶有的其結合位點是相同的。"雙特異性"或"雙功能抗體"為帶有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜種抗體?？梢酝ㄟ^各種方法，包括雜交瘤融合或Fab'片段連接產生雙特異性抗體。例如，參見 Songsivilai&Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990) ；Kostelny 等，JImmunol. 148， 1547-1553(1992)。本文所用的"保守氨基酸取代"為一個氨基酸殘基被另一個帶有相似側鏈的氨基酸殘基取代的情況。本領域中已經定義了帶有相似側鏈的氨基酸殘基族，包括堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3 -支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。本文所用的術語"人抗體"用以包括帶有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。本發明的人抗體可以包括例如在CDRs且特別是在CDR3中未被人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變導入的突變)。然而，本文所用的術語"人抗體"并不包括這類抗體，其中來源于另一哺乳動物種類，諸如小鼠的種系的CDR序列已經被植入人構架序列。本文所用的術語"重組人抗體"用以包括通過重組方式制備、表達、生成或分離的所有人抗體，諸如使用轉染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體(下文中進一步描述)、分離自重組的組合人抗體文庫的抗體(下文中進一步描述)、分離自動物(例如小鼠)的對人免疫球蛋白基因而言為轉基因的抗體(例如，參見Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res. 20 :6287)或通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任意其它方式制備、表達、生成或分離的抗。這類重組人抗體帶有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。然而，在下面實施方案中，使這類重組人抗體進行體外誘變(或當使用對人Ig序列的轉基因動物時，進行體內體細胞誘)且由此重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列為非天然存在于體內人抗體種系所有組成成分中，而來源于人種系VH和VL序列并且與之相關的序列。"分離的抗體"用以指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結合hTNF a的分離的抗體為基本上不含特異性結合非hTNF a的抗原的抗體)。然而，特異性結合hTNFa的分離的抗體與其它抗原，來自其它種類的TNFa分子具有交叉反應性(在下文中更具體地討論)。此外，分離的抗體抗原基本上不含其它細胞物質和/或化學物質。本文所用的"中和抗體"(或"中和hTNF a活性的抗體")用以指其與hTNF a結合導致hTNF a生物活性抑制的抗體。可以通過測定hTNF a的生物活性的一種或多種指示劑，諸如hTNF a誘導的細胞毒性(體外或體內)、hTNFa誘導的細胞活化和hTNF a與hTNF a受體結合來評價對hTNF a生物活性的這種抑制作用?？梢酝ㄟ^本領域中公知的幾種體外或體內標準試驗中的一種或多種評價hTNF a生物活性的這些指示劑(參見美國專利US 6，090, 382)。優選根據hTNF a誘導的L929細胞的細胞毒性的抑制評價抗體中和hTNFa活性的能力。作為額外或備選的hTNF a活性的參數，可以評價抗體抑制hTNF a誘導的HUVEC上ELAM-I表達的能力作為hTNF a誘導的細胞活化的測量標準。本文所用的術語"表面等離振子共振"指的是能夠通過使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, NJ)檢測生物傳感器基質內蛋白質濃度改變對生物特異性相互作用進行實時分析的光學現象。就進一步的描述而言，參見下列文獻美國專利 US 6，258，562 和J6nSSOn等(1993)Ann. Biol. Clin. 51 :19 ；J6nsson 等(1991)Biotechniques 11 :620-627 ；Johnsson 等(1995)J Mol. Recognit. 8 125 ;和 Johnnson 等(1991) Anal. Biochem. 198 :268。本文所用的術語"Ktjff"用以指抗體從抗體/抗原復合物中解離的脫離速率常數。本文所用的術語"Kd"用以指特定抗體-抗原相互作用的解離常數。本文所用的術語"IC5/用以指抑制所關注的生物終點，例如中和細胞毒性活性所需的抑制劑濃度。本文所用的術語"核酸分子"用以包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以為單鏈或雙鏈的，但優選雙鏈DNA。在本文中涉及編碼結合hTNF a的抗體或抗體部分(例如VH、VL、⑶R3)的核酸中所用的術語"分離的核酸分子"用以指核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼結合非hTNF a的抗原的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列，其它序列抗原天然位于人基因組DNA中的核酸的側翼。因此,例如,本發明編碼抗-hTNFa抗體的VH區的分離的核酸不含編碼結合非hTNFa的抗原的VH區的其它序列。本文所用的術語"載體"用以指能夠轉運另一種它所連接的核酸的核酸分子。載體的一種類型為"質粒"。它指的是抗原連入額外的DNA片段的環狀雙鏈DNA環區。另一種類型的載體為病毒載體，其中可以將額外的DNA片段連入病毒基因組。某些載體能夠在導入它們的宿主細胞中自主復制(例如帶有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。可以將其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞時整合入宿主細胞基因組，且由此與宿主基因組復制。此外，某些載體能夠指導它們可操作地連接的基因的表達。這類載體在本文中稱作"重組表達載體"(或單純稱作"表達載體")。一般來說，重組DNA技術中應用的表達載體通常為質粒形式。在本說明書中，"質粒"和"載體"在質粒為最常用的載體形式時可以互換使用。然而，本發明用以包括這類表達載體的其它形式，諸如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們執行等同功倉泛。本文所用的術語"重組宿主細胞"(或單純的"宿主細胞")用以指已經導入重組表達載體的細胞。應理解這類術語不僅指特定的受試細胞，而且指這類細胞的子代。因為某些變型可以因突變或環境影響而發生成功傳代，所以實際上，這類子代可能與親代細胞不同，但仍然包括在本文所用的術語"宿主細胞"范圍內。本文所用的術語"劑量"指的是對受試者給予的TNFa的量。本文所用的術語"多變劑量"包括為進行治療而對受試者給予的TNFa抑制劑的不同劑量。"多變劑量方案"或"多變劑量療法"描述了基于在整個治療過程中的不同時間點處給予不同量的TNFa抑制劑的治療方案。在一個實施方案中，本發明描述了包括誘導期和治療期的多變劑量治療方法，其中在非治療期的誘導期過程中給予較高劑量的TNFa抑制劑。本文所用的術語"誘導期"或"負荷劑量"指的是包括對受試者給予TNF a抑 制劑以便獲得閾水平的治療期。在誘導期過程中，對患有TNFa有害的病癥的受試者給予至少一種誘導劑量的TNF a抑制劑。本文所用的術語"閾水平"指的是受試者的TNFa抑制劑的治療有效水平。通過在治療的誘導期過程中給予至少一種誘導劑量實現閾水平?？梢越o予任意數量的誘導劑量以實現TNF a抑制劑的閾水平。一旦達到閾水平，就啟動治療期。本文所用的術語"誘導劑量"或"負荷劑量"指的是TNFa抑制劑的第一種劑量，它高于維持或治療劑量。誘導劑量可以為單劑量，或者可以為一組劑量。誘導劑量通常用于使藥物在體內達到穩態量并且可以用于迅速達到維持藥物水平。在誘導劑量后給予較小劑量的TNFa抑制劑，即治療劑量。在療法的誘導期過程中給予誘導劑量。在本發明的一個實施方案中，誘導劑量至少兩倍于指定量的治療劑量。在本發明的另一個實施方案中， D2E7的誘導劑量為160mg。在另一個實施方案中，D2E7的誘導劑量為80mg。本文所用的術語"治療期"或"維持期"指的是包括對受試者給予TNF a抑制劑以維持所需治療作用的治療期。治療期之后是誘導期，且由此一旦達到閾水平就啟動。本文所用的術語"治療劑量"或"維持劑量"是為維持或持續所需治療作用而抑制TNFa或由受試者攝取的量。在誘導劑量后給予治療劑量。治療劑量可以為單劑量，或者可以為一組劑量。在療法的治療期給予治療劑量。治療劑量通常小于誘導劑量并且在依次給藥時可以彼此相等。在一個實施方案中，本發明描述了 D2E7的至少一種誘導劑量約為160mg，隨后是約80mg的至少一種治療劑量。在另一個實施方案中，在誘導劑量后至少2周給予治療劑量。"劑量方案"或"給藥方案"包括基于確定的一組劑量的治療方案。在一個實施方案中，本發明描述了用于治療克羅恩病的劑量方案，其中首先給予作為誘導劑量的D2E7且然后給予低于誘導劑量的治療劑量。本文所用的術語"給藥"指的是為實現治療目的(例如治療TNF a-相關病癥)而給予一種物質(例如抗-TNF a抗體)。術語"兩周一次的給藥方案"、"兩周一次的給藥"和"兩周一次給藥"指的是為實現治療目的(例如治療TNFa -相關病癥)而給予一種物質(例如抗-TNF a抗體)的時程。兩周一次的給藥方案并不包括每周一次的給藥方案。優選將所述物質每9-19天，更優選每11-17天，甚至更優選每13-15天且最優選每14天給藥一次。作為措詞"第一種活性劑于第二種活性劑組合"中的術語"組合"包括共同給予第一種活性劑與第二種活性劑，例如，可以將它們溶于或混入相同的藥物上可接受的載體，或給予第一種活性劑，隨后給予第二種活性劑，或給予第二種活性劑，隨后給予第一種活性劑。因此，本發明包括聯合的治療方法和聯用的藥物組合物。作為措詞"伴隨的治療"中的術語"伴隨"包括在第二種活性劑存在下給予活性劑。伴隨治療方法包括方法，其中將第一種、第二種、第三種或額外的活性劑共同給予。伴隨治療方法還包括方法，其中在有第二種或額外的活性劑存在下給予第一種或額外的活性齊U，其中，例如，可以預先給予第二種活性劑或額外的活性劑。伴隨治療方法可以由不同的執行者分步進行。例如，一位執行者可以對受試者給予第一種活性劑，并且第二位執行者可以對受試者給予第二種活性劑，且給藥步驟可以在同時進行或接近在同時進行，只要在第二種活性劑(和額外的活性劑)存在下的給藥之后給予第一種活性劑(和額外的活性劑)。執行者和受試者可以為相同的個體(例如人)。本文所用的術語"聯合療法"指的是給予兩種或多種治療物質，例如抗-TNF a抗體和另一種藥物，諸如DMARD或NSAID。在伴隨給予抗-TNF a抗體的同時，之前或之后給予其它藥物。術語"TNFa-介導 的疾病"或"TNF a -相關病癥"指的是局部和/或全身性生理障礙，其中TNFa為導致病癥表現的主要介體。本文所用的術語"kit"指的是包裝產品，它包括給予本發明TNFa抗體以治療TNFa-相關病癥的多種成分。該試劑盒優選包括容納試劑盒成分的盒或容器。所述的盒或容器上附著有標簽或食品與藥品監督管理局批準的方案。盒或容器內容納有優選包含有本發明成分的塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器。這些容器可以為加蓋的管或瓶。所述的試劑盒還可以包括給予本發明TNFa抗體的技術說明書。在一個實施方案中，本發明的試劑盒包括含有如PCT/IB03/04502和美國申請號US10/222140中所述的人抗體D2E7的制品。本文中進一步詳細描述了本發明的各個方面。IL本發明的TNFa抑制劑本發明提供了治療TNFa相關病癥的多變劑量方法，其中給予TNF a抑制劑為有益的。在一個實施方案中，這些方法包括給予分離的人抗體或其抗原-結合部分，它們結合具有高親和性和第脫離速率的人TNF a并且具有高度中和能力。優選本發明的人抗體為重組的中和人抗-hTNFa抗體。本發明最優選的重組中和抗體在本文中稱作D2E7，也稱作HUMIRA 和阿達木單抗(D2E7VL區的氨基酸序列如SEQ ID NO 1中所示；D2E7VH區的氨基酸序列如SEQ ID NO :2中所示)。Salfeld等在美國專利US 6，090，382、US 6，258，562和US6，509，015中已經描述了 D2E7 (HUMIRA )的特性，將這些文獻各
自引入本文作為參考。TNFa抑制劑的其它實例包括已經對治療類風濕性關節炎進行臨床測試的嵌合和人源化鼠抗-hTNF a抗體(例如，參見Elliott，M. J.等(1994) Lancet 344 1125-1127 ；Elliot, M. J.等(1994)Lancet 344 :1105-1110 ;Rankin，E. C.等(1995)Br. JRheumatol. 34 :334-342)。在一個實施方案中，本發明的多變劑量方法包括給予D2E7抗體和抗體部分、D2E7-相關抗體和抗體部分和其它與D2E7具有等同特性的人抗體和抗體部分，諸如與具有低解離動力學特性的hTNFa的高度親和結合性和高度中和能力。在一個實施方案中，本發明提供了使用分離的人抗體或其抗原結合部分的多變劑量治療方法，所述的分離的人抗體或其抗原結合部分通過表面等離振子共振測定的以I X IO-8M或I X IO-8M以下的Kd和I X IO-3S-1或I X IO-3S-1以下的Ktjff速率常數解離自人TNF a，并且在標準體外L929試驗中以I X KT7M或I X KT7M以下的IC50中和人TNF a細胞毒性。更優選分離的人抗體或其抗原-結合部分以5x 10_4M或5x 10_4M以下的Ktjff解離自人TNF a，乃至優選以I X KT4M或I X KT4M以下的Ktjff解離自人TNF a。更優選分離的人抗體或其抗原-結合部分在標準體外L929試驗中以I X 10_8M或I X 10_8M以下的IC5tl中和人TNF a細胞毒性，甚至更優選以I X KT9M或I X KT9M以下的IC5tl中和人TNF a細胞毒性，且更優選以I X KTkiM或I X KTkiM以下的IC5tl中和人TNF a細胞毒性。在優選的實施方案中，所述的抗體為分離的人重組抗體或其抗原結合部分。本領域眾所周知抗體的重鏈和輕鏈CDR3結構域在結抗體針對抗原的結合特異性/親和性方面起重要作用。因此，在另一個方面中，本發明涉及通過給予人抗體治療TNFa活性為有害的TNF a相關病癥的多變劑量方法，所述的人抗體對結合hTNF a而言具有緩慢的解離動力學特性并且帶有結構上與D2E7的結構相同或相關的輕鏈和重鏈CDR3結構域。D2E7VL⑶R3的9位可以被Ala或Thr占據，而基本上不會影響1(。 。因此，D2E7VL⑶R3的共有基序包括氨基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO :3)。另外，D2E7VH CDR3的12位可以被Tyr或Asn占據，而基本上不會影響Ktjfft5因此，D2E7VH⑶R3的共共有基序包括氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO :4)。此外，正如美國專利US6, 090, 382的實施例2中所示，D2E7重鏈和輕鏈的⑶R3結構域適合于被丙氨酸殘基取代(在VL CDR3內的1、4、5、7或8位上或在VH CDR3內的2、3、4、5、6、8、9、10或11位上)，而基本上不影響Ktjfft5此外，本領域技術人員可以理解，由于得到了 D2E7VL和VH⑶R3結構域被丙氨酸取代的適合性的結果，所以在CDR3結構域內能夠取代其它氨基酸，同時仍然可以保持抗體的的脫離速率常數，特別是使用保守氨基酸進行取代。優選在D2E7VL和/或VH⑶R3結構域內進行不常規1-5個保守氨基酸取代。更優選在D2E7VL和/或VH⑶R3結構域內進行不常規1-3個保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代應在用于結合hTNF a的關鍵氨基酸位置上進行。D2E7VL CDR3的2和5位和D2E7VH CDR3的I和7位看起來對與hTNF a相互作用而言是關鍵的，且由此保守氨基酸取代優選不在這些位置上進行(不過，如上所述，在D2E7VL⑶R3的5位上進行丙氨酸取代是可接受的)(參見美國專利US 6，090, 382)。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了通過給予分離的人抗體或其抗原-結合部分治療TNF a相關病癥的多變劑量方法。所述的抗體或其抗原-結合部分優選含有下列特征a)以I X KT3s-1或I X lO、-1以下的Koff速率常數解離自人TNF a，正如通過表面等離振子共振測定的；b)具有輕鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列或通過在1、4、5、7或8位上的單一丙氨酸取代或在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1_5個保守氨基酸取代而從SEQ ID NO 3中修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈CDR3結構域，它包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列或通過在2、3、4、5、
6、8、9、10或11位上的單一丙氨酸取代或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1_5個保守氨基酸取代而從SEQ ID NO :4中修飾的氨基酸序列。更優選所述的抗體或其抗原-結合部分以5x KT45T1或5x KT45T1以下的Ktjff解離自人TNFa。甚至更優選所述的抗體或其抗原-結合部分以IX 10_4 s—1或lXKrY1以下的Ktjff解離自人TNF a。在另一個實施方案中，本發明提供了通過給予分離的人抗體或其抗原-結合部分治療TNF a相關病癥的多變劑量方法。所述的抗體或其抗原-結合部分優選含有輕鏈可變區(LCVR)與重鏈可變區(HCVR)，其中輕鏈可變區(LCVR)具有⑶R3結構域，它包括SEQ IDNO :3的氨基酸序列或通過在1、4、5、7或8位上的單一丙氨酸取代而從SEQ ID NO :3中修飾的氨基酸序列；其中重鏈可變區(HCVR)具有CDR3結構域，它包括SEQ ID NO 4的氨基 酸序列或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的單一丙氨酸取代而從SEQ ID NO :4中修飾的氨基酸序列。優選LCVR進一步具有包括SEQ ID NO 5的氨基酸序列⑶R2結構域(即D2E7VL⑶R2)，并且HCVR進一步具有包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的⑶R2結構域(即D2E7VH CDR2)。甚至更優選LCVR進一步具有包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的CDRl結構域(即D2E7VIXDR1)，并且HCVR具有包括SEQ ID NO 8的氨基酸序列的⑶Rl結構域(即D2E7VHCDR1)。VL的構架區優選來自Vk I人種系族，優選來自A20人種系Vk基因，并且最優選來自美國專利US 6，090，382的附圖IA和IB中所示的D2E7VL構架序列。VH的構架區來自Vh3人種系族，更優選來自DP-31人種系VH基因，并且最優選來自美國專利US 6，090, 382的附圖2A和2B中所示的D2E7VH構架序列。
因此，在另一個實施方案中，本發明提供了通過給予分離的人抗體或其抗原-結合部分治療TNF a相關病癥的多變劑量方法。所述的抗體或其抗原-結合部分優選含有包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)(即D2E7VL)和包括SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重鏈可變區(HCVR)(即D2E7VH)。在某些實施方案中，所述的抗體包括重鏈恒定區，諸如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區。優選重鏈恒定區為IgGl重鏈恒定區或IgG4重鏈恒定區。此外，所述的抗體可以包括輕鏈恒定區，即K輕鏈恒定區或入輕鏈恒定區。優選所述的抗體包括K輕鏈恒定區?；蛘?，所述的抗體部分可以為，例如Fab片段或單鏈Fv片段。在另一個實施方案中，本發明提供了治療TNFa相關病癥的多變劑量方法，其中給予抗-TNF a抗體在于有益地給予分離的人抗體或其抗原-結合部分。所述的抗體或其抗原-結合部分優選含有D2E7-相關VL和VH CDR3結構域，例如帶有具有CDR3結構域的輕鏈可變區(LCVR)或帶有具有CDR3結構域的重鏈可變區(HCVR)的抗體或其抗原-結合部分，具有CDR3結構域的輕鏈可變區(LCVR)包括選自SEQ ID N0:3、SEQ ID NO =IUSEQ IDNO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17, SEQID NO 18, SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :25和SEQ ID NO :26組成的組的氨基酸序列，具有CDR3結構域的重鏈可變區(HCVR)包括選自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34 和 SEQ IDNO 35組成的組的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發明的TNFa抑制劑為依那西普(描述在WO 91/03553和WO 09/406476中)、英夫利昔單抗(描述在美國專利US 5，656，272中)、CDP571 (人源化單克隆抗-TNF- a IgG4抗體)、⑶P 870 (人源化單克隆抗-TNF- a抗體片段)、D2E7 (人抗-TNF mAb)、可溶性TNF受體I型或加入聚乙二醇的可溶性TNF受體I型(PEGsTNF-Rl)。可以修飾本發明的TNFa抗體。在某些實施方案中，可以對TNF a抗體或其抗原結合片段進行化學修飾以便得到所需作用。例如，根據下列文獻中所述，通過本領域關注公知的任意加入聚乙二醇反應給本發明的抗體和抗體片段加入聚乙二醇Focus on GrowthFactors 3:4-10(1992) ；EP 0154316 ;和EP 0401384(將這些文獻各自完整地引入本文作為參考)。優選通過與聚乙二醇分子(或類似的反應性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻尤刖垡叶肌Ρ景l明抗體和抗體片段加入聚乙二醇的優選水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)。本文所用的"聚乙二醇"指的是包括已經用于衍生其它蛋白質的任意形式的PEG，諸如一(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。制備本發明加入聚乙二醇的抗體和抗體片段的方法一般包括下列步驟(a)使所述的抗體或抗體片段與聚乙二醇，例如PEG的反應性酯或醛衍生物在抗體或抗體片段與一個或多個PEG基團連接的條件下反應；和(b)獲得反應產物。本領域技術人員顯然可以基于公知參數和所需結果選擇最佳反應條件或酰化反應。加入聚乙二醇的抗體和抗體片段一般可以用于治療本發明的TNFa-相關病癥，通過給予本文所述的TNFa抗體和抗體片段來進行。一般來說，加入聚乙二醇的抗體和抗體片段與未加入聚乙二醇的抗體和抗體片段相比具有增加的半衰期?？梢詥为殹⒐餐蚺c其它藥物組合物聯合使用加入聚乙二醇的抗體和抗體片段。在本發明的另一個實施方案中，可以改變TNFa抗體或其片段，其中修飾抗體的 恒定區以便與未修飾的抗體相比減少至少一個恒定區-介導的生物效應子功能。為了修飾本發明的抗體，以便其表現出與Fe受體減少的結合，可以使抗體的免疫球蛋白恒定區片段在對Fe受體(FcR)相互作用必不可少的特定區上發生突變(例如，參見Canfield，S.M.和
S.L. Morrison (1991) J Exp. Med 173 :1483-1491 jPLund，J.等(1991) J. Of Immunol. 147 2657-2662)。FcR結合抗體能力的降低還可以減少依賴于FcR相互作用的其它效應子功能，諸如調理作用和胞吞作用和抗原依賴性細胞細胞毒性。可以衍生本發明的抗體或抗體部分或使其與另一種功能分子(例如另一種肽或蛋白質)連接。因此，本發明的抗體和抗體部分用以包括本文所述的人抗-hTNFa抗體的衍生和其它修飾形式，包括免疫粘附分子。例如，可以使本發明的抗體或抗體部分(通過化學偶聯、遺傳融合、非共價結合或其它)與一種或多種其它分子本體，諸如另一種抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)，檢測試劑，細胞毒性劑，藥物活性劑和/或可以介導抗體或抗體部分與另一種分子(諸如鏈霉抗生物素核心區或聚組氨酸標記)結合的蛋白質或肽進行功能連接。通過交聯兩種或多種抗體(相同類型或不同類型，例如生成雙特異性抗體)產生一種類型的衍生抗體。合適的交聯劑包括那些為異雙官能的帶有兩個不同的通過合適的間隔基分開的反應基團的交聯劑(例如間-馬來酰亞氨基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙官能交聯劑(例如辛二酸二琥拍酰亞胺酯)。這類交聯劑購自Pierce ChemicalCompany, Rockford，IL0可以用本發明抗體或抗體部分衍生的有用的可檢測試劑包括熒光化合物。典型的可檢測試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、5-二甲胺-I-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。還可以用可檢測酶衍生抗體，諸如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。當用可檢測酶衍生抗體時，通過添加額外的試劑檢測它，其中酶可以利用所述的額外的試劑產生可檢測的反應產物。例如，當存在可檢測試劑辣根過氧化物酶時，添加過氧化氫和二氨基聯苯產生顯色的反應產物，它為可檢測到的。還可以使用生物素衍生抗體并且通過間接測定抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素結合進行檢測。可以通過宿主細胞中免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因的重組表達制備本發明的抗體或抗體部分。為了以重組方式表達抗體，用攜帶編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的一種或多種重組表達載體轉染宿主細胞，以便在宿主細胞中表達輕鏈和重鏈，并且優選使其分泌入培養宿主細胞的培養基，可以從該培養基中回收所述抗體。標準的重組DNA方法用于恒定抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因摻入重組表達載體并且將該載體導入宿主細胞，諸如下列文獻中所述的那些細胞Sambrook，Fritsch和Maniatis (eds)，MolecularCloning，-A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N. Y.，(1989)，Ausubel, F. M.等(eds.) Current Protocols，Molecular Biology, Greene PublishingAssociates, (1989)和 Boss 等的美國專利 US4, 816，397。為了表達D2E7或D2E7-相關抗體，首先獲得編碼輕鏈和重鏈可變區的DNA片段?？梢酝ㄟ^使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增和修飾種系輕鏈和重鏈可變序列來獲得這些DNAs。人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列為本領域中公知的(例如，參見"Vbase"人種系序列數據庫；另外參見 Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and 人 Services, NIH
發明者E·查特斯, G·R·格蘭尼曼, L·K·泰勒, P·嚴, R·S·霍夫曼 申請人:艾博特生物技術有限公司