專利名稱：一種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis,簡稱DVH)是雛鴨的ー種急性致死性傳染病。該病發(fā)生于孵化雛鴨的季節(jié)，一旦發(fā)生，在雛鴨群中傳播很快，發(fā)病率可達(dá)100%。其臨 床表現(xiàn)主要是角弓反張，病變主要為肝臟腫大并有出血斑點(diǎn)。本病最早發(fā)生于美國，其后在英國、加拿大、德國、意大利、印度等國陸續(xù)流行。我國自1958年在上海首次分離到鴨肝炎病毒DHV以來，相繼在全國許多省市流行發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響?zhàn)B鴨業(yè)健康發(fā)展的重要威脅。鴨肝炎病毒有3個(gè)血清型，即I、II、III，DVH病毒I型屬于小RNA病毒科，呈球形或類球形，直徑在20-40NM，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔増殖。病毒抵抗力強(qiáng)，在自然環(huán)境中可較長時(shí)間存活，目前普遍存在的鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒I型引起的。DVH病毒II型屬于星狀病毒，DVH-III屬于小RNA病毒。DVH病毒三種血清型之間無交叉保護(hù)作用。鴨病毒性肝炎病毒與鴨こ型肝炎病毒無任何相關(guān)性。近年來鴨病毒性肝炎已在我國蔓延，嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展，出現(xiàn)了使用I型鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黃抗體預(yù)防或治療無效的鴨群爆發(fā)疑似鴨肝炎的現(xiàn)象，懷疑為I型鴨肝炎變異株或新型鴨肝炎。用弱毒疫苗免疫雛鴨，受雛鴨本身免疫機(jī)能和母源抗體的影響，造成了鴨病毒性肝炎的局部暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的還在于提供ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。本發(fā)明的目的還在于提供ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備步驟為以I型鴨病毒性肝炎制備為例，(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進(jìn)行孵化至第5 7天，如果出現(xiàn)死亡、發(fā)育不良時(shí)，立刻進(jìn)行尿囊液的收獲，置于_80°C冰箱進(jìn)行保存；(2)培養(yǎng)病毒將步驟(I)中的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，每隔10 12h觀察細(xì)胞，如果細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞，-20°C和室溫反復(fù)凍融3次,5000r/min離心20 40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心
I.5 2. 5h，病毒含量達(dá)到IO7EID5tlA). ImL吋，收集鴨病毒性肝炎病毒；(3)脂類混合物的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega- ο中，使溶解完全，稀釋至8 12mg/mL，分裝，2 8°C保存?zhèn)溆茫?4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL, pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備pH為7. 2的PBS緩沖液稀釋病毒液到蛋白濃度為10mg/mL，加入濃度為20%的mega-ΙΟ至其終濃度為2%，室溫作用2 3h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2 3h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入皂苷QuilA和脂類混合物，其中皂苷質(zhì)量含量為O. I O. 2%,脂類混合物在復(fù)合物中的濃度為50 IOOuL/mL,將此溶液加入透析袋中進(jìn)行48 54h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。本發(fā)明復(fù)合物毒副作用小，免疫抗體效價(jià)高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合一些具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步詳細(xì)介紹。 實(shí)施例I(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進(jìn)行孵化至第5天時(shí)，觀察雞胚是否出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良或水腫。如果出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良和水腫時(shí)，立刻進(jìn)行尿囊液的收獲。收集的尿囊液放在_80°C冰箱進(jìn)行保存。如果第7天沒有出現(xiàn)觀察雞胚是否出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良則不能再收集,棄去全部雞胚；(2)培養(yǎng)病毒將準(zhǔn)備好的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，每隔12h進(jìn)行觀察細(xì)胞，如果細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞，-20°C和室溫反復(fù)凍融3次,5000r/min離心30min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心2h,取少量樣品進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察。病毒含量達(dá)到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步實(shí)驗(yàn)；(3)脂類混合物貯存液的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-10中，使溶解完全,稀釋至終濃度為8mg/mL,分裝,8°C保存?zhèn)溆茫?4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備用pH為7. 2的PBS緩沖液將病毒液稀釋到蛋白濃度為10mg/mL，加入濃度為20的％mega-10至其終濃度為2%，室溫作用3h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入O. 1%量的皂苷QuilA和脂類混合物50uL/mL，將此溶液加入透析袋中進(jìn)行48h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。實(shí)施例2(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進(jìn)行孵化至第6天時(shí)，觀察雞胚是否出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良或水腫。如果出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良和水腫時(shí)，立刻進(jìn)行尿囊液的收獲。收集的尿囊液放在_80°C冰箱進(jìn)行保存；(2)培養(yǎng)病毒將準(zhǔn)備好的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，每隔IOh進(jìn)行觀察細(xì)胞，如果細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞，-20°C和室溫反復(fù)凍融3次,5000r/min離心40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心I. 5h,取少量樣品進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察。病毒含量用。病毒含量達(dá)到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步實(shí)驗(yàn);(3)脂類混合物貯存液的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-10中，使溶解完全,稀釋至終濃度為10mg/mL分裝,5°C保存?zhèn)溆茫?4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備用pH為7. 2的PBS緩沖液將病毒液稀釋到蛋白濃度為10mg/mL，加入20%mega-10至終濃度為2%，室溫作用2. 5h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 5%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2. 5h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入O. 2%量的皂苷QuilA和脂類混合物lOOuL/mL，將此溶液加入透析袋中進(jìn)行50h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。·實(shí)施例3(I)鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中進(jìn)行孵化至第7天時(shí)，觀察雞胚是否出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良或水腫。如果出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良和水腫時(shí)，立刻進(jìn)行尿囊液的收獲。收集的尿囊液放在_80°C冰箱進(jìn)行保存；(2)培養(yǎng)病毒將準(zhǔn)備好的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，每隔Ilh進(jìn)行觀察細(xì)胞，如果細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞，-20°C和室溫反復(fù)凍融3次,5000r/min離心20min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心2. 5h,取少量樣品進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察。病毒含量達(dá)到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步實(shí)驗(yàn)；(3)脂類混合物貯存液的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-ΙΟ中，使溶解完全，稀釋至終濃度為12mg/mL，分裝，2°C保存?zhèn)溆茫?4)皂苷QuilA溶液的制備將O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH為6. 8的PBS緩沖液中，終濃度lmg/mL ；(5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備用pH為7. 2的PBS緩沖液將病毒液稀釋到蛋白濃度為10mg/mL，加入20%mega-10至終濃度為2%，室溫作用2h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心3h，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入O. 15%量的皂苷QuilA和脂類混合物80uL/mL，將此溶液加入透析袋中進(jìn)行54h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。
權(quán)利要求
1.ー種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物，其特征在于該復(fù)合物由鴨病毒性肝炎病毒與皂苷QuilA、脂類混合物在蔗糖墊上制備而成。
2.如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物，其特征在于皂苷QuilA的質(zhì)量含量為O. I O. 2%ο
3.如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物，其特征在于脂類混合物由磷脂酰こ醇胺、膽固醇和濃度為20%的mega-ΙΟ混合而成。
4.如權(quán)利要求3所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物，其特征在于脂類混合物的濃度為 50 100uL/mL。
5.一種如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備方法，其特征在于制備步驟包括 (O鴨病毒性肝炎病毒尿囊液的制備將鴨病毒性肝炎病毒接種9日齡的雞胚尿囊 腔中増殖，放在孵化箱中進(jìn)行孵化至第5 7天，如果出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良吋，立刻進(jìn)行尿囊液的收獲，置于_80°C冰箱進(jìn)行保存；如果雞胚超過第7天沒有出現(xiàn)死亡或者發(fā)育不良應(yīng)立刻棄去雞胚； (2)培養(yǎng)病毒將步驟(I)中的鴨病毒性肝炎病毒尿囊液接種單層鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C培養(yǎng)，每隔10 12h觀察細(xì)胞，如果細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞，-20°C和室溫反復(fù)凍融3次,5000r/min離心20 40min,取上清液,棄沉淀,上清液在14000r/min離心I. 5 2.5h，獲得鴨病毒性肝炎病毒； (3)脂類混合物的制備將磷脂酰こ醇胺和膽固醇加至濃度為20%的mega-ΙΟ中，使溶解完全，稀釋至8 12mg/mL,分裝,2 8°C保存?zhèn)溆茫? (4)皂苷QuilA溶液的制備將O.Olg皂苷QuilA溶于IOmL PBS緩沖液中，終濃度Img/mL ； (5)鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備磷酸鹽緩沖液PBS稀釋病毒液到蛋白濃度為10mg/mL，加入濃度為20%的mega-ΙΟ至其終濃度為2%，室溫作用2 3h，將病毒液鋪到蔗糖墊上，上層為PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖墊，14000r/min離心2 3h,收集樣品層和10%的鹿糖層，加入阜苷QuilA和脂類混合物，其中皂苷質(zhì)量含量為O. I O. 2%,脂類混合物在復(fù)合物中的濃度為50 100uL/mL，將此溶液加入透析袋中進(jìn)行48 54h的透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。
6.如權(quán)利要求5所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(2)獲得的鴨病毒性肝炎病毒含量彡IO7EID5tlA). lmL。
7.如權(quán)利要求5所述的鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(4)和步驟(5)中磷酸鹽緩沖液PBS pH分別為6. 8和7. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物，具體是將病毒性肝炎病毒接種雞胚，收集尿囊液，并在單層鴨胚成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)，獲得的鴨病毒性肝炎病毒含量≥107EID50/0.1mL，然后將此病毒液于蔗糖墊上，離心，收集樣品層和10%的蔗糖層，加入皂苷QuilA和脂類混合物，進(jìn)行透析，即制得鴨病毒性肝炎免疫刺激復(fù)合物。本發(fā)明復(fù)合物免疫活性高，毒副作用小。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102836427SQ20121030992
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者吳紅云, 韓改會(huì), 徐進(jìn) 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司