專利名稱：一種采用振蕩式生物反應器制備豬瘟活疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及疫苗制備領域，具體地，涉及采用振蕩式生物反應器制備豬瘟活疫苗的方法。
背景技術：
豬痕(classical swine fever, CSF)最早發(fā)生于1833年美國的俄亥俄州，初稱豬霍亂，1903年被證明病原體是一種病毒，歐洲 則稱之為古典豬瘟。我國最早1925年在東南大學農科院有免疫血清方面的研究報告。豬瘟是世界范圍內豬的最嚴重的疾病之一，因而被OIE (國際獸醫(yī)局)列為A類傳染病，我國也將其列為一類傳染病。其病原為豬瘟病毒(CSFV)，屬黃病毒科瘟病毒屬成員。以出血和發(fā)熱為主要特征，是一種對豬危害極大的傳染病。當前使用的豬瘟疫苗均是用兔化弱毒疫苗(HCLV，即著名的C株，或中國株)，根據生產工藝的不同分為豬瘟活疫苗(細胞源)，即豬瘟細胞苗；豬瘟活疫苗(兔源)，即豬瘟組織苗，豬瘟組織苗又根據生產用成年兔還是乳兔分為豬瘟脾淋苗和豬瘟乳兔苗。世界公認的中國C株兔化弱毒的突出優(yōu)點是，用其接種的豬不產生病毒血癥和腦炎病變，可以安全地免疫接種任何懷孕期的母豬和哺乳仔豬，不影響受精率及存活率，不引起流產、死胎，可安全地用于建立種豬群(Tesmer等，1973)。常用的還有日本GPE株、法國Thiverval株等都是廣泛應用的CSFV疫苗株，一般均可提供終生免疫。傳統(tǒng)轉瓶法制備豬瘟活疫苗的工藝其不足在于存在外源污染的危險，產毒滴度較低；單位體積內有效工作細胞數量較低；效率低下，批次間差異大，穩(wěn)定性差。因此開發(fā)研制新型制備豬瘟疫苗的方法是提高病毒產量和節(jié)約成本的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供穩(wěn)定高效制備豬瘟活疫苗的方法，以克服現有技術的不足。本發(fā)明提供一種采用振蕩式生物反應器制備豬瘟活疫苗的方法，包括下列步驟(I)培養(yǎng)制苗用細胞將制苗用細胞接種到含有細胞培養(yǎng)液與微載體的生物反應器罐內，啟動細胞吸附程序，振蕩式吸附3 4h后或細胞吸附率達80%以上時，轉化為細胞培養(yǎng)程序，進行振蕩式細胞培養(yǎng)，待細胞生長至I. 5X IO8 3X IO8個/g微載體時，停止培養(yǎng)；(2)繁殖制苗毒液將豬瘟病毒懸液接種于步驟(I)培養(yǎng)的細胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，進行振蕩式病毒培養(yǎng)，每I 2d收獲病毒液，并及時更換維持液,收獲次數為15 20次，匯總收獲的病毒液；(3)將經檢驗合格的病毒液澄清過濾，加入凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬瘟活疫苗。
本發(fā)明方法所用的生物反應器為BelloCell型振蕩式細胞微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器。該生物反應器主要由主體機臺、控制器及培養(yǎng)瓶組成。工作過程如下主體機臺由步進馬達驅動可上下移動薄板平臺。當平臺上升時，BelloCell-500內下方伸縮瓶中之培養(yǎng)基擠壓至上瓶身，而使得載體浸潤于培養(yǎng)基中，讓細胞進行所需養(yǎng)分和廢棄物的交換；當平臺下降時，培養(yǎng)基則再次回流至下方伸縮瓶，使載體暴露于空氣中，讓氧氣快速交換，形成良好的細胞培養(yǎng)環(huán)境。本發(fā)明方法步驟(I)中生物反應器罐內BioNoc II微載體密度為llg/L，接入細胞量為I X 107/g IX 108/g微載體。使用的微載體為多孔性不織布，微載體數量為865±5%個，約為5. 5g，約占IOml的空間，可提供細胞生長面積約達2400cm2/g。所述微載體為網狀和/或片狀。所述步驟(I)振蕩式細胞吸附程序參數為細胞培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. Omm/s，頂端停留25s，下降速度為I. Omm/s，底端停留Os ;振蕩式細胞培養(yǎng)程序參數為細 胞培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為1.5mm/s,頂端停留Os,下降速度為1.5mm/s,底端停留60s。本發(fā)明步驟⑵中接種10% 20%豬瘟兔化弱毒株細胞毒種或I % 2%豬瘟兔化弱毒株脾毒種，所述百分比為毒種與病毒培養(yǎng)液的體積比。所述豬瘟兔化弱毒株細胞毒種病毒滴度為每Iml含病毒> 100000個家兔感染量。所述豬瘟兔化弱毒株脾毒種病毒滴度為每Iml含病毒> 100000個家兔感染量。其中步驟(2)振蕩式病毒培養(yǎng)參數為病毒培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. Omm/s,頂端停留IOs ;病毒培養(yǎng)液通過微載體的下降速度I. Omm/s,底端停留30s。應當理解，本領域技術人員可根據實際生產情況進行反應器控制參數的調整。本發(fā)明步驟(2)病毒培養(yǎng)后獲得的病毒液每Iml含病毒> 1000000個家兔感染量。本發(fā)明制苗用細胞為PK15細胞系。本發(fā)明細胞培養(yǎng)液為含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培養(yǎng)液、維持液為含I 2%胎牛血清的MEM，pH值為7. 0 7. 4。本發(fā)明細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的條件為溫度為36. 5 37°C，CO2濃度1% 5%。本發(fā)明方法步驟(3)中所述的凍干保護劑為5%蔗糖脫脂牛奶。本發(fā)明提供了上述方法在制備豬瘟活疫苗中的應用。本發(fā)明提供了上述方法制備得到的豬瘟活疫苗。本發(fā)明提供了一種采用振蕩式生物反應器制備豬瘟活疫苗的方法，其有益效果在于I)本發(fā)明方法生產的豬瘟病毒毒價高，兔體熱反應含量比用傳統(tǒng)轉瓶工藝生產的豬瘟病毒高約10倍，按照《中華人民共和國獸藥典(2010版)》方法對制得的疫苗進行無菌、支原體、鑒別、外源病毒、安全、效力等各項檢驗，均符合中規(guī)定；2)應用振蕩式微載體反應器培養(yǎng)PK15細胞的豬瘟病毒工藝，微載體提供了更大的細胞貼壁表面積，單位體積培養(yǎng)液的細胞產率高，可以隨時觀察細胞在載體表面的生長情況，高培養(yǎng)密度PK15細胞能提高病毒滴度，本方法隨時監(jiān)控細胞生長或病毒繁殖時的最佳生化條件，且每批反應器生產上清的病毒滴度均一，培養(yǎng)基利用率高，病毒收獲過程不復雜，疫苗批次間差異小、質量穩(wěn)定；3)采用本發(fā)明振蕩式細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)相比，細胞培養(yǎng)方法簡單，培養(yǎng)時不產生剪切力與氣泡，細胞生長環(huán)境良好；4)本發(fā)明方法的培養(yǎng)系統(tǒng)占用空間小，且操作勞動強度小，減小污染環(huán)節(jié)，使其具有顯著的經濟效益。


圖I為細胞接種2天時微載體上細胞的顯微照片，箭頭所指為微載體上的細胞；圖2為病毒接種5天時微載體上細胞的顯微照片，箭頭所指為微載體上的細胞；圖3為振蕩式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器結構示意圖。
具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中所使用的生物反應器為美國賽宇公司的BelloCell型生物反應器(主機臺BelloStage-3000,控制器，罐體BelloCell-500)，所使用的載體為BioNoc II多孔性不織布，載體數量為865±5%個載體，約為5. 5g，約占IOml的空間，可提供細胞生長面積約達2400cm2/g。實施例中所使用的生物反應器主要由主體機臺、控制器及培養(yǎng)瓶組成。工作過程如下主體機臺由步進馬達驅動可上下移動薄板平臺。當平臺上升時，BelloCell-500內下方伸縮瓶中之培養(yǎng)基擠壓至上瓶身，而使得載體浸潤于培養(yǎng)基中，讓細胞進行所需養(yǎng)分和廢棄物的交換；當平臺下降時，培養(yǎng)基則再次回流至下方伸縮瓶，使載體暴露于空氣中，讓氧氣快速交換，形成良好的細胞培養(yǎng)環(huán)境。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I用振蕩式微載體懸浮生物反應器規(guī)模生產豬痕病毒(I)I、病毒與細胞株用于制作豬瘟活疫苗的病毒是豬瘟兔化弱毒株(C株)，來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，經過致病性測試，本弱毒株病毒不具有致病性(該毒株按照細胞毒種鑒定完全符合豬瘟兔化弱毒株毒種標準，對豬安全無副作用)。以對豬瘟兔化弱毒株(C株)具有良好敏感性的豬腎細胞系(PK15)，作為制苗用細胞系。2、制備方法2. I制苗用細胞的培養(yǎng)將制苗用細胞系PK15細胞接種到含500mLDMEM液體培養(yǎng)基(包括 8%胎牛血清(FBS)、100UI/mL青霉素、IOOii g/mL鏈霉素 pH7. 2)和 5. 5g BioNoc II載體的罐體內；細胞初始接種量為1.25父107個細胞/^微載體。于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，細胞吸附4h，使其最大量地吸附載體之上。細胞吸附程序參數為培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. Omm/s，頂端停留25s，下降速度為I. Omm/s，底端停留Os ; ;4h后，細胞吸附率達80%以上，切換為細胞培養(yǎng)程序，使接種細胞最高效的生長。細胞培養(yǎng)程序參數為培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. 5mm/s,頂端停留Os,下降速度為I. 5mm/s,底端停留60s。細胞接種2天時微載體上細胞的顯微照片見圖I。2. 2制苗毒液的繁殖于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，細胞在載體上生長4天，細胞數達3 X IO8個細胞/g微載體，將兔化弱毒株細胞毒種或豬瘟兔化弱毒株脾毒種(每Iml含病毒> 100000個家兔感染量)分別各自按病毒培養(yǎng)液體積的接種于上述細胞。以MEM為液體培養(yǎng)基(包括I % FBS、100UI/mL青霉素、100 u g/mL鏈霉素，pH7. 2)，倒置吸附Ih后,啟動病毒培養(yǎng)程序,即培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. Omm/s,持續(xù)IOs ;培養(yǎng)液通過微載體的下降速度為I. Omm/s，持續(xù)30s。于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液，從接毒后的第4天開始每天收獲病毒液一次，連續(xù)收獲20次，并置-20°C保存。病毒接種5天時微載體上細胞的顯微照片見圖2。本實施例所使用的振蕩式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器結構示意圖見圖3。收獲病毒液(半成品)的檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄42,49頁進行檢驗，檢驗結果無細菌、霉菌、支原體生長。細胞毒液對豬安全無副作用，各次收獲的病毒液分別用家兔測定，每Iml含病毒> 1000000個家兔感染量。 2. 3配苗、分裝及凍干經檢驗合格的病毒液，混合于同一容器內，澄清過濾后，按I I的比例加入5%蔗糖脫脂乳穩(wěn)定劑，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細胞毒液不少于
0.015mL，分裝凍干后制得成品。成品檢驗按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)進行檢驗。以豬瘟細胞毒、豬瘟脾毒為制苗毒種使用上述方法分別制成3批疫苗，共6批疫苗，豬瘟細胞毒源的疫苗編號分別為PK15-1-01、PK15-1-02、PK15-1-03和豬瘟脾毒源的疫苗編號為 PK15-1-11、PK15-1-12、PK15-1-13。3、結果3. I半成品檢驗制備6批半成品，按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)要求進行了無菌檢驗、支原體檢驗、支原體檢驗，6批半成品均未檢出細菌、霉菌、支原體和外源病毒，6批半成品病毒含量達到100萬家兔感染量/mL，是傳統(tǒng)轉瓶培養(yǎng)工藝生產豬瘟兔化弱疫苗(細胞源)半成品標準(5萬家兔感染量/mL)的20倍。3. 2成品檢驗3. 2. I物理性狀檢驗制備的6批疫苗，其均為乳白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加入稀釋液后溶解迅速，無異味。3. 2. 2無菌檢驗按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)附錄42頁進行檢驗，所制疫苗均為無菌生長。3. 2. 3支原體檢驗按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)附錄49頁進行檢驗，所制疫苗均為無支原體生長。3. 2. 4鑒別檢驗將疫苗用生理鹽水稀釋成每ml含100個兔子的最小感染量的病毒懸液，與等量的抗豬瘟病毒特異性血清充分混合，置15°C作用60分鐘，期間振搖2 3次。同時設病毒對照和生理鹽水對照。中和結束后，分別接種兔子2只，每只兔子耳靜脈注射I. 0ml，測溫方法及體溫反應標準同效力檢驗項。6批疫苗樣品的結果，除陽性對照組出現熱反應外，其余組在接種后120h內均不出現熱反應。3. 2. 5外源病毒檢驗按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)附錄40頁進行檢驗，所制疫苗均為無外源病毒污染。3. 2. 6安全檢驗用生理鹽水將疫苗稀釋成6頭份/ml，每批疫苗分別肌注健康易感豬4頭，每頭5ml (含30頭份)。接種后測溫觀察，按《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)72頁進行。結果表明各批次試驗豬體溫正常，其他體征正常，判斷疫苗合格。
3. 2. 7效力檢驗選擇用兔檢驗的方法，將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成不同濃度，耳緣靜脈注射體重I. 5 3. Okg的兔子2只，每只I. 0ml，按照《中華人們共和國獸藥典》(2010年版)72頁進行。疫苗效力檢驗合格，每頭份含有15000個家兔感染量，是傳統(tǒng)豬瘟活疫苗(細胞源)疫苗效力標準的20倍，結果見表I。表I家兔效力檢驗結果
權利要求
1.一種采用振蕩式生物反應器制備豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括下列步驟 1)培養(yǎng)制苗用細胞 將制苗用細胞接種到含有細胞培養(yǎng)液與微載體的生物反應器罐內，啟動細胞吸附程序，振蕩式吸附3 4h后或細胞吸附率達80%以上時，轉化為細胞培養(yǎng)程序，進行振蕩式細胞培養(yǎng)，待細胞生長至I. 5X IO8 3X IO8個/g微載體時，停止培養(yǎng)； 2)繁殖制苗毒液 將豬瘟病毒懸液接種于步驟I)培養(yǎng)的細胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，進行振蕩式病毒培養(yǎng)，每I 2d收獲病毒液,并及時更換維持液,收獲次數為15 20次,匯總收獲的病毒液； 3)將經檢驗合格的病毒液澄清過濾，加入凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬痕活疫苗。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物反應器為BelloCell型振蕩式細胞微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)生物反應器罐內BioNocII微載體密度為llg/L，接入細胞量為IXioVg IXioVg微載體。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)振蕩式細胞吸附程序參數為細胞培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為1.0mm/s,頂端停留25s,下降速度為1.0mm/s,底端停留Os ;振蕩式細胞培養(yǎng)程序參數為細胞培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為I. 5mm/s，頂端停留Os,下降速度為1.5mm/s,底端停留60s。
5.如權利要求I所述方法，其特征在于，步驟2)中接種10% 20%豬瘟兔化弱毒株細胞毒種或1% 2%豬瘟兔化弱毒株脾毒種，所述百分比為毒種與病毒培養(yǎng)液的體積比。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)振蕩式病毒培養(yǎng)參數為病毒培養(yǎng)液通過微載體的上升速度為1.0mm/s,頂端停留IOs ;病毒培養(yǎng)液通過微載體的下降速度1.0mm/s,底端停留30s。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)病毒培養(yǎng)后獲得的病毒液每Iml含病毒> 1000000個家兔感染量。
8.如權利要求I所述方法，其特征在于，所述制苗用細胞為PK15細胞系；細胞培養(yǎng)液為含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培養(yǎng)液為含I 2%胎牛血清的MEM，pH值為7. 0 7. 4 ;培養(yǎng)溫度為36. 5 37°C, CO2濃度1% 5%。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的凍干保護劑為5%蔗糖脫脂牛奶。
10.權利要求1-9任一所述的方法制備的豬瘟活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬瘟活疫苗的制備方法，該方法將制苗用細胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的振蕩式生物反應器中，使細胞貼附在微載體上。待細胞密度達到約108/g微載體時，接種豬瘟兔化弱毒株，繁殖病毒。收獲病毒液，澄清過濾后加入凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，得到豬瘟活疫苗。使用本發(fā)明的制備方法，細胞生長快、密度高、可連續(xù)培養(yǎng)和收獲，病毒產量高，生產工藝簡單。優(yōu)于目前使用的傳統(tǒng)制備豬瘟疫苗的方法，具有良好的應用前景。
文檔編號A61P31/14GK102743748SQ201210181238
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者周建民, 潘春剛, 田宇婧, 馬良 申請人:中牧實業(yè)股份有限公司