專利名稱：一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法
技術領域：
本發明涉及組織工程用基材的生物活性化改性，尤其涉及一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法。
背景技術：
組織工程是一個涉及到醫學、化學、生物學、材料學等多學科、多領域的交叉研究課題。在組織工程的研究中，將功能分子有效的固定到生物醫用材料表面，構建生物活化支架材料是其中的重要環節，其直接影響到目的細胞和目的蛋白酶的活性和功能表達。功能
分子是指具有某些特定功能的高分子材料。它們之所以具有特定的功能，是由于在其分子鏈中結合了特定的功能基團，或分子與具有特定功能的其他材料進行了復合，或者二者兼而有之。功能分子通過特異的、高親和性的與細胞膜上的受體結合，最終刺激細胞增殖并產生其它生物學效應的多肽類物質。功能分子可傳遞、轉換或貯存物質、能量和信息，從而影響周圍組織細胞的生長、增殖及分化。功能分子對靶細胞的作用表現為多功能性。以肝素和透明質酸為例。肝素是一種較常用的抗凝血劑，能增強抗凝血酶與凝血酶的親和力，加速凝血酶的失活，抑制血小板的粘附聚集，增加血管壁的通透性，并可調控血管新生，因此是需要迅速達到抗凝作用的首選藥物。透明質酸能使細胞保持彼此分離，能使水分進入細胞間隙，并與蛋白質結合而形成蛋白凝膠，將細胞粘在一起，發揮正常的細胞代謝作用，起到保持細胞水分，保護細胞不受病原菌的侵害，加快恢復皮膚組織，提高創口愈合再生能力，減少疤痕，增強免疫力等作用。通過將這類功能分子組裝到基材表面，可以賦予基材不同的功能特點，最終將基材功能化。功能分子與生物醫用材料的復合是實現生物醫用材料生物活性化的重要手段，復合有功能分子的生物醫用材料可具有不同的功能特點。傳統的復合技術主要有物理吸附法和化學固定法。而簡單的物理吸附不能達到穩定固定功能分子的目的，而化學方法固定則有可能使功能分子喪失其生物活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡便易行的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法。本發明的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，包括以下步驟
(1)將去除氧化層及表面污潰的生物醫用材料浸泡于含O.l-3mg/ml多巴胺的緩沖液中，該緩沖液為IOmM的Tris-HCl緩沖液，其pH值為8. 5，浸泡反應I一36小時，反應溫度4一60°C，然后移至蒸餾水中漂洗O. 1—100分鐘，再用氮氣吹干；
(2)將吹干后的固定有多巴胺的生物醫用材料浸泡于濃度為O.l-3mg/ml功能分子的緩沖液中，該緩沖液為PBS緩沖液，其pH值為7. 4，反應I一36小時，浸泡反應溫度為4一37°c，然后移至蒸餾水中漂洗O. I —100分鐘，最后用氮氣吹干，即可獲得固定了功能分子的生物醫用材料。本發明中，所說的生物醫用材料是鎳鈦合金，鈷鉻合金，聚乙交酯，聚丙交酯，丙交酯與乙交酯的共聚物或聚已內酯。所說的功能分子可以是肝素、透明質酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、氨基酸或硫醇。所說的蒸餾水可以是雙蒸水，三蒸水或Milli-Q水。本發明中，多巴胺在緩沖液中的優選濃度為I一2mg/ml。本發明步驟(I)中，生物醫用材料在多巴胺溶液中優選浸泡反應時間為12 — 24小時，反應溫度為25— 50°C。步驟(O生物醫用材料在蒸餾水中優選漂洗時間為10 — 30分鐘。本發明中，功能分子的優選濃度為I一2mg/ml。本發明步驟(2)中，固定有多巴胺的生物醫用材料在功能分子中優選浸泡反應時間為12 — 24小時，反應溫度為25—30°C。步驟(2)中固定有功能分子的生物醫用材料在蒸餾水中優選漂洗時間為10 — 30分鐘。本發明以多巴胺為橋連介質，利用其在一定pH環境下較強的自聚合特性組裝到 生物醫用材料表面形成聚多巴胺層，然后利用化學反應將功能分子接枝到聚多巴胺層上，構建具有生物活性的生物醫用材料。本發明的優點
該方法充分利用了多巴胺在一定pH條件下的自聚合特性，通過聚多巴胺與帶有特定功能的功能分子發生化學反應，從而達到將功能分子固定到生物醫用材料表面的目的。該生物醫用材料范圍廣，可以是金屬材料、無機材料、有機高分子材料等。本方法采用先聚合，在生物醫用材料表面留下可反應的活性基團，再接枝固定功能分子，在解決組裝物質穩定化問題的同時又不破壞功能分子的功能，特別適合對功能分子功能要求嚴格的生物活化改性。該方法適用于能與聚多巴胺發生化學反應的功能分子，具有應用的廣泛性。通過本發明可以制備出具有特定功能的生物活性化的組織工程支架，可以廣泛地應用于心臟、血管、皮膚、軟骨、骨、神經、肌腱、心臟瓣膜等多種組織工程支架改性。


圖I為組裝肝素前后鎳鈦合金表面接觸角的變化
圖2a為組裝了肝素前后鎳鈦合金表面整體元素含量的變化 圖2b為組裝了肝素前后鎳鈦合金表面Ti 2p元素含量的變化 圖2c為組裝了肝素前后鎳鈦合金表面S 2p元素含量的變化 圖3a為未組裝多巴胺和肝素的鎳鈦合金的表面SEM圖 圖3b為組裝了多巴胺未組裝肝素的鎳鈦合金的表面SEM圖 圖3c為組裝了多巴胺和肝素的鎳鈦合金的表面SEM圖 圖4為組裝肝素前后的鎳鈦合金的抗凝血性能的變化 圖5為組裝多巴胺和肝素前后的鎳鈦合金的拓撲形貌的變化
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作詳細說明。實例I :
一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，包括以下步驟(1)將去除氧化層及表面污潰的鎳鈦合金浸泡于含2mg/ml多巴胺的緩沖液中，該緩沖液為IOmM的Tris-HCl，其pH值為8. 5，浸泡反應24小時，反應溫度50°C，然后移至雙蒸水中漂洗20分鐘，再用氮氣吹干；
(2)將吹干后的固定有多巴胺的鎳鈦合金浸泡于濃度為2mg/ml肝素的緩沖液中，該緩沖液為PBS緩沖液，其pH值為7. 4，反應12小時，浸泡反應溫度為37 °C。然后移至雙蒸水中漂洗10分鐘，最后用氮氣吹干，即可獲得固定了肝素的鎳鈦合金。組裝了聚多巴胺和肝素后分別用DSA10-MK2型表面張力儀測定其接觸角的變化從而跟蹤化學反應的發生(圖
I)。由圖I可見，隨著組裝過程的發生，鎳鈦合金表面的接觸角也同時發生了變化，證明了這兩種物質先后組裝到了鎳鈦合金的表面。組裝了肝素后用XPS分析儀測定表面元素的含量變化從而跟蹤化學反應的發生(圖2a、圖2b、圖2c)。由圖2a、圖2b、圖2c可見，隨著組裝過程的發生，鎳鈦合金表面的元素及含量也同時發生了變化，證明了這兩種物質先后組裝到了鎳鈦合金的表面。
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組裝了肝素后應用掃描電子顯微鏡(SEM)觀測其表面形貌的變化(圖3a、圖3b、圖3c)。結果顯示，組裝了肝素后鎳鈦合金表面呈現大量的聚合物，證明了兩種物質先后組·裝到了鎳鈦合金的表面。應用原子力掃描探針顯微鏡(AFM)觀測其表面拓撲形貌在組裝前后的變化(圖
4)。結果顯示，組裝了肝素后鎳鈦合金表面拓撲形貌及粗糙度發生了明顯的變化，證明了兩
種物質先后組裝到了鎳鈦合金的表面。
權利要求
1.一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將去除氧化層及表面污潰的生物醫用材料浸泡于含O.l-3mg/ml多巴胺的緩沖液中，該緩沖液為IOmM的Tris-HCl緩沖液，其pH值為8. 5，浸泡反應I一36小時，反應溫度4一60°C，然后移至蒸餾水中漂洗O. 1—100分鐘，再用氮氣吹干； (2)將吹干后的固定有多巴胺的生物醫用材料浸泡于濃度為O.l-3mg/ml功能分子的緩沖液中，該緩沖液為PBS緩沖液，其pH值為7. 4，反應I一36小時，浸泡反應溫度為4一37°C，然后移至蒸餾水中漂洗O. I —100分鐘，最后用氮氣吹干，即可獲得固定了功能分子的生物醫用材料。
2.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于所說的生物醫用材料是鎳鈦合金、鈷鉻合金、聚乙交酯、聚丙交酯、丙交酯與乙交酯的共聚物或聚已內酯。
3.根據權利要求書I所述的一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于多巴胺在緩沖液中的濃度為I一2mg/ml。
4.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于步驟(I)生物醫用材料在多巴胺溶液中浸泡反應12 — 24小時，反應溫度為25— 50°C。
5.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于步驟(I)生物醫用材料在蒸餾水中漂洗10 — 30分鐘。
6.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于功能分子的濃度為I一2mg/mL·
7.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于步驟(2)固定有多巴胺的生物醫用材料在功能分子中浸泡反應12 — 24小時，反應溫度為25—30°C。
8.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于步驟(2)固定有功能分子的生物醫用材料在蒸餾水中漂洗10 — 30分鐘。
9.根據權利要求I所述的以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于所說的功能分子是肝素、透明質酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、氨基酸或硫醇。
10.根據權利要求書I所述的一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法，其特征在于所說的蒸餾水是雙蒸水，三蒸水或Milli-Q水。
全文摘要
本發明公開了一種以多巴胺為橋連的生物醫用材料表面固定功能分子的方法。該方法以多巴胺為橋連介質，首先利用其在一定pH環境下較強的自聚合特性組裝到生物醫用材料表面形成聚多巴胺層，然后利用化學反應將功能分子接枝到聚多巴胺層上，構建具有生物活性的生物醫用材料表面。該方法不破壞功能分子的生物活性，而且可以通過調控反應時間改變聚多巴胺層的組裝厚度，從而改變表面功能分子的接枝率。該方法工藝簡單可行，重復性好，可以廣泛地應用于介入材料、組織工程材料等生物醫用材料的表面功能化改性，具有較好的臨床應用前景。
文檔編號A61L27/28GK102813963SQ20121033166
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者高長有, 馬列, 劉云云 申請人:高長有