專利名稱：一種提高機體免疫功能的細胞類生物藥物、及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種新型生物藥物、及其制備方法和應用，尤其涉及ー種具有提高機體免疫功能、可以應用于治療和預防惡性腫瘤以及病毒感染(如艾滋病和肝炎)的細胞類生物藥物的制備方法。
背景技術：
免疫系統是機體保護自身的防御性體系，能夠準確的識別自己和非己物質，以維持機體的相對穩定，同時還能接受、傳遞、擴大、儲存和記憶有關免疫的信息，針對不同的免疫信息發生增強和減弱的應答并不斷調整其反應性。免疫系統的基本功能為免疫防御、免疫穩定和免疫監視。
免疫系統由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成。免疫應答可分為T細胞介導的細胞免疫應答和B細胞介導的體液免疫應答。過去30年來，嚴格的實驗研究已明確表明，免疫系統在抗御腫瘤和病毒感染中具有重要作用。而且在嚴格控制的動物模型中也獲得了ー些最新成果，從而使免疫監視理論重新引起了重視。正如Burnet所述，胸腺依賴性淋巴細胞，即T淋巴細胞，是免疫監視中最重要的效應細胞。T細胞介導的細胞免疫應答多數情況下對機體是有利的，但在某些情況下也可導致機體損傷。有利的保護作用包括1)對胞內感染的病原體的抗感染作用，主要是針對胞內感染的病原體，包括①抗細菌感染，如結核桿菌、麻風桿菌、沙門菌感染等；②抗病毒感染，主要指在活細胞內寄生的病毒如艾滋病病毒抗真菌感染，如白色念珠菌、新型隱球菌、球范子菌及組織胞漿菌等；④抗寄生蟲感染，如原蟲感染等2)抗腫瘤，參與抗腫瘤的細胞免疫效應包括①Tc細胞的特異性殺傷作用；②巨噬細胞、NK細胞通過ADCC的殺瘤效應；③各種淋巴細胞和其他免疫細胞所產生的細胞因子(如淋巴毒素和TNF-α等)可直接或間接發揮殺瘤效應等。T細胞介導的免疫效應還可能參與下列免疫損傷病理過程的發生發展1)遲發型超敏反應；2)急性移植物排斥反應；3)移植物抗宿主反應；4)某些自身免疫病等等。細胞毒T淋巴細胞(CTL)是ー類可殺傷表達特異性抗原靶細胞的T細胞(⑶8+T)亞群。細胞毒T淋巴細胞是抗細胞內感染、急性同種異型移植物排斥反應和殺傷腫瘤的主要效應細胞。研究人員發現，機體內抵御病毒和腫瘤的T細胞有“立刻保護”和“長期保護”的分エー類帶有“戰士”分子標記，能直接殺滅腫瘤細胞或病毒；另一類則顯示“記憶細胞”的特征，能潛伏多年以防未來的腫瘤復發或病毒再次入侵。機體免疫力低下的人，在同樣導致疾病發生的環境中患病幾率大大高于正常人。免疫系統一旦出現障礙，癌癥、以及HIV和肝炎等病毒感染性疾病就容易出現。例如，當免疫系統有缺失時這種可以引起癌細胞凋亡的抗癌免疫監視功能就會失效。而且，腫瘤形成后,也會反過來抑制機體的免疫系統功能。研究發現,腫瘤患者的免疫功能會隨著腫瘤的不斷生長而呈進行性下降，這就構成了腫瘤發展過程中惡性因果轉化鏈上的重要ー環。
我國和許多發達國家花費巨額資金和大量人力進行研究攻克癌癥，但至今尚未取得根本性的進展，總體療效很不理想，許多癌癥患者的長期生存率仍然很低。據美國癌癥學會(American Cancer Society)分析,2007年全世界約有腫瘤患者1200萬，其中760萬人死亡，每天達2萬人。過去的三十年中，我國的癌癥發病率増加了 80%。毎年有260萬人被診斷為癌癥，同時有180萬病人死于惡性腫瘤。近幾年來，惡行腫瘤發病率在中國呈明顯上升和年輕化的趨勢，嚴重威脅人民的生命和健康。研究人員預測，癌癥的發生在未來15年有可能上升一倍。到2030年癌癥的發病率上升75%，而在發展中國家，這個數字將接近90%。因此，臨床上迫切需要有ー種療效確切，對防止腫瘤復發和轉移有很好的作用，不容易產生耐藥性，安全可靠，毒副作用輕微，同時能提高腫瘤患者自身的抗腫瘤的免疫功能的新型治療方法。針對迅速上升的腫瘤發病率，理想的方法還應該能夠預防腫瘤的發生。免疫活性細胞回輸療法是消滅體內微小殘留病灶的最佳方法，甚至可以使晚期腫瘤得到完全緩解，因而在抗腫瘤免疫治療領域倍受重視。已知研究 較多的免疫活性細胞有淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、CD3單克隆抗體激活的殺傷細胞(CD3-AK)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、樹突狀細胞(DC)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、B淋巴細胞等，它們分別在抗腫瘤免疫治療中扮演著不同的角色。腫瘤生物治療本質上屬于ー種生理性治療措施，這些以細胞和免疫為基礎的治療方法是通過和化療或放療治療不同的作用機理，代表了ー個非交叉性的耐藥性，而且其毒性也與化療和放療完全不同。其抗腫瘤的特異性和免疫記憶是其它方法所不能比擬的。由于生物治療具有安全性好、毒副作用低、可反復多次使用，是ー種治療惡性腫瘤的人性化的治療方法，對不能耐受化療和放療的晚期腫瘤患者也可適用。在防止腫瘤的復發和轉移方面，生物治療的地位更為重要。生物治療作為繼手術、放療和化療后治療腫瘤的第四模式，是目前腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有前途的手段，生物治療有望達到完全消滅根治癌細胞的目的，是今后癌癥治療發展的ー個主要方向。而通過以細胞毒T淋巴細胞(CTL，⑶8+細胞)為基礎的抗腫瘤免疫治療還可以用于研究開發獲得周圍或中央型記憶細胞的腫瘤預防性疫苗。此タ卜，艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired ImmunodeficiencySyndrome, AIDS),其病原為人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV),亦稱艾滋病病毒，自發現至今在全球肆虐，截止2003年底,估計已造成6900萬人感染,其中2700萬人已死亡。艾滋病在1985年傳入我國，截止2003年底，專家估計我國現存活的HIV感染者約84萬，其中AIDS病人8萬。疫情已覆蓋全國所有省、自治區、直轄市，流行范圍廣，面臨艾滋病發病和死亡高峰期，我國的艾滋病已由吸毒、暗娼等高危人群開始向一般人群擴散。目前，艾滋病不僅已成為嚴重威脅我國人民健康的公共衛生問題，且已影響到經濟發展和社會穩定。HIV在全球范圍內流行一直是對人類健康的ー個重大威脅，迫切需要采取有效的預防和控制措施。抗病毒治療是治療艾滋病的有效手段，人們針對艾滋病尋找HIV特異性酶和其他特異性功能的抑制劑，現有藥物在艾滋病治療過程中能有效抑制病毒復制，特別是高效聯合抗逆轉錄病毒治療(highly active anti retroviral therapy,HAART)能將病毒的復制抑制到現有方法檢測不到的水平，并促進免疫重建。但近年隨著HAART的廣泛應用，HAART的副作用和耐藥性問題也日益突出，如代謝紊亂便是長期治療副作用中最突出且最復雜的問題，交叉耐藥性也成為導致臨床治療失敗的ー項主要原因。人類在對HIV疾病的預防方面的研究進展相對緩慢。雖然目前防治艾滋病有許多措施，但艾滋病的發病以免疫功能的受損為主，最終控制HIV流行需要依靠有效的HIV疫苗，艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。對HIV致病機理的研究證實有時人體能夠取得對HIV的自然免疫 ，發展安全有效的艾滋病疫苗在理論上是可行的。可以最大限度地抑制病毒的復制，保存和恢復免疫功能，降低病死率和HIV相關性疾病的發病率，提高患者的生活質量，減少艾滋病的傳播。CTL細胞是特異性細胞免疫的效應細胞，可以通過分泌各種細胞因子或直接殺死被病毒感染的靶細胞。特異性T8細胞毒T淋巴細胞是機體抗HIV最主要的免疫細胞，也是目前HIV疫苗研究的重點之一。CD8+T細胞治療惡性腫瘤的的優點是能特異性的識別腫瘤細胞、與腫瘤細胞可發生緊密的接觸和黏附從而產生相應的生物學效應、通過多種途徑殺滅腫瘤細胞、對白細胞介素-2的依賴低、長效的記憶細胞有利于發揮抗腫瘤復發和轉移的作用。但CTL治療的療效尚不理想，這與我們對T細胞的特性了解不夠，以及細胞擴增的條件未能達到最佳化有夫。例如⑶8T細胞的前體細胞(precursors)較少。⑶8T細胞的擴增速度不夠快。對刺激CD8T細胞生長的細胞因子了解不夠。隨著培養擴增時間延長，效應細胞抗腫瘤的活性降低等。另外，淋巴細胞進入宿主，既可以作為抗原刺激宿主細胞的免疫系統，使宿主發生宿主抗移植物反應，同時又可以識別宿主的抗原，產生抗宿主反應，嚴重者可導致移植物抗宿主病(GvHD)。如DLI并發癥主要有GvHD，大約50 60%的使用DLI治療的病人發生GvHD。據EBMT的記錄，急性GvHD的發生率為I級的占18%，II級占24%，III-IV級占13%。因此目前CTL治療采用自體細胞，通過體外培養、活化擴增抗病原體的特異性T淋巴細胞，再回輸體內殺傷病原體。苛刻的培養和分離條件，使得該方法無法作為藥物大規模生產，其臨床使用受到很大限制。

發明內容
針對現有技術中CD8T細胞的前體細胞(precursors)較少、CD8T細胞的擴增速度不夠快、對刺激CD8T細胞生長的細胞因子了解不夠、隨著培養擴增時間延長，效應細胞抗腫瘤的活性降低、以及異體淋巴細胞引起免疫排斥反應，無法作為藥物大規模生產等問題，本發明提供了一種制備提高機體免疫功能的藥物的方法，克服了上述各種問題。本發明的第一個目的是提供一種制備提高機體免疫功能的細胞類生物藥物的方法，步驟包括步驟1，將免疫細胞與特定抗原在液態細胞培養基中置于培養容器中共同培養，從而獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物；步驟2，從步驟I中獲得的培養物中分離具有免疫應答反應的細胞類生物藥物。其中，所述培養液為基礎培養液加血清或無血清培養液。其中，所述的液態細胞培養基中，除免疫細胞外，還包括組分a) e):a)細胞有絲分裂原如刀豆素、植物血凝素、美洲商陸、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗體中的任意ー種或幾種；
b)抗原(即特定抗原)如源于同種異體、和/或異種、和/或自身的胸腺依賴型抗原和/或胸腺非依賴型抗原，如腫瘤、病毒中的任意ー種或幾種。c)超抗原如外源性超抗原細菌內毒素等，內源性超抗原如逆轉錄病毒、熱休克蛋白中的任意ー種或幾種；可以是外源性超抗原和內源性超抗原中的任意ー種或兩種的組合；d)細胞因子如來源于淋巴細胞、單核細胞和其他細胞產生的淋巴因子、單核因子、激活炎癥的細胞因子和刺激造血的細胞因子中的任意ー種或幾種；e)免疫佐劑如無機、有機、合成和油劑中的任意ー種或幾種。本發明所述的方法中，所述免疫細胞可以是異體細胞或自體細胞，本發明中優選為異體細胞。本發明所述的方法中，所述免疫細胞可以是野生型免疫細胞，也可以是基因改性 細胞，并優選為不經基因改性的細胞。本發明所述的方法中，所述具有免疫應答反應的細胞，細胞毒T淋巴細胞、細胞因子激活的殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞、自然殺傷細胞、腫瘤相關巨噬細胞、和/或樹突狀細胞。并優選為淋巴細胞，如T細胞、B細胞、NK細胞等，最優選為T細胞。其中，所述免疫細胞與特定抗原的比例優選為5 100 :1。其中，所述免疫細胞與特定抗原共同培養時間優選為3 180天。其中，所述細胞培養容器優選為三維大體積高密度細胞培養容器，但也可以是其它任意已知的培養容器，包括生物反應器。根據本發明所述方法的ー種優選實施方式，其中，步驟I中還可以加入抗原遞呈細胞。根據本發明所述方法的ー種優選實施方式，其中，還包括細胞克隆步驟以步驟I中得到的培養物，或者步驟2中得到的具有免疫應答反應的細胞為原料，在所述培養基中進行克隆，得到具有免疫應答反應的細胞株。所述克隆可以是1)間歇循環刺激法；2)連續刺激法。本發明的第二個目的是提供ー種具有能夠提高機體免疫功能、臨床上可作為用于預防和治療多種疾病的細胞類生物藥物，所述藥物由上述第一個目的中所述方法制備。本發明第三個目的是提供ー種生物制劑，包括容器，以及置于所述容器中的、本發明第ニ個目中的所述的藥物。其中，所述生物制劑還包括生理鹽水、白蛋白、以及其他穩定劑。本發明的第四個目的是提供本發明第二個目中的細胞類生物藥物在治療和預本發明的第四個目的是提供本發明第二個目中的細胞類生物藥物在治療和預防淋巴細胞的功能和數量異常有關的疾病的藥物中應用，包括如下領域的應用腫瘤免疫、移植免疫、超敏免疫、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、免疫缺陷病、感染與免疫、衰老與免疫、生殖與免疫、生殖系統與免疫、免疫血液病、呼吸系統疾病與免疫、腎臟病與免疫、消化系統疾病與免疫、內分泌疾病與免疫、心血管系統疾病與免疫、結締組織病、免疫皮膚病學、創傷與免疫、寄生蟲病與免疫。例如治療和預防腫瘤、艾滋病和病毒性肝炎等疾病，或用于延緩衰老
坐寸ο
本發明上述內容中，所述藥物可以是用于提高機體免疫功能的疫苗，或者是通過提高機體免疫功能而治療疾病的藥物。本發明所述的疫苗或藥物，可以制成任意可用的劑型、和/或通過任意可用途徑輸入患者或需求者體內。本發明所述方法制備的含T淋巴細胞的藥物中，T淋巴細胞可以是來自異體的細胞，使用時不會出現異體排異反應，安全性高；并且通過實驗驗證，所制備的藥物具有明顯的提高機體免疫功能的作用。本發明制備藥物的方法，改變了傳統疫苗的作用方式，傳統疫苗是由病原生物或其抗原性物質制成,輸入到人體后,免疫系統產生保護物質(如抗體),免疫系統依循原有記憶制造更多保護物質來阻止病原菌傷害，本發明將包括具有免疫應答反應的細胞的疫苗輸送的到機體內，直接提高基體免疫功能，不僅增加了機體抗腫瘤、HIV和肝炎病毒等病原菌感染的能力，可用于治療和預防癌癥、艾滋病和病毒性肝炎，同時對于延緩衰老也有良好的 效果。


圖I :流式細胞術分析免疫細胞亞群顯示⑶8+T淋巴細胞可達95%以上；圖2 :流式細胞術進ー步分析顯示主要為⑶45R0陽性細胞圖3 :流式細胞術分析顯示⑶45R0陽性細胞中有68%同時表達⑶62 ；圖4 :流式細胞術分析顯示⑶56陽性細胞僅占O. 8% ;圖5 CTL體外殺瘤實驗中，流式細胞術檢測死亡腫瘤細胞數；圖6 =CTL體外殺瘤實驗中，流式細胞術檢測效應細胞存活率；圖7為效果實施例3中裸鼠肺部轉移病灶的變化；圖8為效果實施例5中，采用本發明所制備的藥物治療前后腫瘤細胞形態；圖9為效果實施例6中，采用本發明所制備的藥物治療前后，胸部X照片；圖10為效果實施例7治療前后黑色素瘤變化；圖11為效果實施例7中，采用本發明所制備的藥物治療前后，血液中單核細胞和嗜酸細胞變化；圖12為效果實施例8治療前后胸部CT照片；圖13為效果實施例10治療兩個月后出現黑頭發生長照片；圖14為本發明所示藥物制備方法流程圖。
具體實施例方式本發明提供了一種制備提供免疫功能的藥物的方法，參照圖14，步驟包括步驟1，將免疫細胞與特定抗原在液態細胞培養基中置于培養容器共同培養，從而獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物；步驟2，從步驟I中獲得的培養物中分離具有免疫應答反應的細胞類生物藥物。其中，所述的液態細胞培養基包括組分a) e):a)細胞有絲分裂原如刀豆素、植物血凝素、美洲商陸、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗體中的任意ー種或幾種；
b)抗原可以是源于同種異體、異種、自身的胸腺依賴型抗原、胸腺非依賴型抗原，如腫瘤、病毒中的任意ー種或幾種；c)超抗原可以是自外源性超抗原細菌內毒素；內源性超抗原如逆轉錄病毒、熱休克蛋白中的任意ー種或幾種。；d)細胞因子如來源于淋巴細胞、單核細胞和其他細胞產生的淋巴因子、單核因子、激活炎癥的細胞因子和刺激造血的細胞因子中的任意ー種或幾種；e)免疫佐劑如無機、有機、合成和油劑中的任意ー種或幾種。實施例I源于異體的單個核細胞，與特定抗原在液態培養基中共同培養，所述培養基包括刀豆素、肝癌細胞(抗原)、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐劑，其中，刀豆素在培養基中用量為I μ g/L ;外源性超抗原(綠膿桿菌毒素)在培養基中用量為5 μ g/L ;淋巴因子(白細胞介素II)在培養基中用量為1000u/L ;免疫佐劑(5%吐溫-80)用量為O. lmL/L。單個核細胞與特定抗原(肝癌細胞)的比例為5 :1 (細胞數比)。將單個核細胞與特定抗原共同培養30天，獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物。從培養物中分離出具有免疫應答反應的細胞，主要為細胞毒T淋巴細胞。實施例2源于異體的單個核細胞，與特定抗原在液態培養基中共同培養，所述培養基包括植物血凝素、同種異體肺癌細胞(抗原)、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐劑，其中，植物血凝素(PHA)在培養基中用量為5 μ g/L ;外源性超抗原(綠膿桿菌毒素)在培養基中用量為I μ g/L ;淋巴因子(干擾素)在培養基中用量為1000u/L ;免疫佐劑(5%吐溫-80)用量為0. lmL/L。同時加入抗原遞呈細胞自體樹突狀細胞。
單個核細胞與特定抗原(異體肺癌細胞)比例為100 1 (細胞數比例)。單個核細胞與抗原遞呈細胞(自體樹突狀細胞)比例為50 1 (細胞數比例)。將單個核細胞與特定抗原共同培養90天，獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物。從培養物中分離出具有免疫應答反應的細胞，主要為細胞毒T淋巴細胞。實施例3源于異體的單個核細胞(基因改性T淋巴細胞)，與特定抗原在液態培養基中共同培養，所述培養基包括植物血凝素、HIV病毒(抗原)、外源性超抗原、細胞因子、免疫佐劑。其中，植物血凝素在培養基中用量為lOyg/L ;HIV病毒在培養基中用量為IO2拷貝/L ;外源性超抗原(綠膿桿菌毒素)在培養基中用量為5 μ g/L ;淋巴因子(GM-CSF)在培養基中用量為500u/L ;免疫佐劑(5%吐溫-80)用量為0. lmL/L。單個核細胞與特定抗原HIV病毒的比例為100 1 (細胞數量病毒拷貝數)。將單個核細胞與特定抗原共同培養10天，獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物。從培養物中分離出具有免疫應答反應的細胞，主要為細胞毒T淋巴細胞。實施例4源于異體的單個核細胞，與特定抗原在液態培養基中共同培養，所述培養基包括刀豆素、同種異體的原發性和繼發性胰腺癌細胞(抗原)、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐齊U，其中，刀豆素在培養基中用量為10 μ g/L;外源性超抗原(綠膿桿菌毒素)在培養基中用量為I μ g/L ;淋巴因子(白細胞介素II)在培養基中用量為800U/L ;免疫佐劑(5%吐溫-80)用量為O. lmL/L。單個核細胞與同種異體的原發性和繼發性胰腺癌細胞的比例為20 1 1 (細胞數比)。將單個核細胞與抗原在37°C、5% CO2條件下培養7天。重懸，經離心收集界面細胞，調整細胞濃度，加入經過照射的自身MNC，以未照射的自身細胞為飼養細胞和抗原提呈細胞，培養7天，重復該步驟。收集細胞，有限稀釋后，在上述條件下繼續培養，傳代并經間歇刺激培養。從上述培養物中分離出具有免疫應答反應的細胞株。
實施例5源于異體的單個核細胞，與特定抗原在液態培養基中共同培養，所述培養基為無血清培養基，加入包括植物血凝素、通用型腫瘤相關抗原、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐齊U，其中，植物血凝素(PHA)在培養基中用量為10μ g/L ;外源性超抗原(綠膿桿菌毒素)在培養基中用量為I μ g/L ;淋巴因子(白細胞介素II)在培養基中用量為800U/L ;免疫佐劑(5%吐溫-80)用量為O. lmL/L。單個核細胞與通用型腫瘤相關抗原的比例為10 :1 (重量比)。將抗原與T淋巴細胞(單個核細胞)在37°C、5% CO2條件下培養7天。將所培養細胞加入大體積細胞培養生物反應器，進行高密度細胞培養30天。從上述培養物中分離出具有免疫應答反應的細胞，主要為細胞毒T淋巴細胞。效果實施例I以T淋巴細胞為例，采用上述方法，本發明可獲得大量活化擴增的免疫細胞，流式細胞術分析各免疫細胞亞群顯示(圖I):⑶8+T淋巴細胞增多，可達95%以上，進ー步分析其中主要是⑶45R0陽性細胞，約為93% (圖2)，⑶45R0陽性細胞中有68%同時表達⑶62(圖3)，強烈提示所獲得的免疫效應細胞屬于細胞毒T淋巴細胞(CTL)，具有特異性的殺傷腫瘤細胞的作用。在血液惡性腫瘤如淋巴細胞性白血病或淋巴瘤細胞與外周血單個核細胞共同培養的實驗中，流式細胞術分析同樣觀察到CD8+T淋巴細胞增多，CD4+T淋巴細胞(HIV病毒的靶細胞)減少，⑶56陽性細胞僅占O. 8% (圖4)，未檢測到⑶19+B淋巴細胞。上述結果表明，本發明上述實施例制備的免疫效應細胞具有強大的殺滅腫瘤細胞的效應，為腫瘤生物學治療提供了一種全新的治療措施，在體液免疫系統的配合下有望進一歩提供生物學效應，包括對腫瘤細胞増殖周期靜止期、有耐藥性的細胞，甚至包括對腫瘤干細胞的生物學效應。效果實施例2將按照上述實施例制備的細胞毒T細胞(CTL)，進行殺瘤活性實驗，采用流式細胞儀分析所獲得的免疫細胞的殺瘤活性顯示當效應細胞(K562激活的免疫細胞)與靶細胞(K562細胞)的比例為10 :1，作用時間4小時時靶細胞殺滅率80%左右(圖5)，而效應細胞(CTL)存活率仍達到90%以上(圖6)。
對靶細胞攻擊后大部分的CTL仍存活，可繼續攻擊其它靶細胞。ー個CTL在幾小時內可以殺傷數十個靶細胞，故CTL這種連續、高效的殺傷功能，在機體的細胞免疫中有重要作用，尤其在抗腫瘤與抗細胞內感染的微生物中有更重要的意義。效果實施例3用帶有紅色熒光蛋白基因轉染的肝癌細胞株在裸鼠體內建立肺癌轉移模型，然后分別用同樣細胞株激活的CTL (IxlO6)和生理鹽水腹腔內注射，每周一次共三次。觀察肺部轉移病灶的變化情況，結果顯示(圖7)，與對照組(圖7A)相比，CTL治療后(圖7B)肺部轉移病灶明顯減少。我們對近500例肺癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、胃癌、淋巴瘤、惡性黑色素瘤等晩期腫瘤患者進行了治療和預防嘗試。初步結果表明我們研制的免疫效應細胞的臨床應用安全、有效。接受免疫效應細胞治療的病人通常僅有輕到中等度的發熱，未見有其他明 顯的毒副反應。同吋，免疫效應細胞治療后多數患者的臨床癥狀有明顯改善，有時伴隨著腫瘤的縮小和腫瘤標志物的明顯下降或恢復正常，以及生存期的延長。另外，我們還觀察到這一治療方法還可強烈地激活晚期腫瘤患者的細胞和體液免疫功能，表現為外周血中的單核細胞和嗜酸性細胞計數的顯著增多以及免疫球蛋白IgG和IgA的明顯升高。此外，治療后患者腫瘤組織或胸腹水中可見大量激活的淋巴細胞的浸潤。效果實施例4 :臨床治療惡性血液病姓名林XX 性別男性年齡18歲臨床診斷MDS因皮膚蒼白，乏カ頭暈，勞累后心悸氣短半年于2010-12-30入院。檢查發現三系減少，白細胞2. 34X 109/!、紅細胞2. 14X109/L、血色素81g/L、血小板86X 109/L。胸骨穿刺顯示三系增生伴輕度病態造血骨髄象。病情進展較快，第一次診斷后的五個月即需輸血，其后靠輸血維持，五個多月期間共輸血4300mL。治療兩個多月后，輸血次數及數量減少，其中血色素逐步從最低水平4. 8g/L上升到16. 2g/L，增長了 11. 4g/L，四個月后(2012-04-21到2012-08-26)不用再輸血維持。治療近一年時，血常規白細胞4. 18-7. 46X 109/L、紅細胞2. 61-4. 45X 109/!、血紅蛋白99_162g/L、血小板，47-69X 109/し伴隨臨床癥狀體征的明顯改善，體力恢復正常。治療后的骨髄穿刺、骨髓活檢和骨髓干細胞培養均有造血功能明顯改善。治療過程中病人耐受良好。效果實施例5 :聯合手術治療和預防復發姓名曾XX 性別女年齡65歲臨床診斷肺癌2008年6月因體檢發現雙側肺陰影，同年7月22日于上海市胸科醫院行微創右側上葉肺腫瘤切除術，病理為肺乳頭狀腺癌侵及臟層胸膜。如圖8A所示，治療前腫瘤細胞多層排列(照片1)，腫瘤細胞異性明顯，細胞核大，染色質粗，核仁明顯(照片2、3)術后于2008年8月6日采用本發明所述藥物(CTL)進行生物治療。治療三個月后復查CT顯示病灶穩定，未見有發展。血液檢查腫瘤標志物明顯下降。2008年12月2日患者再去胸科醫院行左上肺肺癌微創手木，病理切片中顯示左肺上葉腺癌，腺泡樣及乳頭狀腺癌混合亞型。侵及臟層胸膜，P-T2N2M IIV期，呈單層排列(圖8B照片1)，細胞形態溫和(圖SB照片2、3)。腫瘤內有大量淋巴細胞浸潤。第二次手術后繼續給予CTL治療，以每周一次至毎月一次，病人一般情況良好，PET-CT及影象學檢查無腫瘤復發轉移。血中腫瘤標記物CA125及NSE轉為正常。至今隨訪已近四年。全血中嗜酸細胞增多，從6. 2%増加至最高10. 5% ;血清球蛋白明顯升高，從33g/L增加至最高39g/L。效果實施例6 :聯合化療治療和預防復發姓名吳XX性別女年齡36歲診斷非何杰金氏淋巴瘤患者于2004年4月反復因低熱、乏力，胸部X檢查發現縱隔陰影。同年5月25日經穿刺病理證實為HDII型。病程中經過化療和放療。因療效不明顯且出現嚴重副反應而停止放化療。2008年3月25日胸部CT發現左上肺結節(圖9A)，考慮淋巴瘤肺內侵潤。左肺結節穿刺病理證實為經典型HD，因組織較少無法分類。于2008年4月再次接受NHL化療，因療效不明顯出現嚴重副反應，停止治療。后于2008年10月6日采用本發明所述藥物進行生物治療。CTL靜脈輸注ニ個月后病人低熱消失，自我感覺良好，體力增強。復查CT發現肺部病灶消失及縱隔淋巴結明顯縮小(圖9B)。五個月后復查CT提示病灶已吸收，此后疾病無進 展達四年。效果實施例7 :聯合局部治療后治療和預防復發姓名李XX性別男年齡74歲診斷惡性黑色素瘤2006年6月份發現右足趾截除術及腹股溝淋巴結清掃。術后半年發現腹股溝淋巴結轉移，予以氮西米胺、順鉬化療。2008年I月因發現右下肢黑色素細胞瘤大量生長，最高位已蔓延至右側腹股溝。入院檢查右下肢大、小腿處多個黑色素瘤，右側腹股溝數枚淋巴結腫大(圖10A)。經CTL生物局部注射和全身靜脈治療，黑色素瘤明顯縮小(圖10B)，未觀察到明顯毒性反應。治療后實驗室檢查，酸性細胞和單核細胞增多(圖11A，B)，血清中球蛋白升高，從23g/L最高達40g/L。此后疾病無進展達五年。效果實施例8 :聯合靶向治療后治療和預防復發姓名施某性別男年齡39歲診斷肺腺癌2008年3月份因發熱咯血就診，查胸片兩肺廣泛彌漫性小結節病灶(圖12A)，考慮結核而行結核治療。但病灶加重，咯血量增多，需用垂體后葉素控制出血。2008年5月來上海胸科醫院診治。發現有右鎖骨上淋巴結腫大，經穿刺病理診斷為肺腺癌。同時痰液中找到脫落腫瘤細胞(肺腺癌)。2008年6月開始生物治療，靜脈滴注CTL，治療以后ニ天咯血即停止。病人感到胸悶咳嗽明顯好轉。2008年11月份復查胸部CT (圖12B)，有進ー步明顯好轉。查血中腫瘤標志物明顯下降治療前CEA 65.86 CA125 86.89 FREE 401. I NSE 55.43治療后CEA 34. 45 CA125 13. 89 FREE 283. 5 NSE 32.9全血中單核細胞由原來的10. 5%升高到13.6%，酸性細胞從2. 3%升高到5. 4%。效果實施例9:董XX，女性年齡75歲診斷1，胰腺癌，2，慢性濕疹因患胰腺癌接受本發明所述藥物進行生物治療，治療后ー個月，病人長達五年之久、經過多種治療無效的慢性濕疹徹底痊愈。
慢性濕疹是由多種內外因素引起的以苔蘚樣變為主，易反復發作的慢性炎癥性皮膚病，其發病機制復雜且尚未完全闡明，傳統觀念認為由IV型變態反應介導，眾多的炎癥細胞和炎癥因子參與其發病。效果實施例10 胡XX,男性年齡88歲診斷結腸癌因患結腸癌接受本發明所述藥物進行生物治療，治療兩個月后出現黑頭發生長(圖 13)。效果實施例11 雷XX，女性年齡85歲診斷食道癌(中段) 因吞咽困難數月，X射線檢查發現食道中段癌。因為年齡較大不適合手術和化療，故行局部放療。共五周25次。放療同時聯合生物治療，應用本發明所述藥物進行生物治療每周一次。治療后癥狀明顯改善，影像學腫瘤明顯縮小。治療前后流式細胞儀外周血免疫細胞檢查結果顯示，總T淋巴細胞和細胞毒T淋巴細胞明顯升高。(見表I)表1，使用本發明上述實施例制備的藥物前后免疫細胞檢驗結果
權利要求
1.一種制備提高機體免疫功能的細胞類生物藥物的方法，其特征在于，步驟包括 步驟1，將免疫細胞與特定抗原在液態細胞培養基中置于培養容器中共同培養，從而獲得具有抗相應 抗原的特異性免疫細胞培養物； 步驟2，從步驟I中獲得的培養物中分離具有免疫應答反應的細胞類生物藥物； 其中，所述的液態細胞培養基中，除免疫細胞外，還包括組分a) ^e) a)細胞有絲分裂原； b)抗原； c)超抗原； d)細胞因子； e)免疫佐劑。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述免疫細胞選自異體細胞或自體細胞的任意一種。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述免疫細胞選自不經基因改性的免疫細胞或基因改性的免疫細胞的任意一種。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述培養液選自基礎培養液加血清或無血清培養液的任意一種。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述細胞培養容器為三維大體積高密度細胞培養容器。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述細胞有絲分裂原選自刀豆素、植物血凝素、美洲商陸、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗體中的任意一種或幾種。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述抗原選自胸腺依賴型和/或胸腺非依賴型，來源于自體、同種異體、和/或異種的腫瘤、病毒中的任意一種或幾種。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述超抗原選自外源性超抗原為細菌內毒素；內源性超抗原為逆轉錄病毒、熱休克蛋白中的任意一種或幾種。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述細胞因子選自來源于淋巴細胞、單核細胞和其他細胞產生的淋巴因子、單核因子、激活炎癥的細胞因子和刺激造血的細胞因子中的任意一種或幾種。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的具有免疫應答反應的細胞選自細胞毒T淋巴細胞、細胞因子激活的殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞、自然殺傷細胞、腫瘤相關巨噬細胞、和/或樹突狀細胞。
11.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I中還加入抗原遞呈細胞。
12.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，還包括細胞克隆步驟以步驟I中得到的培養物，或者步驟2中得到的具有免疫應答反應的細胞為原料，在所述培養基中進行克隆，得到具有免疫應答反應的細胞株。
13.—種具有能夠提高機體免疫功能、臨床上可作為用于預防和治療多種疾病的細胞類生物藥物，其特征在于，包括由權利要求I所述方法制備的提高機體免疫功能細胞類生物藥物。
14.一種如權利要求13所述的細胞類生物藥物在治療和預防淋巴細胞的功能和數量異常有關的疾病的藥物中應用，其特征在于，包括如下領域的應用腫瘤免疫、移植免疫、超敏免疫、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、免疫缺陷病、感染與免疫、衰老與免疫、生殖與免疫、生殖系統與免疫、免疫血液病、呼吸系統疾病與免疫、腎臟病與免疫、消化系統疾病與免疫、內分泌疾病與免疫、心血管系統疾病與免疫、結締組織病、免疫皮膚病學、創傷與免疫、寄生蟲病與免疫。
15.一種生物制劑，其特征在于，包括容器，以及置于容器內的如權利要求13所述的細胞類生物藥物。
全文摘要
本發明提供了一種制備提高機體免疫功能的生物藥物的方法，步驟包括步驟1，將免疫細胞與特定抗原在液態細胞培養基中共同培養，所述培養基中包括細胞有絲分裂原、抗原、超抗原、細胞因子、免疫佐劑等。從而獲得具有抗相應抗原的特異性免疫細胞培養物；步驟2，從步驟1中獲得的培養物中分離具有免疫應答反應的細胞，本發明所制備的生物制劑和藥物，安全性好、活性高，能夠有效地提高機體的免疫功能。可以應用于治療和預防惡性腫瘤以及病毒感染(如艾滋病和肝炎)等免疫功能相關疾病。
文檔編號A61P37/02GK102847144SQ201210352979
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者劉華 申請人:上海星華生物醫藥科技有限公司