專利名稱：人骨髓間充質干細胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學領域，具體涉及一種人骨髓間充質干細胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應用。
背景技術：
強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一種常見的自身免疫性疾病,主要累及中軸關節及肌腱附著點，以炎性背痛和不對稱外周關節炎為主要癥狀，好發于青年，大多數23 30歲發病，男女比例約為2 :1。來自歐洲的報道稱AS患病率為0. 15%-1.8%，我國對12個省、市的120，451漢族人的流行病學調查數據顯示AS的患病率為0. 2%-0. 54%。AS主要病理特征為自身免疫性炎癥和病理性成骨，屬高致殘性疾病，隨著疾病的發展可導致嚴重的功能障礙，給患者帶來了沉重的心理和經濟負擔，但至今仍無治愈性治療手段。現 有的治療手段主要包括I.癥狀緩解藥物I. I非甾體抗炎藥(NSAIDs)NSAIDs通過抑制環氧化酶(COX)活性以減少花生四烯酸代謝成為前列腺素，從而控制炎癥和減輕關節腫痛。雖然NSAID消腫止痛起效快，是傳統治療AS的一線藥物，但是個體差異較大，并且停藥后癥狀易反跳，長期使用胃腸道反應較重。更為重要的是NSAIDs僅能緩解癥狀，并不能減緩患者病理性成骨，改變疾病進程。I. 2糖皮質激素(GC)其作用機制為抑制細胞及體液免疫，能迅速有效地減輕炎癥。本藥應用于癥狀明顯且不能被NSAID藥物控制的患者，但其副作用較NSAID更為嚴重，長期應用可干擾下丘腦一垂體一腎上腺軸，使患者出現免疫力低下、向心性肥胖，以及增加患者心血管風險。2.改善病情抗風濕藥物(DMARD)2. I 甲氨喋呤(MTX):本品通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸不能被還原成活性的四氫葉酸，導致DNA合成受阻，抑制腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素I(IL-I)等細胞因子的表達，發揮抗炎作用。但該藥起效緩慢(4飛周起效)，用藥至少維持半年，同時該藥可造成葉酸缺乏，從而產生骨髓移植以及口腔潰瘍等副作用。2. 2柳氮磺胺吡啶(SASP)SASP為5-氨基水楊酸和磺胺吡啶通過偶氮鍵連結的酸性化合物，該藥抗炎作用好，可減緩關節破壞的進程，并可降低血清IgA水平。但兩項大規模多中心臨床研究證實除非AS患者伴有嚴重的外周關節癥狀，否則SASP并不能改善患者情況，同時SASP還會造成惡心、嘔吐、頭痛、皮疹、造血功能障礙降低、肝腎功能異常等。3生物制劑TNF- a拮抗劑的問世被認為是近年來AS治療最重要的進展，TNF- a拮抗劑通過中和TNF，抑制其與TNF受體結合，從而實現其抗炎作用。現階段主要應用的TNF-a拮抗劑主要有2種依那西普和英夫利昔單抗。但TNF-a拮抗劑價格高昂，同時其療效個體差異較大。而且可造成感染，引發視神經炎、多發性硬化等神經系統病變，并加重充血性心力衰竭等。相關研究表明TNF-a拮抗劑并不能減緩AS患者病理性成骨過程。但它們均為非治愈性藥物，且可造成胃腸道反映、感染，甚至骨髓抑制，肝腎功能異常等嚴重副作用。正因為現存治療方法存在以上諸多不足。因此找到一種安全、有效且可改變疾病進程的治療方法顯得尤為重要。1976年Friedenstein等首次描述骨髓中存在間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSC)并證實其對造血干細胞的增殖和分化具有支持作用。MSC主要存在于全身的結締組織中，以骨髓的含量最豐富，其具有向中胚層多種組織如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織甚至神經外胚層的神經組織等分化的潛能。目前尚未篩選到MSC特有的標記分子，但一致的觀點認為SH2、SH3、⑶29、⑶44、⑶71、⑶90、⑶102等呈陽性，而⑶14、⑶34和⑶45等造血譜系分子表達陰性。由于MSC不·表達主要組織相容性復合體(MHC) II分子、⑶40、⑶80、⑶86等共刺激分子，不表達或極低水平表達MHC I，MSC不易被宿主T細胞識別，并能逃脫宿主免疫系統的排斥，因此認為MSC具有低免疫原性，并將其廣泛應用于心肌病、肝臟疾病及神經系統疾病中。Strauer等選擇18例陳舊性心肌梗死患者，病程5個月 8. 5年，經冠狀動脈注射自體MSC(間充質干細胞)，3個月后復查時發現梗死區面積減少30%，左心室射血分數升高15%，梗死壁運動速率升高57%，而對照組的以上三個指標與治療前相比無明顯變化。Moham adnejad等利用MSC治療4例晚期肝硬化患者，患者平均年齡47歲，且都具有慢性肝衰竭，門脈高壓癥狀，彩超顯示患者肝硬化，血清白蛋白、膽紅素明顯異常，晚期肝病模型(model for end stage liverdisease, MELD)評分大于16。抽取患者自體骨髓，并培養至細胞量為10. 2X IO6 6. 0X IO6后，用20ml生理鹽水混懸細胞，經肘靜脈緩慢注射。隨訪I年發現所有患者均存活，且所有患者均未出現急性腎衰竭、肝臟失代償加重及肝臟腫塊等并發癥。其中3例患者的肝功能明顯改善，MELD評分下降，并以術后6個月時效果最顯著。Mazzini等治療一組肌萎縮側索硬化患者，取骨髓培養MSC，溶于2ml自體腦脊液后注射入脊髓，隨訪3年，無死亡、腦脊髓的容積、結構改變和異常細胞增殖現象發生。于此同時越來越多的證據表明MSCs具有強大的免疫調節及抑制炎癥反應的能力，早在2002年人們已經發現MSCs可通過抑制T細胞的增殖發揮其免疫抑制作用，近期的研究已證明MSCs還可通過調節B淋巴細胞、NK細胞及樹突狀細胞來發揮其免疫調節作用，其免疫調節及炎癥抑制功能的發揮有賴于其分泌的各種因子和/或細胞間接觸。MSCs被廣泛用于輸注治療自身免疫相關疾病，國內外眾多科研院所不僅證明了 MSCs輸注的安全性，同時證明了其對自身免疫性疾病的可靠療效。2005年Garcia-Olmod等對5例合并瘺管的克羅恩病(Cronh disease)患者進行了自體MSC治療的I期臨床試驗，除I例患者由于MSC體外培養受到細菌污染而退出試驗，其余4例共8處瘺管接受了自體MSC瘺管局部注射，隨訪12 30個月(平均22個月)后，6處瘺管完全閉合，另2處部分閉合。Le Blanc K等人在歐洲進行的一項多中心的II期臨床試驗證明對55例對激素耐藥的急性GVHD患者使用了MSC,盡管使用的MSC來源不同，包括HLA全相合、半相合或HLA完全不相合的第三方供者，而且有的患者接受了多名供者的MSC，但經治療后30例患者獲得了完全反應，2年后，獲得完全反應的患者中有53%仍存活，而對MSC治療無反應的2年生存率僅有16%，結果還顯示，MSC供者的不同來源并不影響治療結果。同樣，強直性脊柱炎AS患者也存在著免疫紊亂的情況Yang等人的實驗證明，與正常人相比，AS患者體內的IL-23及IL-17水平明顯上升，而這可能是HLA-B27陽性等遺傳因素及各種環境因素綜合作用產生。Wendling D等人也發現IL-17在RA患者和AS患者的關節滑液中有著較高的表達。而且在AS和RA患者外周血的研究中也發現了 Thl7細胞的增多。

發明內容
本發明的目的是提供人骨髓間充質干細胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應 用。本發明人在體外實驗發現強直性脊柱炎AS患者的外周血及壞死股骨頭局部IL-17和IL-23等炎性因子的含量明顯高于正常人；同時還觀察到AS患者外周血Thl7細胞增多，Treg細胞降低，Thl7/Treg比例升高，全身處于炎性狀態。另外經實驗證實雖然AS患者MSC在增殖、分化及遷移能力等方面與正常人MSC沒有任何差異，但是AS患者MSC存在明顯的免疫調節能力異常，表現為混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction, MLR)中AS患者MSC較正常人MSC抑制淋巴細胞增殖的能力明顯下降。因此，經體內試驗和體外試驗研究，AS患者體內確實存在免疫紊亂，并且患者自身體內MSC也發生了免疫調節的異常，導致AS患者體內免疫紊亂不能得到干預和糾正，體內炎性情況得以持續和加劇，反過來又進一步惡化和加重病情。本發明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質干細胞BMSCs，患者的治療效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意絕大多數AS患者全身炎性情況明顯降低、病變關節疼痛程度明顯減弱、個人活動范圍和強度明顯增強；部分原先服藥的AS患者在接受細胞治療后停藥數月病情仍不復發；少數對NSAIDs和TNF拮抗劑(如益賽普)等無效的AS患者經過輸注正常人骨髓間充質干細胞BMSCs治療后臨床癥狀改善情況顯著。另外，靜脈輸注正常人骨髓間充質干細胞BMSCs治療AS患者起效快、持續時間久病人在接受細胞輸注I個月后治療效果十分明顯，相當長時間可持續發揮治療作用。臨床試驗也證實靜脈輸注正常人骨髓間充質干細胞BMSCs治療AS患者具有安全有效、無任何不良副作用的特點目前為止尚未發現任何一例接受靜脈輸入健康人骨髓間充質干細胞BMSCs治療的AS病人發生排斥反應、過敏反應、休克甚至出現死亡。由此可見，人骨髓間充質干細胞BMSCs能應用在制備治療強直性脊柱炎藥物中。本發明的人骨髓間充質干細胞BMSCs屬于現有技術，可通過現有技術的方法得到人骨髓間充質干細胞BMSCs。本發明針對AS患者MSC免疫調節能力下降，不能抑制Thl7和上調Treg，使Thl7/Treg比例失平衡導致全身處于炎性狀態，同時AS患者MSC成骨能力增強，造成AS患者病理性成骨，而這都是造成強直性脊柱炎的潛在病因。基于以上兩點本發明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質干細胞BMSCs，調節紊亂的免疫功能，并通過抑制MSC的病理性成骨，減緩或改變疾病進程。患者效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。人骨髓間充質干細胞BMSCs來源廣，治療費用較為合理。因此將人骨髓間充質干細胞BMSCs應用在制備治療強直性脊柱炎藥物中具有巨大的社會和經濟效益。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :一、人骨髓間充質干細胞BMSCs的制備人骨髓間充質干細胞BMSCs取自2(T30歲的健康志愿者，行髂后上棘骨髓穿刺，每次采集20ml。根據梯度離心原理，在445g、20°C的條件下采用Ficoll離 心30min，分離骨髓中的有核細胞，通過對人骨髓間充質干細胞BMSCs在培養皿的附壁特性進行篩選、培養及純化，具體步驟為培養液為低糖型DMEM培養基，含體積分數10%胎牛血清，以及2U/L青霉素、鏈霉素。在37°C，5%C02條件下培養48h后，更換培養液并去除懸浮細胞，并在以后每3^4天進行一次相似操作。當細胞融合度到80%時進行細胞傳代用PBS對上述細胞洗滌，之后使用胰酶消化，當貼壁細胞變為游離時，終止消化，離心后棄去上清，用PBS洗滌一次后，將細胞接種于培養液中，在37°C，5%C02條件下進行傳代培養，當細胞擴增進入第3代時，使用質量分數0. 25% 的胰蛋白酶 +lmmol/L EDTA(Sigma, USA)消化后混懸于 L_DMEM+10%FBS(美國 GIBCO公司及中國杭州四季清公司)培養液中，由此得到人骨髓間充質干細胞BMSCs，待用。二、人骨髓間充質干細胞BMSCs輸注對AS患者進行連續4周的人骨髓間充質干細胞BMSCs靜脈注射，每周I次，人骨髓間充質干細胞BMSCs的用量為lX106MSCs/kg (體重)，于IOml生理鹽水中懸混，并由患者肘靜脈緩慢注入。之后根據患者臨床癥狀和實驗室檢查適當調整治療方案。三、人骨髓間充質干細胞BMSCs輸注治療AS患者療效評價體系I、主觀評價Pain-VAS (疼痛視覺模擬評分)——評估治療前后患者疼痛改善情況；BAS-G (Bath強直性脊柱炎總體評分)——評估治療前后患者病情總體改善情況；BASFI (Bath強直性脊柱炎功能指數評分)——評估治療前后患者機體功能改善情況；BASDAI (Bath強直性脊柱炎病情活動指數評分)——評估治療前后患者病情活動程度變化情況；2、臨床指標外周血檢測CRP、ESR、TNF- a、IL-17, IL-23、BMP——評價治療前后患者全身炎性狀態變化情況；流式細胞術分析⑶4+T細胞、⑶8+T細胞、Thl7細胞、Treg細胞、NK細胞比例——評價治療前后患者淋巴細胞數量及亞群比例變化情況；脊柱活動度(包括擴胸度、枕墻距、耳墻距、踝間距、頸椎活動度、腰椎側彎度、修訂版Schober檢查)一評估治療前后患者脊柱活動度改善情況；3、影像學檢查全脊柱及雙側骶髂關節正側位X片——影像學評估治療前后患者中軸關節病情改善情況；全脊柱及雙側骶髂關節MRI——影像學評估治療前后患者中軸關節病情改善情況；ASspiMRI評估(強直性脊柱炎MRI評估)——評價治療前后患者影像學上病情改
善情況。四、應用骨髓間充質干細胞BMSCs治療強直性脊柱炎納入標準根據New York Diagnostic Criteria確診強直性脊柱炎。排除標準1、感染或有感染高風險的；2、腫瘤及腫瘤前期；3、嚴重伴隨癥狀，如心
腦血管疾病、肝腎及血液疾病；5、孕婦及哺乳期婦女。治療方案連續4周給予患者靜脈輸注I X 106/kg (體重)的BMSCs。檢測指標完成4周的BMSCs注射后，檢測患者的CRP、ESR、ASDAS-CRP、BASDAI、BASFI及血、大便、尿常規等。I、應用人骨髓間充質干細胞BMSCs治療15個TNF a拮抗劑抵抗的強直性脊柱炎患者對15個TNF a拮抗劑抵抗的強直性脊柱炎患者分別第0天、第I周、第2周、第3周給予患者肘靜脈輸注lX106BMSCs/kg (體重)的上述人骨髓間充質干細胞BMSCs后。患者ASDAS-CRP評分從治療前的4. 0±0. 5降到2. 4±0. 5。而BASFI評分也從5. 3±1. I降到3. 7±0. 9，關節腫脹數從治療前的21個降至IJ 13個。ASAS20達到100%，ASAS40達到60%(見表I)。對輸注人骨髓間充質干細胞BMSCs的患者進行了為期8周的隨訪，在隨訪中除了個別患者有注射點疼痛的癥狀外，無其他不適。同時包括血常規、尿常規、大便常規、肝功能在內的相關實驗室和影像學檢查也未發現明顯異常。由此說明，AS患者靜脈注射人骨髓間充質干細胞BMSCs，其治療效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。表I :MSC治療后患者各項指標改變
ASDAS-CRP~~BASDAI ~BASFI~ESR(mm/h) CRP mg/L
基礎值4. 0 + 0. 53. 5 + 1. 35. 3+1. I52. 6 + 24. 0 50. 4 + 24. I
~Iw3. 7 + 0. 53.0 + 1.24.9+1.47.8 + 22.4 46. 5 + 23.0
2w3. 4 + 0. 52. 6 + 1. I4. 4+1. I42. 1 + 22. I 40. 9 + 21. 7
3w2. 9 + 0. 52. 0+1. I4. 0+1. 037. 3+19. 3 31. 1 + 19. 7
4w2. 4 + 0. 5I. 4+1. 03. 7 + 0. 933. 1 + 17. 8 21. 9+18. 2
8w2. 6 + 0. 6I. 7+1. 03. 8 + 0. 931. 5+17. 4 26. 1 + 19. 02、患者麥XX，男，32歲，工人。因“腰背部僵硬雙膝腫脹7月余，加重伴乏力3天”來我院就診。患者7月前無明顯誘因出現腰背部僵硬，晨起明顯，活動后好轉，每次持續約45min。同時自覺雙膝腫脹，活動受限。查體患者脊柱各向活動受限，雙側膝關節均一腫大，屈曲困難。實驗室檢查ESR57mm/h、CRP54mg/L。X線顯示雙側骶髂關節間隙模糊，骨橋生成，腰椎小關節模糊。ASDAS-CRP評分5. 1，BASDAI4. O，BASFI5. 9。連續3周給予患者 輸注I X IOVkg (體重)人骨髓間充質干細胞BMSCs后，患者腰背部僵硬及雙膝腫脹情況明顯減輕，復查 ESR35mm/h、CRP29mg/L, ASDAS-CRP 評分 2. 5，BASDAI2. 0，BASFI3. 9。
權利要求
1.人骨髓間充質干細胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了人骨髓間充質干細胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應用。本發明針對AS患者MSC免疫調節能力下降，不能抑制Th17和上調Treg，使Th17/Treg比例失平衡導致全身處于炎性狀態，同時AS患者MSC成骨能力增強，造成AS患者病理性成骨，而這都是造成強直性脊柱炎的潛在病因。本發明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質干細胞BMSCs，調節紊亂的免疫功能，并通過抑制MSC的病理性成骨，減緩或改變疾病進程。患者效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。人骨髓間充質干細胞BMSCs來源廣，治療費用較為合理。因此將人骨髓間充質干細胞BMSCs應用在制備治療強直性脊柱炎藥物中具有巨大的社會和經濟效益。
文檔編號A61K35/28GK102793721SQ20121025572
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者沈慧勇 申請人:沈慧勇