專利名稱：防治Ⅰ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法
技術領域：
本發明涉及禽類用生物制品技術領域，尤其是一種防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法。
背景技術：
鴨病毒性肝炎(Duck virus h印atitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的一種雛鴨高度致死性、急性傳染病。鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)包含嗜肝病毒科、 星狀病毒科和小核糖核酸病毒科3個病毒科的4種病毒。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，其對鴨沒有顯著的致病性；星狀病毒科引起II型鴨肝炎，目前為止僅英國有發病報道；小核糖核酸病毒科主要引起I型和III型鴨肝炎。
I型和III型鴨肝炎在臨床癥狀和病理變化上類似，但中和試驗和熒光抗體試驗證實二者無共同抗原成分，且III型鴨肝炎病毒的致病力不如I型鴨肝炎病毒。
I型鴨肝炎病毒致死性最強，該病毒呈球形或類球形，直徑在20-40nm，無囊膜，無血凝性，可在鴨、雞、鵝胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力強，在自然環境中可較長時間存活。由 DHV-1引起的鴨病毒性肝炎主要侵害1-3周齡雛鴨，發病嚴重，傳播迅速，病程短，臨床表現為發病急、死亡快，剖解病變特征主要為肝臟有明顯的出血點、出血斑，雛鴨通常在出現癥狀后Ih內死亡，10日齡內的雛鴨感染后死亡率可達90%以上。該病呈世界性分布，首次報道于1945年美國長島，1954年在英國病鴨中分離到該病毒，德國、意大利、印度、法國、蘇聯等相繼有本病的發生。我國1963年最早報道了該病在上海地區出現，20世紀80年代初期起本病在我國再次流行，之后北京、福建、浙江等多個地區爆發本病，流行區域廣，給我國養鴨業造成了嚴重損失。
DHV-1II屬于小RNA病毒，直徑約30nm,但與I型鴨肝炎病毒無關，由中和抗體試驗和熒光抗體實驗證實它們沒有共同抗原成分。Toth于1969年在美國長島首次報道了 DHV-1II引起的鴨病毒性肝炎，我國在1998年由劉兆宇等報道了III型DHV感染的發生。該疾病不如I型鴨肝炎病毒感染嚴重，雛鴨的死亡率很少超過30%，但大體病變與I型鴨肝炎病毒引起的相似。
近年來我國不斷從病鴨中同時分離到DHV-1和DHV-1II，證明相當多地區的鴨病毒性肝炎為DHV-1和DHV-1II的混合感染，且混合感染的病死率高于任何一種的單一感染，而治愈率低于任何一種的單一感染；而現有的鴨病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黃抗體絕大多數是針對I型鴨肝炎病毒研制的，因此對于DHV-1II單一感染及DHV-1和 DHV-1II混合感染的治療效果均不理想，給鴨病毒性肝炎的防治帶來了新的挑戰。發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種穩定性好、治療效果明顯、特異性強、制備安全方便的防治I型和III型鴨病毒性 肝炎單一感染及混合感染的二價蛋黃抗體的制備方法。
為實現本發明的目的所采用的技術方案是一種防治I型和III型鴨病毒性肝炎的 二價蛋黃抗體的制備方法，包括以下步驟I.制備I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋(I)選擇健康高產蛋雞隔離飼養，加強飼料營養，同時加喂專用抗生素制劑以預防 細菌感染；(2)制備I型和III型鴨肝炎病毒二價滅活苗A.制水相用冷凍保存的I型和III型鴨病毒性肝炎毒種稀釋后分別接種10日齡鴨胚， 24-72h后分別無菌采集死亡鴨胚胚體及胚液，勻漿，凍融后離心，取上清液，等體積混合制 成病毒液并對其進行滅活處理，取滅活后的病毒液與無菌吐溫-80進行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本-80和硬脂酸鋁，并將三種混合，攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相；C.制備油乳劑滅活苗將上述步驟I- (2) -A所制得的水相和步驟I- (2) -B所制得的油相進行混勻即 得;(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟I- (2)所制備的二價滅活苗免疫步驟I- (I)處理過的高產蛋雞，進行免 疫程序，待效價檢測均達到要求后收集雞蛋，即為I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞 蛋;2.利用步驟I制備的I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋制備蛋黃抗體(I)分離高免雞蛋蛋黃將步驟I制備的高免雞蛋進行消毒程序，然后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分 離；(2)提取卵黃抗體將步驟2- (I)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將蛋黃液稀釋8倍后，加入0. 2% 的辛酸，沉淀脂類，蛋黃抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛 的終濃度達到0. 1% (V/V)，對其進行過濾操作后，取濾液4°C保存備用；(3)配制、保存將步驟2- (2)所得濾液進行I型和III型鴨肝炎病毒抗體效價測定，用0. 01M、 PH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1:320 ;然后加入終濃度為0. 01%(V/V)的吐溫-80 作為穩定劑，攪拌均勻后進行無菌定量分裝。上述步驟I- (2)-A中的滅活處理是對病毒液用0. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。上述步驟I- (2) -A中病毒液與無菌吐溫-80的混合比例為96:4 (V/V)。上述步驟I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸鋁的混合比例為94:6:2 (V/V/W)。上述步驟I- (2) -C中水相和油相的混合比例為1:2 (V/V)0上述步驟I- (3)中的免疫程序是對免疫產蛋雞進行肌肉注射，免疫次數為3次， 劑量分別為0. 5ml/只，I. Oml/只，I. 5ml/只，第I次與第2次間隔10天，第2次與第3次 間隔14天，3次免疫后正常飼喂10天，此后每3天取樣進行效價檢測至I型和III型鴨肝炎 病毒抗體效價均達到要求。
上述步驟2- (I)中的消毒程序是對高免雞蛋用自來水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
上述步驟2- (2)中的過濾操作是先充分攪拌均勻后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾。
與現有技術相比，本發明的有益效果是
(I)本發明制備的I型和III型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體能針對I型和III型鴨病毒性肝炎單一感染及混合感染進行有效的防治，解決現有疫苗及血清抗體、卵黃抗體對混合感染治療無效的困境。
(2)同時本發明采用辛酸沉淀法提取I型和III型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，該法安全、價格低廉，適于大規模生產，且制備的蛋黃抗體純度高、效價高、性質穩定、易于保存。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
實施例
本發明所涉防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法，其步驟為
1.制備I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋
(I)選擇健康高產蛋雞隔離飼養，加強飼料營養，同時加喂專用抗生素制劑以預防細菌感染；
(2)制備I型和III型鴨肝炎病毒二價滅活苗
A.制水相
用冷凍保存的I型和III型鴨病毒性肝炎毒種稀釋后分別接種10日齡鴨胚， 24-72h后分別無菌采集死亡鴨胚胚體及胚液，勻漿，凍融后離心，取上清液，等體積混合制成病毒液并對其進行滅活處理，取滅活后的病毒液與無菌吐溫-80進行混合后制成水相， 病毒液與無菌吐溫-80的混合比例為96:4 (V/V)；
所述滅活處理是對病毒液用O. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。
B.制油相
取白油、司本-80和硬脂酸鋁，并將三種混合，三者的混合比例為94:6:2(V/V/W)， 攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相；
C.制備油乳劑滅活苗
將上述步驟1- (2) -A所制得的水相和步驟1- (2) -B所制得的油相進行混勻即得，水相和油相的混合比例為1:2 (V/V)；
(3)免疫產蛋雞 ，制備高免雞蛋
將步驟1- (2)所制備的二價滅活苗免疫步驟1- (I)處理過的高產蛋雞，對免疫產蛋雞進行肌肉注射，免疫次數為3次，劑量分別為O. 5ml/只，1. Oml/只，1. 5ml/只，第I 次與第2次間隔10天，第2次與第3次間隔14天，3次免疫后正常飼喂10天，此后每3天取樣進行效價檢測至I型和III型鴨肝炎病毒抗體效價均達到要求，收集雞蛋，即為I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋；
2.利用步驟I制備的I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋制備蛋黃抗體
( I)分離高免雞蛋蛋黃
將步驟I制備的高免雞蛋進行消毒程序，消毒程序是對高免雞蛋用自來水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min,然后用紗布擦干,用75%乙醇擦一遍晾干；然后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；
(2)提取卵黃抗體
將步驟2- (I)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將蛋黃液稀釋8倍后，加入O. 2% 的辛酸，沉淀脂類，蛋黃抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達到O. 1% (V/V)，對其進行過濾操作后，取濾液4°C保存備用；過濾操作是先充分攪拌均勻后密封60min,再用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾。
(3)配制、保存
將步驟2- (2)所得濾液進行I型和III型鴨肝炎病毒抗體效價測定，用O. 01M、 PH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1:320;然后加入終濃度為O. 01% (V/V)的吐溫-80作為穩定劑，攪拌均勻后進行無菌定量分裝。
上述效價檢測需同時滿足以下兩個條件
(I)中和抗體效價測定按現行《中國獸藥典》2010版附錄中和試驗法固定病毒稀釋血清法，使用檢驗用種毒與系列稀釋的抗體中和后，分別尿囊腔接種12日齡鴨胚，連續觀察5天，進行測定。中和抗體效價應不低于1:320。
(2)免疫攻毒法用3日齡易感雛鴨(鴨病毒性肝炎中和抗體效價不高于1:4) 30 只，隨機分為3組。第I組為空白對照組，每只腿部肌肉注射生理鹽水O. 5ml，隔離飼養；第 2組為預防組，每只腿部肌肉注射本品O. 5ml ;第3組為攻毒對照組，每只腿部肌肉注射生理鹽水O. 5ml。24小時后，第I組每只腿部肌肉注射生理鹽水O. 5ml ;第2組和第3組每只腿部肌肉注射檢驗用種毒O. 5ml (約200LD5(i)。連續觀察10天后，第I組應全部健活；第2組應至少健活8只；第3組應至少死亡8只。
臨床應用例
靜海縣某養殖戶，購買一批雛鴨的2天內生長良好，飲水、采食等正常，3日齡 (2010年08月16日)開始發病，并出現死亡，4日齡發病及死亡增加。
現場可見發病雛鴨精神不振、縮頸垂翅、行動遲緩、流淚、腹瀉、干腳，死前表現角弓反張。現場初診為鴨病毒性肝炎，隨后進行臨床試驗，并采集病料進行確診。剖檢可見主要表現肝臟腫大，表面散布大量出血點及出血斑，色黃、質脆，膽囊腫脹、質脆，脾腫大，其它器官無明顯病變。
為確診，取病死雛鴨數只，送實驗室進一步檢驗。實驗室無菌接種肝、脾、心于巧克力平板及麥康凱平板37°C培養24小時，均無細菌生長，繼續培養至48小時，仍無細菌生長。 肝、脾組織處理后的樣品液，接種12日齡鴨胚，連續觀察10日，7/10死亡；樣品液與DHV-1 高免血清中和后，接種12日齡鴨胚，連續觀察10日，3/10死亡；樣品液與DHV-1II高免血清中和后，接種12日齡鴨胚，連續觀察10日，5/10死亡^fDHV-1和DHV-1II高免血清 1:1 (v/v)混合后，與樣品液中和，接種12日齡鴨胚，連續觀察10日，無死亡胚。以樣品液在12日齡鴨胚盲傳3代后的尿囊液為樣品，進行RT-PCR檢測，可見DHV-1和DHV-1II相應條帶。因此，該病例確診為DHV-1和DHV-1II的混合感染。
對該鴨群進行臨床試驗，將雛鴨分為兩組
(1)試驗組共1227只，以2倍量腿部肌肉注射，進行緊急預防；
(2)對照組共200只，不做處理。
連續觀察I個月。
實驗結果如下
(1)試驗組注射后死亡下降，2天后停止死亡，未出現新的發病，恢復良好，無復發。試驗期間死亡共78只，死亡率為6. 36%。
(2)對照組死亡繼續增加，5天后停止死亡。雛鴨恢復緩慢，后期有少量復發死亡。試驗期間死亡共107只,死亡率為53. 5%。
臨床應用例證明，本產品緊急預防效果良好，能迅速控制疫病的傳染，無復發現象。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟.1)制備I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋；(1)選擇健康高產蛋雞隔離飼養，加強飼料營養，同時加喂專用抗生素制劑以預防細菌感染；(2)制備I型和III型鴨肝炎病毒二價滅活苗；A.制水相；用冷凍保存的I型和III型鴨病毒性肝炎毒種稀釋后分別接種10日齡鴨胚，24-72h后分別無菌采集死亡鴨胚胚體及胚液，勻漿，凍融后離心，取上清液，等體積混合制成病毒液并對其進行滅活處理，取滅活后的病毒液與無菌吐溫-80進行混合后制成水相；B.制油相；取白油、司本-80和硬脂酸鋁，并將三種混合，攪拌均勻后，高壓滅菌后制成油相；C.制備油乳劑滅活苗；將上述步驟1- (2)-A所制得的水相和步驟1- (2)-B所制得的油相進行混勻即得；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋；將步驟1- (2)所制備的二價滅活苗免疫步驟1- (1)處理過的高產蛋雞，進行免疫程序，待效價檢測均達到要求后收集雞蛋，即為I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋；.2)利用步驟I制備的I型和III型鴨病毒性肝炎的二價高免雞蛋制備蛋黃抗體；(1)分離高免雞蛋蛋黃；將步驟I制備的高免雞蛋進行消毒程序，然后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；(2)提取卵黃抗體；將步驟2- (1)所分離的蛋黃用TBS作為緩沖液，將蛋黃液稀釋8倍后，加入0. 2%的辛酸，沉淀脂類，蛋黃抗體保留在上清液中；再將40%甲醛溶液與該上清液混合，使甲醛的終濃度達到0. 1% (V/V)，對其進行過濾操作后，取濾液4°C保存備用；(3)配制、保存;將步驟2- (2)所得濾液進行I型和III型鴨肝炎病毒抗體效價測定，用0. 01M、pH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1:320 ;然后加入終濃度為0.01% (V/V)的吐溫-80作為穩定劑，攪拌均勻后進行無菌定量分裝。
2.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟1-(2)-Α中的滅活處理是對病毒液用0. 1%的甲醛37°C密封滅活48h。
3.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟1- (2)-A中病毒液與無菌吐溫-80的混合比例為96:4 (V/V)。
4.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟1- (2)-B中白油、司本-80和硬脂酸鋁的混合比例為94:6:2 (V/V/ W)。
5.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟1- (2)-C中水相和油相的混合比例為1:2 (V/V)。
6.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟1-(3)中的免疫程序是對免疫產蛋雞進行肌肉注射，免疫次數為3次，劑量分別為O. 5ml/只，1. Oml/只，1. 5ml/只，第I次與第2次間隔10天，第2次與第3次間隔14天，3次免疫后正常飼喂10天，此后每3天取樣進行效價檢測至I型和III型鴨肝炎病毒抗體效價均達到要求。
7.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟2- (I)中的消毒程序是對高免雞蛋用自來水沖洗干凈，再用O. 05%的百毒殺浸泡3-5min，然后用紗布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
8.根據權利要求1所述的防治I型和III型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法， 其特征在于所述步驟2- (2)中的過濾操作是先充分攪拌均勻后密封60min，再用O. 22 μ m 的微孔濾膜過濾。
全文摘要
本發明公開了一種防治Ⅰ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎的二價蛋黃抗體的制備方法，本發明制備的Ⅰ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體能針對Ⅰ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎單一感染及混合感染進行有效的防治，解決現有疫苗及血清抗體、卵黃抗體對混合感染治療無效的困境；同時本發明采用辛酸沉淀法提取Ⅰ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎二價蛋黃抗體，該法安全、價格低廉，適于大規模生產，且制備的蛋黃抗體純度高、效價高、性質穩定、易于保存。
文檔編號C07K16/02GK103059131SQ201210494639
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者宋秀梅, 王建, 劉麗麗, 殷立偉, 葛兆寧, 王震 申請人:天津市中升挑戰生物工程有限公司