專利名稱：：尼氟酸在制備慢性內臟痛的抑制藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于醫學領域，尤其涉及一種尼氟酸在制備慢性內臟痛的抑制性藥物中的應用。
背景技術：
：慢性內臟痛在臨床上極為普遍，而且常伴有情緒反應和防御反應，如果疼痛達到一定程度，還可以引起心率減慢、外周心血管舒張等效應，導致血壓下降，甚至更嚴重后果。世界衛生組織于2000年認為“慢性疼痛是一類疾病”，從而將慢性疼痛歸到了疾病之列。因此，慢性內臟痛不再僅僅是內臟疾病的伴隨癥狀，其本身就是一種疾病。雖然炎癥、腫瘤等是慢性內臟痛常見的致病因素，但臨床上仍有相當比例的慢性內臟痛患者體檢無明顯的器質性變化，如功能性胃腸病(functionalgastrointestinaldiseases,FGIDs)。腸易激綜合征(IrritableBowelSyndrome,IBS)就是其典型代表,也是消化內科病人求治的最常見原因之一。統計資料顯示，IBS占臨床消化門診病例的三分之一，其主要臨床特征是反復發作的慢性腹痛及排便習慣的改變，病程遷延漫長，但缺乏異常體征，且病因不明，給臨床治療帶來很大的麻煩，嚴重影響病人的生活。在美國僅IBS—項醫療費用每年消耗超過80億美元。直到2000年，Al-Chaer等才首次報道了IBS樣慢性內臟痛敏大鼠模型。該模型表現為新生期大鼠遭受疼痛或炎癥刺激，成年后出現慢性內臟痛敏，伴有腹瀉、便秘等癥狀，而且沒有病理形態學改變的證據。這一模型的出現為IBS研究提供了可靠的工具。以往IBS的研究主要集中在消化道運動功能紊亂現象，近年來內臟痛覺高敏感日益受到關注，被認為可能是產生IBS癥狀(腹痛和腸道運動異常等)的主要原因。所謂內臟痛覺高敏感是指引起內臟疼痛的閾值降低，內臟對生理性刺激產生不適感或對傷害性刺激反應強烈的現象。對于內臟痛覺高敏感發生機制目前存在四種假設:①胃腸道傳入神經的敏感化(外周敏感化)脊髓背側角神經元的敏感化(中樞敏感化)改變對脊髓傷害性神經元下行的易化或抑制的影響(可能受心理過程影響)；④由于認知和情感的偏倚(警覺過度)將非傷害性感覺誤認為傷害性感覺，是精神心理障礙的結果。超極化環核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activatedcyclicnucleotidegatedcation,HCN)通道由Noma和Irisawa首次報道。他們發現在兔子竇房結細胞上存在著一個超極化激活的內向電流，并且被Brown等命名為If(為“funny”電流，因為它具有不尋常的激活特性)。后來的研究進一步發現這一電流也存在其他組織中，稱之為Ih(超極化激活電流)，也被稱為I,(為“queer”電流)。而其分子基礎在很長時間內未能得到證明。直到1997年，SantOT0等才從大鼠大腦中克隆出一個候選離子通道，并且證明為腦環核苷酸門控通道(mBCNG)。這一通道具有共同特征，長時程的起搏功能，并且屬于一個4成員家族。此后兩年陸續克隆出多種超極化激活環核苷酸(HCN)通道，其中哺乳動物存在著四種亞型，分別稱之為HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。HCN通道廣泛地分布于全身，在可興奮和不可興奮的組織中都存在。HCN通道主要分布在心臟，包括竇房結和房室結以及心肌里，也分布于整個大腦和神經組織。已經證實，外周敏感化和中樞敏感化等機制參與導致組織損傷和炎癥情況下的內臟痛覺高敏感。脊髓背角傷害性突觸傳遞的增強是中樞敏化的一部分，也是神經病理疼痛行為的另一個重要誘因。傷害性中心末端的興奮性神經遞質如P物質和谷氨酸釋放增加，對神經病理疼痛有很大作用。研究表明，HCN通道在脊髓背角的傷害性中心末端和機械敏感性中心末端有表達。此外，HCN2陽性終端也含有SP和谷氨酸。它們構成興奮性中間神經元與突觸連接。如此分布有助于HCN通道參與突觸前神經遞質釋放的調節以及隨后的脊髓背角的中間神經元興奮性調節。因此我們有理由猜測脊髓HCN可能參與了脊髓背角的中樞敏化。一般而言，在神經系統受傷后，傷害性傳導途徑出現興奮性過度，這會擴大正常性或有害性刺激，誘發慢性、異常性疼痛反應。離子通道是神經興奮性的主要決定因素，而且包含廣泛，包括Na+通道，K+通道和Ca2+通道等非常有趣的離子通道。最近研究表明，HCN通道在神經病理性疼痛起作用，是個有價值的靶點。用各種各樣的動物模型進行的一系列研究陸續展示了Ih對神經病理性疼痛的作用。將ZD7288按一定形式給以神經病理痛模型，腹內注射，或者鞘內注射，或者對損傷的坐骨神經進行外周神經阻滯，或者跖肌內注射入受傷后掌，或者受傷的DRG的局部用藥，結果都觀察到顯著的鎮痛效果而無運動功能能障礙。此夕卜，幾種臨床使用的止痛藥，如洛哌丁胺(loperamide),異丙酹和可待因等起的鎮痛效果，也是通過抑制Ih發揮作用。但是，目前對HCN通道在疼痛中作用的研究主要集中在神經病理痛模型。鑒于內臟痛的病理生理過程有別于軀體痛，因此，本課題組對DRG和脊髓背角的HCN通道是否參與內臟痛敏的形成進行了初步的探討。本實驗室前期研究，采用急性內臟痛模型和IBS模型，通過腹壁撤退反射評分、痛閾測定和腹外斜肌放電測量等三項指標來評估大鼠對結直腸擴張刺激的反應程度，結果顯示無論是急性內臟痛模型，還是IBS模型，ZD7288鞘內給藥均能劑量依賴性降低大鼠腹壁撤退反射評分和腹外斜肌放電幅值，同時升高痛閾。該結果提示，阻斷脊髓水平的HCN通道對急、慢性內臟痛大鼠可能有鎮痛作用；同時HCN通道免疫組織化學研究也顯示，在IBS模型大鼠脊髓的腰骶段、胸腰段和背根神經節等組織中，HCN2的表達顯著強于正常組大鼠。免疫反應性表明，HCN不僅在脊髓中有分布，在大腦組織中也有分布。HCN2在大腦中廣泛分布，而HCNl主要位于皮質，集中分布于新皮質、海馬、上丘和小腦。雙倍免疫熒光法闡釋HCNl和HCN2在海馬和新皮質樹突遠端的錐體細胞中都有表達。眾所皆知，新生大鼠的神經系統特別脆弱，具有可塑性，而我們前期的研究也發現脊髓部位存在著HCN表達的可塑性改變。有鑒于此，我們推測IBS模型大鼠的大腦組織中，可能也存在著HCN表達的可塑性改變。目前HCN通道阻斷劑在臨床已經開始使用，包括心動過緩藥。Procolan(類似于伊伐布雷定(ivabradine)),—種特異性Ih阻斷劑，對HCN通道的四個亞型沒有藥理學選擇性，在歐洲已經用于穩定型心絞痛的對癥治療，但是由于目前缺乏HCN通道亞型特異性阻斷劑，其在臨床治療中出現了一系列的副作用。因此在研究HCN通道在疼痛中時，探知究竟HCN哪一亞型在起作用，或者哪一亞型的作用更大，以及開發出更具有亞型特異性的阻斷齊U，意義非常重大。最新研究發現尼氟酸是HCN2亞型通道的特異性阻斷劑。尼氟酸是一種非甾體抗炎鎮痛藥，以往多用于風濕性疼痛的治療，有研究表明尼氟酸能作用于S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控作用。鑒于本實驗室的前期研究結果，本課題考慮在IBS模型大鼠幼年期腹腔給以尼氟酸，觀察HCN2通道亞型在慢性內臟痛的作用。本研究應用IBS模型，在IBS模型幼鼠早期給予超極化激活環核苷酸門控陽離子通道亞型2(HCN2)的特異性阻斷劑尼氟酸進行干預，通過行為學(腹壁撤退反射評分和痛閾測定)，電生理學(腹外斜肌放電幅值)等方法測定其成年后內臟痛敏感性的變化，并結合免疫組織化學實驗方法闡明HCN2通道在慢性內臟痛中的作用及其機制，以期為內臟痛的藥物治療提供新的作用靶點。
發明內容本發明的目的在于提供一種尼氟酸在制備慢性內臟痛的抑制性藥物中的應用，即尼氟酸作為HCN2亞型通道的特異性阻斷劑的應用，可以作為治療慢性內臟痛的藥物。本發明的目的是這樣實現的，所述的尼氟酸是一種非甾體抗炎鎮痛藥，能作為HCN2亞型通道的特異性阻斷劑。所述的尼氟酸是一種非留體抗炎鎮痛藥，在制備治療慢性內臟痛藥物中的應用。本發明具有如下的優點:所述的尼氟酸是一種非留體抗炎鎮痛藥，以往多用于風濕性疼痛的治療。該研究表明尼氟酸能作用于S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控。本課題的研究也表明，在IBS模型大鼠的生長發育階段給予HCN2通道的特異性阻斷劑尼氟酸，結果發現尼氟酸能減輕IBS模型大鼠成年時的內臟敏化狀態，該結果從另一個角度提示了HCN2可能參與慢性內臟痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特異性阻斷劑)能劑量依賴性抑制IBS大鼠的內臟痛反應，并提高其痛反應閾，提示尼氟酸早期應用可有效阻斷大鼠慢性內臟痛的形成，該通道亞型有望成為慢性內臟痛藥物治療的新靶點。圖1為本發明的實驗一的技術路線圖。圖2為本發明實驗二的技術路線圖。圖3為腹壁撤退反射(AWR)評分圖。圖4為正常和IBS模型大鼠腹壁撤退反射評分圖。圖中的林<0.01，vscontrolrats。圖5為正常和IBS模型大鼠痛閾圖，圖中的**:/*<0.01,vscontrolrats。圖6為正常和IBS模型組大鼠腹外斜肌放電幅值圖；圖中的*，林<0.05,P<0.01,vscontrolrats。圖7為對照大鼠結腸HE染色(X200倍)圖。圖8為IBS模型大鼠結腸HE染色(X200倍)圖。圖9為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達(X400倍)圖，圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖10為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖11為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖12為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖13為HCNl在對照和IBS模型大鼠大腦中縫核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠中縫核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖14為HCN2在對照和IBS模型大鼠大腦中縫核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照大鼠和IBS模型大鼠中縫核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖15為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠大腦室旁核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖16為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠大腦中室旁核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖17為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠大腦海馬的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照和IBS模型大鼠海馬中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖18為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠大腦海馬的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠海馬中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖19為尼氟酸對IBS模型大鼠痛閾的作用圖；圖中的*，**:P<0.05,P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO。圖20為尼氟酸對慢性內臟痛大鼠腹外斜肌放電幅值的抑制作用圖；圖中的**-.P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO:P<0.01，vsIBSmodelratswithNFAlmg;#:P<0.01，vsIBSmodelratswithNFA5mg。圖21為新生期CRD建立大鼠內臟痛覺高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在壓力值為20mmHg下腹外斜肌放電的交互作用圖。圖22為新生期CRD建立大鼠內臟痛覺高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在壓力值為40mmHg下腹外斜肌放電的交互作用圖。圖23為新生期CRD建立大鼠內臟痛覺高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在壓力值為60mmHg下腹外斜肌放電的交互作用圖。圖24為新生期CRD建立大鼠內臟痛覺高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在壓力值為80mmHg下腹外斜肌放電的交互作用圖。具體實施例方式下面結合實例對本發明進行詳細說明:材料與方法1、材料1.1實驗動物及其分組清潔級新生SD大鼠6窩，每窩10只左右，雌雄各半(購自上海斯萊克實驗動物有限公司[實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005]。新生大鼠出生后的當天定為第ld，在生后第8天進行分組。將32只SD新生大鼠隨機分為Al和A2兩組，每組16只。Al組為新生期(生后814d)結直腸給予結直腸擴張刺激，A2組為新生期未進行結直腸擴張刺激(新生乳鼠刺激過程和實驗操作均在光線下進行)；然后再將A組隨機分為AlBl和A1B2兩組，每組8只，同理將B組隨機分為A2B1和A2B2兩組，每組8只。在新生大鼠出生后2123d，連續三天給以AlBl和A2B1組大鼠腹腔注射尼氟酸，同時給以A1B2和A2B2組腹腔注射二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMS0)作溶劑對照。具體分組結果如下:AlBl組:新生期Cl，2123d腹腔注射尼氟酸；A1B2組:新生期Cl，2123d腹腔注射DMSO；A2B1組:新生期未行Cl，2123d腹腔注射尼氟酸；A2B2組:新生期未行Cl，2123d腹腔注射DMS0。隨后各組大鼠繼續鼠乳喂養至24d，第25d斷奶，第30d雌雄分籠飼養。采用混合配方飼料(由福建醫科大學實驗動物中心提供)喂養，自由進食飲水，每日更換飲水、飲料，保持大鼠生活環境通風及清潔衛生；觀察進食、飲水、活動、大小便情況，確保大鼠健康及避開各種傷害性刺激。大鼠正常飼養到第8w，體重達250g左右開始進行各項實驗。藥品和試劑碘酒，75%酒精，8%異戊巴比妥鈉，石蠟油，尼氟酸(sigma公司)，DMS0，生理鹽水，乙醚，4%多聚甲醛，肝素，10%中性福爾馬林，兔抗HCN1、HCN2多克隆抗體(abeam公司)，UltraSensitiveSP試劑盒(兔，MAIXIN-BIO),DAB顯色試劑盒(MAIXIN-B10)。儀器與材料人血管重建氣囊20mmX2.5mm(美國)，PE10(BectonDickinson),RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)，針形電極(成都儀器廠)，魚躍牌臺式血壓計(上海躍進醫療器械廠)，自制乳膠氣囊，自制有機玻璃箱，秒表(JOEREX)，電熱恒溫水浴箱(成都儀器廠)，BP221電子天平(德國Sartorius)，HJ-2雙頭磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)，倒置顯微鏡，Olympus顯微攝影系統(日本)；DHG_9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)JK-5型生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2245型石蠟切片機(德國Leica);數碼醫學圖像分析系統MoticMed6.0(北京麥克奧迪公司)。方法2.1實驗一和實驗二的技術路線圖見圖1和圖2。內臟痛IBS模型的建立2.2.1慢性內臟痛覺敏化IBS模型的建立參照林國威報道的方法建立幼鼠內臟痛高敏感IBS模型。新生鼠在出生后814d，每天下午接受一次結腸刺激(colonirritation,Cl)。Cl采用20mmX2.5mm人血管重建氣囊，將氣囊全部插入幼鼠結直腸中，加壓擴張產生60mmHg壓力(血壓計測定)，壓力維持Imin后排出空氣再抽出氣囊；隨后，常規飼養至8周齡。對照組除了不予Cl外，其他過程相同。所有實驗操作時間限定在Ih內完成。期間幼鼠繼續與母鼠同籠，鼠乳喂養；實驗前稱體重并記錄。大鼠8周后再進行內臟痛敏感性測定。腹腔給藥注射時，右手持注射器，左手的小指和無名指抓住新生鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部，使新生鼠的頭部向下，從新生鼠腹部的右下象限進針，每次注射量0.1ml0在出生后2123d，AlBl與A2B1組大鼠腹腔注射尼氟酸5mg，A1B2與A2B2組大鼠腹腔注射DMSO。內臟高敏感性的評定2.3.1腹壁撤退反射(abdominalwithdrawlreflex,AffR)評分成年大鼠用的結直腸擴張球囊(以下簡稱球囊)由輸液導管插入7號乳膠指套(中指或無名指)制成，長度約45cm，導管與指套連接處用絲線雙重結扎，確保密封不漏氣。球囊在實驗前應充氣過夜，使其具有較好的順應性。CRD時球囊被插入末端結扎線距肛門括約肌大約Icm處，用膠帶輕輕將外端導管固定在大鼠尾巴上，以防球囊在實驗過程中滑出。導管通過三通管一端與血壓計相連，一端連接注射器。大鼠在實驗前18h禁食不禁水，用乙醚或氟烷麻醉后，將未充氣的球囊涂石蠟油后插入結直腸內，并按上述方法固定。將大鼠放置在20cmX6cmX8cm的有機玻璃箱內觀察,約30min大鼠完全適應后開始實驗。結直腸擴張(colorectaldistension，CRD)分別采用20、40、60、80mmHg四個壓力，每次擴張持續20S，刺激間隔4min，取3次評分之均值。為了能客觀比較對照和ClIBS模型大鼠的各項指標，檢測時采用單盲法，即對實驗操作者隱瞞實驗動物的類型。評分標準為:O分，無明顯行為變化；1分，大鼠身體不動或僅有簡單的頭部運動；2分，腹部肌肉開始收縮；3分，下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平；4分，腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起(圖3)。痛閾測定:AWR方法測定痛反應閾:球囊放置等過程同前，通過注射器持續、緩慢加壓，每IOmmHg為一壓力梯度，每個壓力停留3min，間隔lmin，以肉眼觀察出現明顯的下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平(即AWR3分)時的最小壓力值為痛反應閾。擴張壓力范圍在1080mmHg之間；每只大鼠重復三次，取平均值。腹外斜肌放電(ThespikesofEOMA))方法按前述方法置入乳膠氣囊后，用RM6240BD多道生理信號采集處理系統記錄在各CRD壓力下大鼠腹外斜肌的放電活動。在OmmHg壓力下的腹外斜肌放電為基礎放電，為消除基礎放電不同對結果的影響，將每只大鼠在各CRD壓力下腹外斜肌放電幅值減去其基礎放電幅值，其差值代表各個不同CRD壓力下腹外斜肌放電幅值。結直腸局部組織病理變化的觀測旨在判斷慢性內臟高敏IBS模型的結直腸局部組織病理變化特點。大鼠深度麻醉后，用10%多聚甲醛經左心室插管灌注半小時，至四肢發白并強硬后取出乙狀結腸與直腸，投入20%多聚甲醛中后固定46h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。常規石蠟切片(5ym)，60°C烘烤Ih后，二甲苯脫蠟，由高到低梯度酒精至水洗，蘇木素、伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片由福建醫科大學病理科專家診斷，觀察指標為結直腸局部組織有無損傷和炎癥等異常改變。參照以下標準進行分級:0，在固有層內未見中性粒細胞浸潤，無間質水腫；1+，在固有層內有少量的中性粒細胞浸潤，少或無間質水腫；2+，在固有層內可見中等數量的中性粒細胞浸潤，間質水腫明顯；3+，大量的中性粒細胞彌散浸潤，間質水腫嚴重。免疫組織化學法脊髓，大腦(中縫核、室旁核、海馬)取材、固定大鼠乙醚麻醉后，經左心室灌注固定，經升主動脈快速灌注4°C生理鹽水250ml，繼之灌注4°C4%多聚甲醛(用PBS配制，pH=7.4)500ml，持續lh。然后打開椎板，暴露脊髓，找到并取出脊髓(胸腰段和腰骶段)和大腦(中縫核、室旁核、海馬)。10%中性福爾馬林浸泡固定過夜，石蠟包埋后，連續冠狀切片，片厚4um，收集切片于0.01mmol/L的PBS中，置于多聚賴氨酸處理的載玻片上，進行免疫組化實驗檢測HCN1、HCN2的表達。檢測HCNl、HCN2表達的免疫組織化學方法步驟①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3分鐘。②檸檬酸高壓修復(L5分鐘)。③室溫冷卻后自來水沖洗，再用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3分鐘。④每張切片加I滴3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。⑤除去PBS液，每張切片加I滴正常非免疫山羊血清，室溫下孵育10分鐘。⑥直接甩去血清，每張切片加I滴多克隆一抗(1:900)，4°C下孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3分鐘。⑦除去PBS液，每張切片加I滴生物素標記二抗工作液,室溫下孵育60min。PBS沖洗3次，每次3分鐘。⑧除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-5分鐘。⑨自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。統計學處理:實驗結果采用>±s表示。在OmmHg壓力下的腹外斜肌放電為基礎放電,為消除基礎放電不同對結果的影響，將每只幼鼠在20、40、60、80mmHgCRD壓力下腹外斜肌放電幅值減去其基礎放電幅值，其差值代表各個不同CRD壓力下腹外斜肌放電幅值。AffR評分及腹外斜肌放電數據采用重復測量方差分析，痛閾采用單因素方差分析。選取尼氟酸給藥劑量5mg組，用2X2析因分析統計方法進行統計分析。統計分析采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析，以/7<0.05差異具有統計學意義。圖像處理采用MoticMed6.0數碼彩色醫學圖像分析系統，測定上述免疫組化染色的脊髓與大腦切片。每張切片隨機選取3個高倍鏡視野(400倍)，經彩色圖像分析儀，讀取并輸入計算機，由系統進行分析，測得每個視野中的平均累積光密度，3個視野測得的平均值即為該例的平均累積光密度。平均累積光密度越大，反映組織染色越強。平均累積光密度值用采用單因素方差分析，統計分析采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析，以P<0.05差異具有統計學意義。結果I慢性內臟痛大鼠IBS模型的評價1.1腹壁撤退反射在2060mmHg結直腸擴張壓力下，IBS模型大鼠AWR評分顯著高于對照大鼠，而在SOmmHg結直腸擴張壓力下兩組大鼠評分差異無統計學意義(見圖4)。腹壁撤退反射測定大鼠的痛閾與正常大鼠相比，IBS模型大鼠的痛閾顯著降低0°<0.01)(見圖5)。腹外斜肌放電在20SOmmHg各個結直腸擴張壓力下，IBS模型大鼠腹外斜肌放電均明顯高于對照大鼠(見圖6)。結腸組織病理改變觀察比較對照和IBS模型大鼠遠端降結腸局部組織學的病理改變，肉眼均未見明顯的腸腔擴張以及與周圍組織粘連等病理改變。降結腸HE染色光鏡下均未見明顯組織損傷，無中性粒細胞浸潤，間質無明顯水腫(見圖7，8)。通道與慢性內臟高敏關系的形態學研究2.1HCNUHCN2在大鼠胸腰段脊髓的表達觀察比較HCN1、HCN2在正常與IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達，結果顯示，HCNl和HCN2均主要在神經元細胞和神經膠質細胞的細胞膜和細胞漿上表達(見圖9，10)。圖像分析結果表明，IBS模型大鼠胸腰段脊髓HCNl和HCN2平均積分光密度值(integrateopticaldensity,10D)均顯著高于正常大鼠,差異有統計學意義(見表I,表2)。表IHCNl在大鼠胸腰段脊髓的,達_權利要求1.尼氟酸在制備HCN2亞型通道的特異性阻斷劑中的應用。2.尼氟酸在制備治療慢性內臟痛的藥物中的應用。全文摘要本發明公開一種尼氟酸在制備慢性內臟痛的抑制藥物中的應用，尼氟酸在制備HCN2亞型通道的特異性阻斷劑中的應用，以及尼氟酸在制備治療慢性內臟痛藥物中的應用。該研究表明尼氟酸能作用于S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控。本課題的研究也表明，在IBS模型大鼠的生長發育階段給予HCN2通道的特異性阻斷劑尼氟酸，結果發現尼氟酸能減輕IBS模型大鼠成年時的內臟敏化狀態，該結果從另一個角度提示了HCN2可能參與慢性內臟痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特異性阻斷劑)能劑量依賴性抑制IBS大鼠的內臟痛反應，并提高其痛反應閾，提示尼氟酸有望成為治療慢性內臟痛藥物。文檔編號A61K31/455GK103070866SQ20121048907公開日2013年5月1日申請日期2012年11月27日優先權日2012年11月27日發明者林春,盧大力,唐影,陳瑜申請人:福建醫科大學