專利名稱：Vstm1蛋白在制備抑制白血病細胞增殖產品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及ー種VSTMl蛋白在制備抑制白血病細胞増殖產品中的應用。
背景技術：
白血病是以造血細胞分化阻滯為特征的一類惡性疾病，目前根據累及的細胞類別不同分為淋巴細胞白血病、髓系白血病、紅白血病及巨核細胞白血病等。其中以急性髓系白血病(AML)因髓系細胞分化阻滯階段不同而呈現很大的異質性。傳統的對AML的FAB分型已經不足以反映AML的特征，臨床應用有限。因此，目前廣泛運用的WHO的分型將AML的免疫標志物表達(免疫分型)、細胞遺傳學改變及分子生物學(融合基因、突變)等納入分類因素，更詳細的反映了 AML的真實特征及其與預后的關系，對臨床治療的指導意義更大。 VSTMl (V-set and transmembrane domain containing I)是由北京大學人類疾病基因研究中心新發現的ー種潛在的細胞因子編碼基因。人類VSTMl基因定位于染色體19ql3. 42，存在五種剪切體，其中VSTMl-vl和VSTMl_v2是兩種主要形式。VSTMl-vl為I型膜蛋白，在NK、T、B、單核和粒細胞中廣泛表達，在大多數腫瘤來源的細胞系中表達缺失；VSTM1-V2為經典分泌的糖蛋白，能促進外周血CD4+T細胞分泌IL-17A。Gene Atlas數據庫提示VSTMl在正常骨髓CD33+髓系細胞中選擇性高表達，而在其它組織、細胞中的表達豐度非常低。提示VSTMl不僅參與正常髓系細胞的發生、發展，而且可能在血液腫瘤的病理機制中發揮重要作用。

發明內容
本發明提供了如下I) -5)中任一一種物質的新用途。本發明提供了如下1)-5)中任--種物質的在制備抑制白血病細胞增殖和/或治
療白血病產品中的應用I),VSTMl蛋白；2) VSTMl蛋白編碼基因；3)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的重組載體；4)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的表達盒；5)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的轉基因細胞系；所述VSTMl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述應用中，所述VSTMl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。上述應用中，所述含有所述VSTMl蛋白編碼基因的重組載體為將所述VSTMl蛋白編碼基因插入表達載體中得到的重組載體。上述含有所述VSTMl蛋白編碼基因的重組載體具體為pcDB-VSTMl，為將序列2(VSTMl蛋白編碼基因)插入pcDNA3.トMyc-his㈠B的Not I和Kpn I酶切位點間得到的載體。上述應用中，所述含有所述VSTMl蛋白編碼基因的轉基因細胞系為將所述重組載體轉入目的細胞得到的轉基因細胞系。
上述應用中，所述白血病細胞和所述目的細胞均為慢性髓性白血病細胞或巨核細胞白血病細胞系；所述慢性髓性白血病細胞系具體為K562細胞；所述巨核細胞白血病細胞具體為MEG-Ol細胞。本發明的另ー個目的是提供一種制備抑制白血病細胞増殖和/或治療白血病產品。本發明提供的產品，為上述的應用中的所述I) -5)中任--種物質。上述產品中，所述白血病細胞為慢性髓性白血病細胞或巨核細胞白血病細胞系；所述慢性髓性白血病細胞系具體為K562細胞；所述巨核細胞白血病細胞具體為MEG-Ol細胞。本發明的實驗證明，本發明發現VSTMl蛋白可以抑制白血病細胞的生長，將VSTMl蛋白編碼基因轉染白血病細胞K562細胞或MEG-Ol細胞，得到的轉基因細胞的生長均慢于不轉染該蛋白的編碼基因。說明過表達VSTMl可以抑制白血病細胞生長，可用于白血病治療，尤其是耐化療藥白血病的治療提供了新的途徑。


圖I為轉染細胞VSTMl蛋白表達水平檢測圖2為轉染VSTMl的K562及MEG-01細胞生長受抑
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到，部分具體如下列出I、小牛血清、RPMI1640 :購自GIBCO公司。2、人慢性髓性白血病細胞系K562和巨核細胞白血病細胞系MEG-01 (K562細胞購自中國科學院細胞庫，產品目錄號為TCHul91 ； MEG-OI細胞購自中國科學院細胞庫，產品目錄號為TCHul97)。5、6孔、24孔及96孔培養板購自Corning公司。7、突光素標記的單克隆抗體OHlb-PE :購自美國Becton Dickinson公司。8、多克隆抗體VSTM1-FITC :將抗原多肽免疫免，收集兔血清，純化并且熒光標記得到多克隆抗體VSTM1-FITC，抗原多肽為VSTMl，其氨基酸序列為序列表中的序列I。下述實施例中所用主要儀器設備I、超凈工作臺北京半導體設備廠。2、CO2培養箱美國NAPCO牌。3、低溫高速離心機GS_15R型,美國Beckman公司。4、流式細胞儀FACSort 型，美國 Becton Dickinson 公司。5、倒置光學顯微鏡日本Olympus公司。6、低速離心機BFX5_320型(白洋離心機廠)。下述實施例中的流式細胞檢測運用帶不同熒光素的抗白細胞表面抗原的抗體標記骨髓細胞，具體步驟如下(I)骨髄細胞計數取IOul樣本，加適量冰醋酸裂解紅細胞并稀釋血細胞，顯微鏡下計數；(2)按照抗體說明書加適量抗體至200 ill血樣，室溫(25 °C)避光孵育15min ；(3)加紅細胞裂解液(NH4CL1. 8675g, TrisO. 65g 蒸餾水 250ml)，室溫裂解 8min ；(4)離心 1200rpmX IOmin,棄上清液；(5)加磷酸緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)(購自上海耕欣生物科技有限公司。)洗兩遍；

(6)離心1200rpmX10min，棄上清液，加200 上流式細胞儀檢測。(7)數據分析下述實施例運用FCS Express V3軟件分析流式細胞術檢測數據。統計分析在SPSS軟件17. 0中進行。經不同濃度ATRA誘導分化后不同時間點的NB4細胞VSTMl表達水平與⑶Ilb表達水平的相關性采用Pearson相關系數分析。P值小于0. 05定義為有統計學差異。下述實施例中的VSTMl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。VSTMl蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列2 實施例I、轉染VSTMl的白血病細胞生長受抑VSTMl是胞漿尾端含有ITIM基序的抑制性受體，北京大學人類疾病基因基因研究中心的實驗結果表明VSTMl-vl胞內段的ITM基序在磷酸化后同樣可以與SHP-I相互作用，提示VSTMl-vl可能通過SHP-I傳遞抑制信號。而SHP-I作為ー種基本的負調控因子，通過酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)兩種酶調節蛋白水平酪氨酸殘基磷酸化，使酪氨酸磷酸化水平通過PTKs和PTPs分別催化酪氨酸殘基磷酸化和脫磷酸化而保持動態平衡。一旦這ー平衡被破壞打破，可促進細胞內與酪氨酸磷酸化相關的蛋白聚集，即可導致不正常的細胞増殖和分化。細胞內蛋白質磷酸化水平的提高是細胞癌變的重要表現之一，可能是細胞増殖分化機制的關鍵。因此SHP-I信號轉導不僅參與調節免疫細胞的活化，而且與細胞的増殖、分化甚至腫瘤的發生也密切相關。實驗表明，SHP-I可調節不同分化階段的造血平衡。一、細胞和質粒的制備K562、MEG-01 細胞用 10%FBS/RPMI1640 (4. 5g/L glucose, 4mM L-glutamine, IOOU/ml青霉素，lOOug/ml鏈霉素)培養。細胞復蘇及傳代按照常規進行。真核細胞表達質粒pcDB-VSTMl為將序列2 (VSTMl蛋白編碼基因)插入真核表達質粒pcDNA3. I-Myc-his (_)B (以下簡稱pcDB-null,購自Invitrogen公司，產品目錄號為V80020)的Not I和Kpn I酶切位點間得到的載體。ニ、細胞轉染轉染K562、MEG-01細胞采用陽離子轉染法，按產品說明書所述進行，操作步驟如下(I)細胞培養將K562、MEG_01細胞分別用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基鋪在細胞培養板中，在5% C02、37°C的培養箱中培養4小時；(2)制備 DNA-I ipofectamine 2000 復合物用 PBS (PH7. 2，購自上海耕欣生物科技有限公司)稀釋pcDB-VSTMl，緩慢混合均勻；同樣用PBS稀釋相應量的Iipofectamine 2000，緩慢混合均勻，在室溫(25 °C )下放置5分鐘后，再與稀釋的pcDB-VSTMl緩慢混合，室溫放置15分鐘，以形成DNA-Iipofectamine 2000復合物。(3)轉染將DNA-I ipofectamine 2000復合物緩慢滴入細胞培養板，輕微搖勻。5% C02，37°C的培養箱中培養。轉染第二天加入G418800 u g/ml篩選，后以400 u g/ml維持，待長出細胞克隆后挑取克隆，經擴增培養后用于實驗，分別得到轉染pcDB-VSTMl的K562細胞和轉染pcDB-VSTMl的MEG-Ol細胞；都經過提取質粒測序驗證正確。采用同樣的方法將空載體pcDB-null分別轉染K562細胞和MEG-01細胞，分別得到轉染pcDB-null的K562細胞和轉染pcDB-null的MEG-01細胞。三、檢測I、轉染細胞VSTMl的mRNA的表達水平檢測收獲轉染30天的轉染pcDB-VSTMl的K562細胞和轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，運用實時定量RCR檢測VSTMl的表達水平。反轉錄得到cDNA作為模板，利用上游引物 VSTMl-FP :5’ -GCCGAGGCAGAITTATCCAA-3’ ；下游引物 VSTMl-RP 5，-CCTGGGTGGTGTCTGAAGCT-3，；探針 VSTMl-probe 5，-FAM-CTCGACGGCAGACCCCCAAGG-BHQ-3，進行實時定量 PCR 擴增，以 ABL 為內參基因，內參的引物、探針為上游引物 ABLl-F :5’ -TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’ ；ABLl-R (序列表的序列 5):5’-GATGTAGITGCTTGGGACCCA-3’ ；探針 ABLl-T-probe (5，一 3’):FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRAo VATMl 的表達水平以 VSTM1/ABL 表示。以轉染pcDB-null的K562細胞和轉染pcDB-null的MEG-01細胞為對照。結果如下轉染pcDB-VSTMl的K562細胞中VSTMl的相對表達量為13. 323 ；轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞中VSTMl的相對表達量為9. 971 ；轉染pcDB-null的K562細胞中VSTMl的相對表達量為0. 000 ；轉染pcDB-null的MEG-01細胞中VSTMl的相對表達量為0. 000。2、轉染細胞VSTMl蛋白表達水平檢測收獲轉染30天的轉染pcDB-VSTMl的K562細胞和轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞，PBS洗兩遍后，加帶熒光素標記的抗VSTMl抗體(VSTM1-FITC)標記轉染細胞，轉染細胞VSTMl的表達水平以表達VSTMl的陽性細胞百分比和VSTMl平均熒光強度表示。以轉染pcDB-null的K562細胞和轉染pcDB-null的MEG-01細胞為對照。檢測方法采用上述的流式細胞檢測，抗體為VSTM1-FITC。結果如圖I所示，轉染pcDB-VSTMl的K562細胞中VSTMl的陽性細胞百分比和平均熒光強分別為70. 77%和318. 30 ；轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞中VSTMl的陽性細胞百分比和平均熒光強分別為69. 65% 和 214. 26 ；轉染pcDB-null的K562細胞中VSTMl的陽性細胞百分比和平均熒光強分別為3. 79% 和 72. 84 ；轉染pcDB-null的MEG-01細胞中VSTMl的陽性細胞百分比和平均熒光強分別為0. 61% 和 39. 94。從上述可以看出，VSTMl被成功轉染并表達于K562及MEG-01細胞表面。與轉染不含VSTMl基因的空載體(pcDB-null)相比，轉染攜帶VSTMl基因的真核表達載體(pcDB-VSTMl)的K562及MEG-Ol的VSTMl表達陽性率分別上升67%和69%。四、VSTMl的抑制白血病細胞增殖將上述經過分子和蛋白水平鑒定正確的轉染60天的轉染pcDB-VSTMl的K562細胞和轉染pcDB-VSTMl的MEG-Ol細胞以5000細胞/孔的密度接種于96孔板中，每組細胞設3個平行復孔，分別于ld、3d、5d(K562細胞)和ld、3d (MEG-01細胞)吸盡所有細胞進行細胞計數。將各時間點不同組的結果繪制成細胞生長曲線。以轉染pcDB-null的K562細胞、轉染pcDB-null的MEG-Ol細胞、K562細胞和MEG-Ol細胞為對照。結果如圖2所示，其中，A為轉染pcDB-VSTMl的K562細胞和轉染pcDB-null的K562細胞的結果；B為轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞和轉染pcDB-null的MEG-01細胞；轉染pcDB-VSTMl的K562細胞在轉染后第1、3、5天的細胞數量為7.51X103、
11.39X IO3UO. 77X IO3 ；轉染pcDB-VSTMl的MEG-01細胞在轉染后第1、3天的細胞數量為9. 54X 103、7. 64X 103 ；轉染pcDB-null的K562細胞在轉染后第1、3、5天的細胞數量為7. 25X 103、33. 28X 103、38. 58X IO3 ；轉染pcDB-null的MEG-01細胞在轉染后第1、3天的細胞數量為18. 25X 103、24. 03 X IO3 ；從上述結果可以看出，轉染后的細胞生長均受到明顯抑制，且轉染后第3天和第5天，轉染pcDB-VSTMl的K562細胞數明顯低于相應時間點轉染pcDB空載體(pcDB-null)的K562細胞(P值分別為0.009和0.015)。轉染后第I天和第3天，轉染pcDB-VSTMl的MEG-Ol細胞數明顯低于相應時間點轉染pcDB空載體(pcDB-null)的MEG-Ol細胞(P值分別為 0. 009 和 0. 043)。轉染pcDB-null的K562細胞與K562細胞結果無顯著差異；轉染pcDB-null的MEG-Ol細胞與MEG-Ol細胞結果無顯著差異。說明過表達VSTMl可以抑制白血病細胞生長，可用于白血病治療，尤其是為耐化療藥白血病的治療提供了新的途徑。
權利要求
1.如下1)-5)中任--種物質在制備抑制白血病細胞增殖和/或治療白血病產品中的應用 I)>VSTMl蛋白；2)VSTM1蛋白編碼基因；3)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的重組載體；4)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的表達盒；5)含有所述VSTMl蛋白編碼基因的轉基因細胞系; 所述VSTMl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于所述VSTMl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述含有所述VSTMl蛋白編碼基因的重組載體為將所述VSTMl蛋白編碼基因插入表達載體中得到的重組載體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于所述含有所述VSTMl蛋白編碼基因的轉基因細胞系為將所述重組載體轉入目的細胞得到的轉基因細胞系。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述白血病細胞和所述目的細胞均為慢性髓性白血病細胞或巨核細胞白血病細胞系；所述慢性髓性白血病細胞系具體為K562細胞；所述巨核細胞白血病細胞具體為MEG-Ol細胞。
6.一種制備抑制白血病細胞增殖和/或治療白血病產品，為權利要求1-5中任一所述的應用中的所述I) -5)中任--種物質。
7.根據權利要求6所述的產品，其特征在于所述白血病細胞為慢性髓性白血病細胞或巨核細胞白血病細胞系；所述慢性髓性白血病細胞系具體為K562細胞；所述巨核細胞白血病細胞具體為MEG-Ol細胞。
全文摘要
本發明公開了VSTM1蛋白在制備抑制白血病細胞增殖產品中的應用。本發明提供了如下1)-5)中任一一種物質在制備抑制白血病細胞增殖產品中的應用1)VSTM1蛋白；2)VSTM1蛋白編碼基因；3)含有所述VSTM1蛋白編碼基因的重組載體；4)含有所述VSTM1蛋白編碼基因的表達盒；5)含有所述VSTM1蛋白編碼基因的轉基因細胞系；所述VSTM1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發明的實驗證明，本發明說明過表達VSTM1可以抑制白血病細胞生長，可用于白血病治療，尤其是為耐化療藥白血病的治療提供了新的途徑。
文檔編號A61K48/00GK102764428SQ20121025658
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者冷馨, 李婷, 謝敏, 阮國瑞, 韓文玲, 馬大龍, 黃曉軍 申請人:北京大學人民醫院