專利名稱：一種葉酸受體靶向腫瘤的ct成像分子探針的制備方法
技術領域：
本發明屬于CT分子成像技術領域，涉及一種葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針的制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是一種常見的嚴重危害人類健康的疾病，目前已成為人類死亡的主要原因之一。近年來，隨著經濟和科技的發展，人們的生存環境和生活習慣日益改變，腫瘤已經成為世界范圍內危害人類健康的難題并且其發病率呈上升趨勢。與發達國家相比，我國的惡性腫瘤死亡率要高于世界平均水平。診斷的早晚決定了病人治愈的幾率，據大量臨床數據統計，早期發現的惡性腫瘤的五年生存率可達90%以上，而晚期發現的只有20%左右。大部分惡性腫瘤在早期沒有任何癥狀，等出現了典型癥狀與體征時，往往已屬中晚期而貽誤·了治療的時機。因此如果能夠實現惡性腫瘤的早期診斷，精確了解惡性腫瘤的位置、大小和有無轉移對于腫瘤的準確分期和治療是十分必要的，將在很大程度上提高腫瘤的治愈率。因此，腫瘤的早期檢測和治療已成為各國科學家關注的熱點。要實現腫瘤的早期診斷和治療，首先要尋找活細胞內的腫瘤標志物，通過對腫瘤標記物進行標記，再進行成像獲得相關信息。由于葉酸受體(FolicAcid Receptor FR)在多數腫瘤細胞膜表面，比如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、肺癌和鼻咽癌等，過度表達，通常比正常細胞高出20-200倍。而且，由于葉酸靶向的腫瘤診斷和治療有對腫瘤細胞親和力高，在體內循環時間長(5-20h)，在正常組織中可以很快被清除等優點，葉酸受體通常被作為葉酸藥物復合物的靶目標實現對過表達FR的腫瘤的顯像和治療。近年來，隨著納米技術的飛速發展，納米材料在生物醫學工程領域的應用研究已成為一個很有生命力的新方向。由于納米微粒尤其是納米金具有易控的表面化學能力，獨特的光學性質以及局域場增強效應等特性，其在生物組織成像、癌癥的診斷和治療方面受到了廣泛重視。CT成像圖像采集時間短、空間分辨率高(50-200 μ m)，可整體成像、費用低廉，就可用性、效率和成本等多方面考慮，CT是臨床上最有效的診斷工具之一。現有的含碘CT造影劑能夠有效吸收X射線，但在體內僅有很短的留存時間即被腎臟清除，成像時間短(15分鐘以內)。而且本身可修飾性差，很難與腫瘤標記物耦合，不具備靶向性。此外，含碘造影劑對腎臟存在毒性，血管滲透壓高。納米金與之相比，具有更高的X射線衰減能力，體內循環時間長，并且很容易和生物分子結合，可以靶向腫瘤細胞。目前制備葉酸包被的納米金也有一些方法，比如，Wang等(Li GP, Li D, ZhangLXj Zhai JFj Wang EKj one-stop synthesis of Folic Acid protected GoldNanoparticlesand Their Receptor-Mediated Intracellular Uptake,Chem. Eur. J. , 200915:9868-9873)報道了一種在溫和條件下，以葉酸為還原劑制備納米金顆粒，并具有一定的優點。但這種方法制備使用時較長。孫莉萍等人(孫莉萍，賴友群，張召武，馬燕燕，賈靜，葉酸受體靶向型納米金顆粒的合成方法，發明專利CN: 102029401)利用微波加熱法制備葉酸包裹的納米金顆粒。但這種方法需要特殊的微波設備。上述的兩種方法所制備的粒徑都不均勻，而且沒有驗證是否可以應用于CT成像。

發明內容
本發明解決的問題在于提供一種葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針的制備方法，制備出作為靶向腫瘤探針的葉酸包裹的納米金粒子。本發明是通過以下技術方案來實現一種葉酸包被的納米金的制備方法，包括以下步驟I)以葉酸為包裹劑，將葉酸溶解于用于制備納米金的含有金離子的溶液中，并調節其pH為7. O 7. 5，得到混合溶液，其中葉酸與金離子的摩爾比為1:5 10 ; 2)向混合溶液中加入還原劑，然后快速攪拌反應至少lh，反應結束后自然冷卻，透析去除未反應的部分，得到葉酸包被的納米金。所述的用于制備納米金的含有金離子的溶液為氯金酸溶液。將葉酸溶于水，加熱攪拌，使葉酸溶解之后，再加入到含有金離子的溶液中。所述的混合溶液中葉酸的濃度為O. 08 O. 24mmol/L,金離子的濃度為O. 4 1.5mmol/L。所述的還原劑為硼氫化鈉，硼氫化鈉與金離子的摩爾比為520:4 15。所述向混合溶液中加入還原劑,然后快速攪拌反應2 3h,攪拌速度為1000 1500轉/分。所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所述的透析其透析截流分子量大于50(Tl000D的物質，透析6 12小時。所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所制備的葉酸包被的納米金的粒徑為3 5nm，在質量濃度為3. 5%NaCl溶液中和25000r/min離心下均不會發生聚沉。所述的葉酸包被的納米金的制備方法在制備葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針中的應用。所制備的葉酸包被的納米金作為葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的葉酸包被的納米金的制備方法，以葉酸為穩定劑和包裹劑，以硼氫化鈉為還原劑，簡單快捷地制備出葉酸包裹的納米金粒子(folic acidcoatd goldnanoparticles, FA-GNPs)作為祀向腫瘤探針。這種納米探針粒徑分布在3_5nm之間,體系均一、穩定，而且在高鹽環境(3. 5%NaCl溶液)和高速離心(25000rpm)下均不會發生聚沉，而且對X射線具有強吸收，能夠靶向腫瘤細胞并且可以對腫瘤進行清晰成像。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs，通過FA-FR特異性結合到!fepG2細胞表面，而GNPs在30min內未能結合到MR-90細胞表面。HepG2細胞表面大量表達FR，而IMR-90細胞表面基本不表達FR，表明所制備的FR-GNPs對腫瘤細胞表面表達的FR存在靶向性。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs，對X射線具有較高的衰減能力，可以作為CT成像造影劑；FA-GNPs能夠為腫瘤提供高對比度的CT成像。


圖1-1為FA-GNPs TEM照片，圖1-2為FA-GNPs的粒徑分布圖；圖2-1 為 FA-GNPs 的 XPs 全譜圖；圖2-2為FA-GNPs中各元素的XPS分譜，其中A為Au4f、B為Cls、C為Nls、D為Ols ；圖3-1為FA-GNPs和H印G2細胞培養30分鐘后的電鏡照片；圖3-2為GNPs和H印G2細胞培養30分鐘后的電鏡照片；圖4為添加有FA-GNPs的培養液在HepG2細胞培養前后吸光度值變化圖； 圖5-1為圖5-2中各FA-GNPs的不同濃度分布；圖5-2為對應的FA-GNP不同濃度的FA-GNPs CT成像(反色處理)；圖5-3為不同濃度FA-GNPs的CT值曲線；圖6為裸鼠背部大腿兩側分別種植宮頸癌腫瘤的照片；圖7為裸鼠從尾到頭不同橫截面的CT成像，視圖左側為R，右側為L，裸鼠擺放時左傾；箭頭所指處為注射過FA-GNPs的H印G2腫瘤組織。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。實施例1一種葉酸包被的納米金的制備方法，包括以下步驟稱取FA O. 0018g,溶于50mL超純水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此時FA與HAuCl4的摩爾比為1:6，放置在加熱攪拌器上，攪拌5min以上(具體時間不要求，混勻即可)采用濃度為IM和O.1M的NaOH溶液調節體系pH值至7. 4左右，此時溶液恰好呈現亮黃色，FA全部溶解。稱取O.1g NaBH4,溶于2mL超純水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈現出深酒紅色，并快速攪拌2小時，攪拌速度為1200轉/分左右。自然冷卻后，將獲得的樣品在超純水中(透析截流分子量大于500D的物質)12小時，去除未反應的分子，即獲得葉酸包被的納米金探針，把制備好的樣品放入4°C冰箱保存。實施例2一種葉酸包被的納米金的制備方法，包括以下步驟稱取FA O. 0026g,溶于50mL超純水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此時FA與HAuCl4的摩爾比為1:4，放置在加熱攪拌器上，攪拌5min以上(具體時間不要求，混勻即可)采用濃度為IM和O.1M的NaOH溶液調節體系pH值至7. 2左右，此時溶液恰好呈現亮黃色，FA全部溶解。稱取O. 12g NaBH4,溶于2mL超純水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈現出深酒紅色，并快速攪拌2小時，攪拌速度為1500轉/分左右。自然冷卻后，將獲得的樣品透析12小時，去除未反應的分子，即獲得葉酸包被的納米金探針，把制備好的樣品放入4°C冰箱保存。實施例3
一種葉酸包被的納米金的制備方法，包括以下步驟稱取FA O. 0053g,溶于50mL超純水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此時FA與HAuCl4的摩爾比為1:2，放置在加熱攪拌器上，攪拌5min以上(具體時間不要求，混勻即可)采用濃度為IM和O.1M的NaOH溶液調節體系pH值至7. 5左右，此時溶液恰好呈現亮黃色，FA全部溶解。稱取O. 13g NaBH4,溶于2mL超純水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈現出深酒紅色，并快速攪拌3小時，攪拌速度為1000轉/分左右。自然冷卻后，將獲得的樣品透析12小時，去除未反應的分子，即獲得葉酸包被的納米金探針，把制備好的樣品放入4°C冰箱保存。本發明所制備的納米粒子通過電子顯微鏡觀測，發現其粒徑分布均一，在3 5nm之間，如圖1所示。 通過X射線電子能譜測量了納米金與葉酸的結合情況，如圖2-1、2_2所示。圖2-1為FA-GNPs的XPS全譜，結合能在80-90、280-290、395-405和530_540eV處的波峰分別由Au 4f、C Is、N Is 和 O Is 產生的。圖2-2 (B)中C-H鍵的結合能實際測得為283. 15，與標準值相差1. 65，因此整個能譜的結合能按+1. 65進行校準。圖2-2 (A)中結合能在84. 09和87. 09eV有兩個峰，均由AuO產生，分別為Au 4f7/2和Au 4f5/2，表明體系中存在Au3+被還原；圖2_2 (C)中結合能在399. 12和400. 82eV的波峰由Nls產生，分別為-NH2和-OCONH中的N元素，均由FA提供；圖2-2 (D)中結合能在531. 78,533. 00和534. 61eV處的波峰可能分別由-0H、_C00H和-OCNH-產生。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs具有腫瘤細胞靶向特性。將FA-GNPs和GNPs分別與HepG2細胞共同培養，為了防止出現FA與FR發生競爭性結合，細胞培養體系(尤其是細胞培養液)均未帶入FA。30min以后，用PBS洗去多余的FA-GNPs，通過銀染增強使結合在HepG2表面的FA-GNPs表面形成銀殼。將銀染后的細胞經戊二醛固定后送掃描電鏡觀察，如圖3-1、3-2所示。圖3-1、3-2為分別與FA-GNPs和GNPs培養30min后的H印G2細胞的電鏡照片，圖3-1中細胞上吸附著大量的白色物質，而圖3-2的細胞上基本沒有，認為這些白色物質為包被銀殼的FA-GNPs。同時樣本做電鏡前處理前已經過PBS溶液多次清洗，基本去除未結合的FA-GNPs和GNPs，而視野的干凈整潔，排除銀顆粒吸附的可能性。因此可以得出結論=FA-GNPs通過FA-FR特異性結合到!fepG2細胞表面，而GNPs在30min內未能結合到IfepG2細胞表面。HepG2細胞表面大量表達FR，而MR-90細胞表面基本不表達FR，證明本發明制備的FR-GNPs對腫瘤細胞表面表達的FR確實存在靶向性。FA-GNPs添加到細胞培養液一段時間后，FA-GNPs通過FA-FR的特異性結合結合到HepG細胞表面，細胞培養液中的FA-GNPs含量減少，524nm處的吸光度值較培養前大幅降低(見圖4)。吸光度值的降低在此稱之為相對吸光度值(Λ A)，可以間接、定性的表示FA-GNPs與H印G2細胞結合的數量多寡。其中，524nm處H印G2細胞培養前吸光度值為O. 63508 ;細胞培養后為O. 40961，Λ A=O. 22647，從側面說明大量FA-GNPs已與!fepG2細胞結合。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs對X射線具有較高的衰減能力，可以用其作為CT成像造影劑。圖5-1 5-3直觀反映FA-GNPs對X射線的衰減能力隨著濃度的增大而增強，而純水的CT值為O，故圖5-2中未現純水對應的黑點。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs可以進行在體腫瘤CT成像。首先建立動物腫瘤模型，在小鼠的尾部左右側均種植宮頸癌腫瘤，待腫瘤長大Icm左右進行在體實驗，如圖6所示。實驗中在裸鼠的一側腫瘤注射200 μ L260mg Au/mL的FA-GNPs，另一側注射200 μ L PBS溶液(見圖7)，進行CT掃描成像。圖7 (Α L)為裸鼠從尾到頭不同橫截面的CT成像，左右方向與裸鼠照片鏡像。圖7 (D F)中箭頭所指處為注射有FA-GNPs的!fepG2腫瘤區域，可見該區域高對比度，與骨骼亮度無異，而對側對照組與軟組織無法區分。兩者 對比顯而易見FA-GNPs能夠為腫瘤提供高對比度的CT成像。
權利要求
1.一種葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)以葉酸為包裹劑，將葉酸溶解于用于制備納米金的含有金離子的溶液中，并調節其 pH為7. O 7. 5，得到混合溶液，其中葉酸與金離子的摩爾比為1:2 6 ;2)向混合溶液中加入還原劑，然后快速攪拌反應至少lh，反應結束后自然冷卻，透析去除未反應的部分，得到葉酸包被的納米金。
2.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所述的用于制備納米金的含有金離子的溶液為氯金酸溶液。
3.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，將葉酸溶于水，加熱攪拌，等葉酸完全溶解之后，再加入到含有金離子的溶液中。
4.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所述的混合溶液中葉酸的濃度為O. 08 O. 24mmol/L,金離子的濃度為O. 4 1. 5mmol/L。
5.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所述的還原劑為硼氫化鈉，硼氫化鈉與金離子的摩爾比為520:4 15。
6.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，向混合溶液中加入還原劑，然后快速攪拌反應2 3h，攪拌速度為1000 1500轉/分。
7.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所述的透析其透析截流分子量大于50(Tl000D的物質，透析6 12小時。
8.如權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法，其特征在于，所制備的葉酸包被的納米金的粒徑為3 5nm，在質量濃度為3. 5%NaCl溶液中和25000r/min離心下均不會發生聚沉。
9.權利要求1所述的葉酸包被的納米金的制備方法在制備葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針中的應用。
10.權利要求1所制備的葉酸包被的納米金作為葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針的應用。
全文摘要
本發明公開了一種葉酸受體靶向腫瘤的CT成像分子探針的制備方法，以葉酸為包裹劑，將葉酸溶解于用于制備納米金的含有金離子的溶液中，并調節其pH為7.0～7.5，得到混合溶液，其中葉酸與金離子的摩爾比為1:2～6；向混合溶液中加入還原劑，然后快速攪拌反應至少1h，反應結束后自然冷卻，透析去除未反應的部分，得到葉酸包被的納米金。本發明所制備的葉酸包被的納米金FA-GNPs，對X射線具有較高的衰減能力，可以作為CT成像造影劑；FA-GNPs能夠為腫瘤提供高對比度的CT成像。
文檔編號A61K49/04GK102989015SQ20121052841
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者姚翠萍, 張鎮西, 楊洋, 郭佑民, 張少娟, 董艷花, 王晶, 梅建生 申請人:西安交通大學