專利名稱：鴨ⅰ型肝炎病毒lamp檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及鴨I型肝炎病毒檢測領域，尤其是一種鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒。
背景技術：
鴨I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I)是一種針對雛鴨的高度致死性病毒性傳染病的病原。該病主要侵害4周齡以內的雛鴨，死亡率高達90%以上，是危害養鴨業最為嚴重的傳染病之一。鴨I型肝炎病毒的傳統檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等，但這些檢測存在耗時長、敏感性較低、不易標準化等缺點，在實際應用中具有一定的局限性。目前，雖已建立起鴨I型肝炎病毒PCR檢測方法和熒光定量PCR檢測方法，其檢測敏感性也比較高，但是常規PCR需要使用PCR儀和進行凝膠電泳，熒光定量PCR則需要使用更加昂貴的熒光定量PCR儀和試劑等，因而難以適應基層現場檢測需要。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡便且成本低的鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒，以滿足基層現場快速檢測鴨I型肝炎病
毒的需要。為解決上述技術問題本發明采用如下技術方案鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒，試劑盒含有以下試劑反應液A 含有 IOX 等溫反應緩存液、5U/ul AMV、40U/ul inhibitor、Bst DNA 聚合酶8U/ul、IOmM dNTPs、25mM硫酸鎂、20uM的內引物1、20uM的內引物2、20uM的外引物1、 20uM的外引物2、20uM的環引物l、20uM的環引物2、5M甜菜堿、625 μ M鈣黃綠素和12. 5mM 氯化錳；10 X等溫反應緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM 氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；內引物 1 序列為 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA，內引物 2 序列為 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG，外引物1 序列為 GTACCATAAACCTGTTTTTCCT，外引物2 序列為 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT，環引物1 序列為 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA，環引物2 序列為 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC。反應液A每管24yL，其組成為2. 5ul IOX等溫反應緩存液、Iul 5U/ul AMV, Iul 40U/ulinhibitor、l. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、 0. 25ul20uM的內引物1、0. 25ul 20uM的內引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環引物l、lul 20uM的環引物2、0. 5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和 Iul 12. 5mM氯化錳和Iul雙蒸水。
本發明采用環介導等溫擴增(LAMP)技術，并根據鴨I型肝炎病毒共有的基因保守區(見序列表SEQ. ID. No. 1)設計了兩個特異性內引物、兩個特異性外引物和兩個特異性環引物，由此發明了用于快速檢測鴨I型肝炎病毒的鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒。應用本發明的LAMP檢測試劑盒建立鴨I型肝炎病毒檢測方法，僅需通過對組織樣品進行RNA提取并進行環介導等溫擴增，即可檢測出鴨I型肝炎病毒。該法無需昂貴的PCR儀只需普通水浴鍋，卻比PCR檢測有更高的靈敏度，且不必通過凝膠電泳觀察結果，操作簡單而快速， 特別適用于基層現場檢測。另外，常規的LAMP方法，需要在反應結束后開蓋加入SYBR Green I或Gene Finder染料來顯色，容易造成假陽性一方面，反應產物易形成氣溶膠而污染周圍環境造成假陽性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料還會由于引物二聚體而引起假陽性。因此，本發明使用內加鈣黃綠素+氯化錳替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反應液時就加入反應液中而無需LAMP反應后再開蓋加入；而且，鈣黃綠素+氯化錳僅在發生LAMP反應時才出現綠色，避免了 SYBR Green I和Gene Finder染料帶來的假陽性問題，所以具有更好的特異性。


圖1是應用本發明鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法特異性試驗結果圖。圖1中1鴨I型肝炎病毒AV2111株，2鴨I型肝炎病毒DHV/GX/91株，3鴨I型肝炎病毒DHV/GX/11株，4禽流感H9亞型，5鴨細小病毒，6鴨圓環病毒，7鴨副粘病毒，8小鵝瘟病毒，9鴨瘟病毒，10陰性對照。圖2是應用本發明鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗結果圖。圖2中1-8分別為以下不同濃度的鴨I型肝炎病毒RNA Ing/管，IOOpg/管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。圖3是PCR方法檢測鴨I型肝炎病毒敏感性試驗結果圖。圖3中M為IOObp DNA ladder, 1-8分別為以下不同濃度的鴨I型肝炎病毒RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。
具體實施例方式一、鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒的配制反應液A:每管24yL，其組成為2. 5ul IOX等溫反應緩存液、Iul 5U/ul AMV, lul40U/ul inhibitor、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、 0. 25ul 20uM的內引物1、0. 25ul 20uM的內引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環引物l、lul 20uM的環引物2、0. 5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和 Iul 12. 5mM氯化錳和Iul雙蒸水。其中，IOX等溫反應緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100。內引物 1 序列為 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA (見序列表 SEQ.ID. No. 2)，內引物 2 序列為 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG (見序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列為 GTACCATAAACCTGTTTTTCCT (見序列表 SEQ. ID. No. 4)，外引物2 序列為 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT (見序列表 SEQ. ID. No. 5)，環引物1 序列為 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA(見序列表 SEQ. ID. No. 6)，
環引物 2 序列為 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC(見序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、應用本發明鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒檢測鴨I型肝炎病毒的方法(以下簡稱LAMP檢測法)1.組織樣品中RNA的提取A.取肝組織5g，用碾磨磨碎后加入，反復凍融3次，10000轉離心5分鐘，收集 IOOul上清液，加入900ul Trizol液后，劇烈混勻，室溫放置IOmin ；B.加入200ul氯仿，劇烈混勻，室溫放置5min ；C. 12000 X g 離心 15min ；D.收集500ul上清，加入500ul異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ；E. 12000 Xg 離心 15min，去上清，加入 IOOOul 75% 乙醇，12000 X g 離心 15min，去
上清；F.在超凈臺內用自然干燥IOmin后加入20ul DEPC H2O溶解，即為待檢RAN，_20°C
保持備用。2.鴨I型肝炎病毒LAMP反應以提取的鴨I型肝炎病毒RNA為模板，在裝有24 μ L反應液A管中加入1 μ L待檢 RNA構成25ul反應體系；LAMP反應程序如下63°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為綠色，則說明樣品中含有鴨I型肝炎病毒；如果顏色為桔紅色，說明待檢樣品不含有鴨I型肝炎病毒。三、LAMP檢測法的特異性和敏感性試驗1.特異性試驗分別以鴨I型肝炎病毒AV2111株、鴨I型肝炎病毒DHV/GX/91株、鴨I型肝炎病毒DHV/GX/11株、禽流感H9亞型、鴨細小病毒、鴨圓環病毒、鴨副粘病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病的核酸為模板，以健康禽組織提取的RNA為陰性對照，按照前述鴨I型肝炎病毒LAMP反應體系和條件進行反應。結果見圖1，對鴨I型肝炎病毒AV2111株、DHV/GX/91株和DHV/GX/11株的檢測為陽性結果(顯示綠色)，而對禽流感H9亞型、鴨細小病毒、鴨圓環病毒、鴨副粘病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的檢測均為陰性(顯示桔紅色)。2.敏感性試驗將鴨I型肝炎病毒RNA按10倍遞增稀釋成lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、
lfg、0. Ifgo鴨I型肝炎病毒LAMP檢測方法檢出限與RT-PCR方法對比鴨I型肝炎病毒LAMP檢測方法反應體系和條件前述進行。鴨I型肝炎病毒RT-PCR反應組成如下在50ul的反應體系中含25mM MgCl2
52. 5ul, 10XPCR buffer 5ul, IOmM dNTPs 2ul，Taq 聚合酶(5U)0. 5ul，AMV(5U) 1 μ L， RI (40U) 1 μ L，上游引物 5-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3 和下游引物 5-GGAGGTGGTGCTGAAA-3 各 Iul，鴨I型肝炎病毒RNA模板lul，35ul雙蒸水。擴增程序為42V 45分鐘，94°C變性2分鐘，然后進入94°C變性1分鐘，57°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘的循環，共進行35個循環， 最后再經72°C延伸10分鐘。 鴨I型肝炎病毒LAMP檢測方法通過肉眼直接觀察結果，結果見圖2。將RT-PCR 產物在瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后進行溴化乙錠染色，結果見圖3。鴨I型肝炎病毒 LAMP檢測方法的檢測限為IOfg，而常規RT-PCR的檢測限為lpg，可見，LAMP方法敏感性比常規RT-PCR高100倍。
權利要求
1.一種鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑 反應液A 含有IOX等溫反應緩存液、5U/ul AMV、40U/ul inhibitor、Bst DNA聚合酶8U/uIUOmM dNTPs、25mM硫酸鎂、20uM的內引物l、20uM的內引物2、20uM的外引物l、20uM 的外引物2、20uM的環引物l、20uM的環引物2、5M甜菜堿、625 μ M鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；所述IOX等溫反應緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、 IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100 ；所述內引物 1 序列為 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA， 所述內引物 2 序列為 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG， 所述外引物1序列為GTACCATAAACCTGTTTTTCCT, 所述外引物 2 序列為 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT， 所述環引物 1 序列為 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA， 所述環引物 2 序列為 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC。
2.根據權利要求1所述的鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述反應液A每管24yL，其組成為2. 5ul IOX等溫反應緩存液、Iul 5U/ul AMV, Iul 40U/ulinhibitor、l. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、 0. 25ul20uM的內引物1、0. 25ul 20uM的內引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環引物l、lul 20uM的環引物2、0. 5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和 Iul 12. 5mM氯化錳和Iul雙蒸水。
全文摘要
本發明公開了一種鴨I型肝炎病毒LAMP檢測試劑盒，采用環介導等溫擴增(LAMP)技術，并根據鴨I型肝炎病毒共有的基因保守區設計了兩個特異性內引物、兩個特異性外引物和兩個特異性環引物。應用本發明及其建立的檢測方法，解決了現有技術檢測時間長、工作量大、交叉污染、操作復雜等缺陷。本發明具有特異性強、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡單，特別適于基層現場快速檢測鴨I型肝炎病毒的需要。
文檔編號C12R1/93GK102344973SQ20111035650
公開日2012年2月8日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所