專利名稱：一種預防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的設計及其構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中的疫苗及其構建方法，尤其是涉及FnBPA分子為靶標的DNA疫苗及其構建方法。更具體地說，本發明涉及抗奶牛乳腺炎的核酸疫苗和編碼該疫苗的粘附素分子的特定核苷酸序列，抗原表位和表達方式。
背景技術：
由金黃色葡萄球菌引發的奶牛乳腺炎在世界范圍內都造成了巨大的損失。截止2011年我國奶牛存欄頭數1300萬頭，毎年由乳腺炎造成的經濟損失可達40億元。近些年來，抗生素的大量使用甚至濫用，使金黃色葡菌球菌的抗菌譜逐漸擴大，給臨床治療和預防金黃色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑戰。目前認為疫苗是防控金黃色葡菌球菌感染的有效方法。 迄今金黃色葡萄球菌疫苗研制經歷了全菌滅活苗、亞單位疫苗和DNA疫苗3次重大變革。1902年，Wright將體外培養的金黃色葡萄球菌全菌滅活，制成滅活苗免疫牛，結果免疫效果不理想，不能有效抵抗新的感染發生(赫娜，楊宏軍，王長法等.奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌疫苗研究進展.動物醫學進展，2009，30 (I) :93-96.)林峰強等(林峰強，胡松華，胡奇林等.奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎菌苗佐劑研究現狀.動物醫學進展，2004，25(6) 49-51.)針對滅活苗的不足研制出了針對金黃色葡萄球菌單ー成分的亞單位疫苗。目前，部分亞單位疫苗已應用于生產中，如在美國獲準使用的Soma-to-Staph和Lysigin 2種金黃色葡萄球菌疫苗及大腸桿菌J5菌苗均是基因工程亞單位疫苗。目前，在奶牛乳腺炎疫苗的研制方面，國內起步較晩。金黃色葡萄球菌黏附素纖連蛋白結合蛋白A(FnbpA)是細菌感染的先決條件(周宏，李韓平.金黃色葡萄球菌表面蛋白研究進展.生物技術通訊，2004，15 (I) :73-75.)，抑制其活性后可從根源上切斷金黃色葡萄球菌感染的途徑。幾乎所有的金黃色葡萄球菌都擁有FnbpA基因，都可以表達纖連蛋白結合蛋白A，此蛋白由于具有與宿主組織的特異黏附能力，正成為抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發的熱點分子。國內研制的FnBPA重組蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫組小鼠血清中即可檢測到抗體，而且隨著免疫時間的延長，抗體效價呈明顯的上升趨勢，在21d達到最高水平，之后抗體水平逐漸降低。通過對小鼠的免疫攻毒試驗可知，FnBPA基因工程亞單位疫苗可有效提高小鼠的抗體水平，免疫保護指數PI達80%，說明疫苗對金黃色葡萄球菌具有較強的免疫保護力。(張海燕，楊宏軍，王長法等.重組金黃色葡萄球菌FnbpA亞單位疫苗的研制.西北農林科技大學學報.2011，5 (39) :39-43.)。雖然基因工程亞單位疫苗具有抗原劑量大、純度高且無遺傳物質及宿主和培養基的成分等優點(張延齡，張暉.疫苗學.北京科學出版社2004 :345-377,421-504.)。此外基因工程亞單位疫苗誘導大動物的免疫應答持續時間短，且大動物的免疫成本高。為克服這些缺點，我們選擇了針對FnBPA的核酸疫苗。核酸疫苗又稱基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到質粒或病毒載體上，用重組質粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活體內以天然蛋白的形式呈遞抗原，激活機體免疫系統，井能持續的引發免疫反應。其無毒性返祖現象，對病毒變異株也起作用。因此DNA疫苗是近年來備受人們關注的ー種新型疫苗。Nour等研制了 CTLA4和ClfA的重組核酸疫苗并采用了共聚物陽離子包裝先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3個月后再用200 μ g的ClfA重組蛋白加強免疫一次，免疫牛產生了較強的體液免疫及細胞免疫反應(Adel NM Nour Eldin, Lulzim Shkreta, Br IanG Talbot，et a. I DNA imunization of dairy cows with the clumping factor A ofStaphylococcus aureus. Vaccine，2006，24 :1997-2006.)。國外已有基于 FnBP 的黏附機制來研制金黃色葡萄球菌DNA疫苗的報道。目前FnBP分子結構中的D區被稱作配體結合區，被認為是主要的免疫優勢表位，在目前研制的金黃色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。發明目的研究證實，不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的黏附素有一定差異。而且不同地區流行的菌株所產生的黏附素有一定差異。目前國內有關粘附素分子FnBPA的疫苗大多為亞單位疫苗，且抗原表位多針對配體結合區D區設計。因此為克服不同 來源菌株粘附素分子的差異，并且也為克服亞單位疫苗免疫應答持續時間短，且制作的成本高的缺點，本發明以FnBPA為免疫靶標，且抗原表位主要針對配體結合區A區及B區的序列設計的奶牛乳腺炎核酸疫苗。

發明內容
(I)本發明的目的之ー是提供了ー種核酸疫苗的設計以克服亞單位疫苗的不足。(2)為解決上述的技術問題，本發明采取了以下技術方案在抗原表位的選擇上選擇了本地區流行株FnBPA基因的A區和B區，克服了不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的粘附附素對本地疾病的免疫造成的差異。(3)所述的免疫靶基因位于真核表達載體PVAX-I中，此外還包括所有能在真核細胞中表達的載體pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pLXSN等載體。(4)本發明的第二個目的是提供一種本發明預防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PVAX-Fn的設計及其構建方法。(5)本發明預防奶牛乳腺炎核酸疫苗PVAX-Fn的設計及其構建方法，可包括以下步驟(A)用引物 koF5，CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3，，koR5，GCGCTC GAG CTA TTC AAT GTA TCC GTC AAC 3’。將 Kozak 序列與我們所選擇的 FnBPA 基因的優勢抗原表位相連接；(B)再將此連接好的基因片段連接到真核表達載體BamH I和Xhol I中；(C)在此以PVAX-I為出發載體。(6)本發明以上技術方案提供了一種以金黃色葡萄球菌FnBPA基因為靶標的核酸疫苗的設計和構建方法。本發明的特點可總結為該疫苗是針對當地流行菌株的抗原特點和分子流行特點而設計，免疫的抗原表位的選擇不同于其他的研究，選擇了 FnBPA基因的A區及B區的部分序列作為抗原表位，使用更為有效；該設計可增加疫苗DNA編碼序列在抗原提呈細胞中的表達水平，能夠較快的建立起免疫保護機制并具有長期而有效的保護作用，提高DNA疫苗的免疫活性。本發明在奶牛乳腺炎防治中新型疫苗的研制與開發方面發揮重要的作用，應用前景廣闊。發明效果(I)本發明與亞單位疫苗相比，制作簡單且成本降低。(2)本發明中將Kozak序列與抗原表位相連可增加抗原在細胞內的表達水平。(3)本發明與亞單位疫苗相比免疫應答持續時間長，可達3個月以上。(4)免疫后3個月攻毒保護效果可達66 %。(5)免疫表位的設計不同于以往的表位選擇，考慮了不同地區菌株存在的抗原多態性和對免疫的影響，選擇了地區流行株且抗原表位位于FnBPA的A區及B區，該抗原表位的選擇可克服不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的粘附素差異造成的免疫失敗。


圖I是FnBPA基因的PCR擴增結果的電泳圖，獲得得本地流行菌株的基因組DNA，并用PCR方法擴增FnBPA基因，可在1500bp處見到目的條帶。圖2是克隆的FnBPA基因序列同源性分析比較結果圖，序列分析比較的結果表明(圖2)我們選擇的FnBPA基因在本地分離株高度同源(> 94% )，與其他地區和國家流行菌株的核苷酸除了(CP002114)タト，同源性多在77. 7% -82%，這表明我們選擇的FnBPA基因具有自身獨特的序列特異性。圖3是PV-FnBPA重組質粒的酶切鑒定圖，重組質粒構建完成后，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行雙酶切鑒定。結果獲得1500bp左右的片段，與預期結果相符，提示上述抗原表位已連接到表達載體上。圖4是PV-FnBPA所用的載體圖，FnBPA目的片段與該載體連接。圖5是BHK-21細胞表達的目的蛋白的Western Blot分析圖,Western Blot實驗結果表明，所構建的重組質粒轉染BHK-21細胞后可以表達目的蛋白，大小約為66kD，且表達的重組目的蛋白能夠和抗FnBPA的高免血清發生特異性反應。圖6是實驗動物免疫后體液免疫的檢測，免疫后不同時間采集的血清經100倍稀釋后做一抗分別作ELISA檢測，0D450nm讀數，以空載體和PBS注射組做對照。我們研究的結果表明I免后(P < O. 01)及2免后(P < O. 001)粘附素分子FnbpA DNA疫苗免疫組(PVFn)誘導的抗體水平與對照組相比差異極顯著。圖7是實驗動物免疫后細胞免疫的檢測，ニ免90天后，對脾臟T淋巴細胞的MTT實驗檢測所得的刺激指數(stimulation index, SI)。MTT實驗的結果顯示PV-SGFn比空載體組和空白對照組更能刺激機體的細胞免疫水平。統計分析表明PV-SGFn與空載體組和空白對照組差異顯著。
實施例構建奶牛乳腺炎FnBPA基因的真核表達載體(I)獲得本地流行菌株的基因組DNA，并用PCR方法擴增FnBPA基因(圖I)。 (2)篩選具有良好免疫原性和抗原多樣性FnBPA基因的優勢表位，FnBPA基因的A區及B區的部分基因，作為DNA疫苗的候選序列。
(3)序列分析比較的結果表明(圖2)我們選擇的FnBPA基因在本地分離株高度同源(> 94%)，與其他地區和國家流行菌株的核苷酸除了(CP002114)タト，同源性多在77. 7% -82%，這表明我們選擇的FnBPA基因具有自身獨特的序列特異性。(4)通過PCR反應將FnBPA基因優勢表位基因與Kozak序列連接。(所用引物koF5’ CGG GAT CCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3’， koR5’ GCG CTC GAG CTA TTCAAT GTA TCC GTC AAC 3’)。(5)將連接好的片段引入PVAX-I真核表達載體(圖4)。(6)構建完成后，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行PCR鑒定(引物序列為F5’ATGGCT AACGTT AAT CAT AT 3，，R5，AAT GTA TCC GTC AAC 3’)。結果獲得 1500bp 左右的片段，與預期結果相符，提示上述抗原表位已連接到表達載體上(圖3)。同時將重組的載體送去測序，以驗證序列。
鑒定好的陽性克隆用質粒大提試劑盒提取質粒，檢測質粒的濃度及純度。重組質粒體外表達的檢測收集的轉染后48h左右的細胞與5 X SDS loading buffer混合煮沸處理，空載體作為陰性對照SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉膜。一抗濃度I : 80037°C孵育2h，用PBST洗膜5次，將I : 500稀釋的HRP標記羊抗兔IgG 37°C溫育lh，PBST洗膜5次，DAB顯色液顯色3min,觀察結果。Western Blot實驗結果表明(圖5)，所構建的重組質粒轉染BHK-21細胞后可以表達目的蛋白，大小約為66kD，且表達的重組目的蛋白能夠和抗FnBPA的高免血清發生特異性反應。實驗動物免疫后體液免疫的檢測(I)免疫前及姆次免疫后2周后對免疫小鼠進行斷尾采血,分離血清。用間接ELISA方法檢測免疫前及各免后血清中抗體滴度。將FnBPA純化蛋白用PH = 9. 6的碳酸鈉緩沖液4°C進行過夜包被。對鼠血清進行不同濃度稀釋初始100倍稀釋，隨后倍比稀釋。將不同稀釋度的血清做ー抗37°C溫育2h。將羊抗鼠HRP標記的ニ抗I : 4000稀釋，37°C溫育Ih后，洗滌、顯色、終止，0D450nm讀數。(2)免疫后不同時間采集的血清經100倍稀釋后做一抗分別作ELISA檢測，0D450nm讀數，以空載體和PBS注射組做對照。結果如圖6。我們研究的結果表明I免后(P< O. 01)及2免后(P < O. 001)粘附素分子FnbpA DNA疫苗免疫組(PVFn)誘導的抗體水平與對照組相比差異極顯著。實驗動物免疫后細胞免疫的檢測(I)無菌摘取ニ免一個月后的小鼠脾臟，經200目篩網研磨后，用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，用Dhanks液3000r/min, 4°C洗漆兩次后,用細胞計數板對姆個樣品進行細胞計數后，用含有10%胎牛血清的1640培養液稀釋到2. 5X IO4個數量級。在96孔細胞培養板上每孔加IOOuL淋巴細胞稀釋液，每個樣品重復4孔，實驗組加入40 μ L刀豆蛋白A (ConA, 10 μ g/mL)同時對照組加入等量的1640培養液，另每孔加140 μ 1640培養液設純空白組，培養48小時后加入100uLMTT(10y g/ml)試劑。繼續培養4_6小時，加入150 μ LDMSO終止，輕輕震動使不溶于水的紫色結晶徹底溶解后OD57tl讀數。按以下公式計算刺激指數(stimulation index, SI)=(陽性 OD 值-空白 OD 值)/(細胞 OD 值-空白 OD 值)。
(2)用等量所構建的不同重組質粒免疫小鼠2次，ニ免90天后，對脾臟T淋巴細胞的MTT實驗檢測所得的刺激指數(stimulation index, SI)。如圖7所示，MTT實驗的結果顯示PV-SGFn比空載體組和空白對照組更能刺激機體的細胞免疫水平。統計分析表明PV-SGFn與空載體組和空白對照組差異顯著。動物實驗(1)取18只5-7周齡雌性小鼠分為3組(1.空白對照組，注射100 μ I生理鹽水；2.空載體組，注射100 μ g PVAX-I表達載體，3. PV-Fn組，注射100 μ g PV-Fn重組體，ニ免后3個月對小鼠進行攻毒試驗，以最小致死量7 X IO9CFU金黃色葡萄球菌腹腔注射6-8周齡的小鼠(體重25g左右)，攻毒后連續觀察7天，記錄每組試驗鼠的發表，死亡情況，計算免疫保護效率。(2)免疫接種后90天，用分離的乳源致病性金黃色葡萄球菌菌株進行攻毒試驗，經7天觀察，空白組6只小鼠12h全部死亡，空載體組6只小鼠24h全部死亡，PV-Fn重組質粒組保護率為66%。
權利要求
1.一種治療和預防奶牛乳腺炎的核酸疫苗。
2.根據權利要求I所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原表位包含奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌粘附素FnBPA分子相應抗原表位的特定核苷酸序列(包括FnBPA分子配體結合區A區及B區的部分序列)。該抗原表位具有其獨特性與新穎性，不同于以往的設計。
3.根據權利要求2所述的核酸疫苗，該疫苗具有SEQNOl所示的堿基序列，該序列為特定地區流行株的獨特序列。
4.根據權利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原分子FnBPA的基因的優勢抗原表位基因與Kozak序列組合在一起。
5.根據權利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于其抗原分子FnBPA的基因可位于任何真核表達載體中，包括但不限于pVAX-1，pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pEGFP-Cl和pLXSN等載體。
6.根據權利要求2所述的核酸疫苗，還涉及所述核苷酸用于生產疫苗的用途。
7.權利要求I所述的核酸疫苗的設計與構建方法，包括以下步驟:A)用引物koF5’CGGGATCCG GAA ATG GCT AAC GTT AAT CAT AT 3’，koR5’ GCG CTC GAG CTA TTC AAT GTA TCCGTCAAC 3’。將Kozak序列與我們所選擇的FnBPA基因的優勢抗原表位相連接；(B)再將此連接好的基因片段連接如真核表達載體中；(C)在此以PVAX-I為出發載體。
8.權利要求I所述的核酸疫苗的生產宿主細胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發明屬于微生物學，分子生物學及免疫學領域，涉及牛乳腺炎奶樣中金黃色葡萄球菌來源的粘附素分子FnBPA核酸疫苗的設計和制備使用。通過對來源于奶牛乳腺炎地區分離株FnBPA的部分基因的克隆，分析其序列及抗原表位，篩選抗原表位，設計并構建表達載體獲得了針對FnBPA分子特定表位的DNA疫苗。該DNA疫苗能刺激小鼠產生持久和顯著的特異性淋巴細胞增殖反應以及一定的體液免疫，與相應的空載體接種的陰性對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。同時攻毒實驗的結果表明該核酸疫苗能對免疫小鼠起到免疫保護的作用，該核酸疫苗能夠安全、有效地防治奶牛乳房炎且無藥物殘留，對奶牛乳腺炎的防治具有良好的應用前景。
文檔編號A61K39/085GK102847168SQ20121023610
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者蘇艷, 王世民, 張寶江, 邵俊高, 韋海娜 申請人:新疆農業大學