凝血因子Ⅶ和Ⅶa衍生物、包括其的綴合物和復合體及其用途
【專利摘要】本發明涉及凝血因子Ⅶ衍生物，凝血因子Ⅶa衍生物，每個通過將能夠延長血液半衰期的聚合物連接至該衍生物制備的FacⅦ和FacⅦa綴合物，每個通過將載體連接至該綴合物制備的FacⅦ和Ⅶa復合體，編碼FacⅦ和FacⅦa衍生物的基因，包括該基因的表達載體，引入該表達載體的轉化體，使用該轉化體制備FacⅦ和FacⅦa衍生物的方法，制備FacⅦa綴合物和復合體的方法，通過該方法制備的FacⅦa復合體，包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分的用于預防或治療血友病的藥學組合物，以及包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分的用于血液凝結的藥學組合物。進一步，本發明涉及預防或治療血友病或促進血液凝結的方法，其包括向對象施用治療有效量的該組合物。本發明的FacⅦ或FacⅦa衍生物能夠結合能夠改進血液半衰期同時保留FacⅦ或FacⅦa活性的載體，并且它們可廣泛地用于開發用于血友病的有效預防或治療試劑。
【專利說明】凝血因子VII和VII a衍生物、包括其的綴合物和復合體及其

用途【技術領域】
[0001]本發明涉及凝血因子Vn衍生物，凝血因子YD a衍生物，每個通過將能夠延長血液半衰期的聚合物連接至該衍生物制備的Fac VII和Fac W a綴合物，每個通過將載體連接至該綴合物制備Fac VII和YD a復合體，編碼Fac VII和Fac W a衍生物的基因，包括該基因的表達載體，引入該表達載體的轉化體，使用該轉化體制備Fac VII和Fac W a衍生物的方法，制備Fac YD a綴合物和復合體的方法，通過該方法制備的Fac W a復合體，包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分用于預防或治療血友病的藥學組合物，以及包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分用于促進血液凝結的藥學組合物。進一步，本發明涉及預防或治療血友病或促進血液凝結的方法,包括向對象施用治療有效量的組合物。
【背景技術】
[0002]目前，估計全世界有14萬人患血友病，顯示20%的每年增加。遺傳上，萬分之一的人中出現血友病，但是僅僅所有患者的約25%得到診斷或治療?；诓≡瓕W，血友病主要分為兩種類型:一種是血友病A，其由于缺少凝血因子VII (因子VL Fac YD)引起，并且占總血友病患者的80%，和另一種是血友病B，其由于缺少凝血因子XI (因子XI)引起，并且占總血友病患者的20%。對于血友病的治療，已經給出了外部施用凝血因子，但是該治療方法是有問題的，因為所有血友病A患者的10-15%形成抗凝血因子的抗體,和所有血友病B患者的1-3%形成抗凝血因子 的抗體。
[0003]另一方面，Fac VL其是占大于一半血友病患者的血友病A的原因，是主要在肝臟產生并且由406個氨基酸組成的酶，并且包括在位置10處的谷氨酸的Y -羧基化、在位置145和322處的天冬酰胺的N-糖基化、和在位置52和60處的絲氨酸的O-糖基化。進一步，Fac VII具有兩個EGF-樣結構域和一個絲氨酸蛋白酶結構域，并且通過在位置152處的精氨酸和在位置153處的異亮氨酸之間的切割，以生產由輕鏈和重鏈組成的雙鏈Fac W a,活化單鏈Fac VII。由于活化的Fac W a通過輔助凝血機理作用——不像其他凝血因子，所以即使注射高劑量Fac W a也不產生抗體。所以，它可用于治療血友病A患者以及由于常規治療具有抗FacVD的抗體的患者，并且已知作為解決上述問題的手段。
[0004]但是，雖然不產生抗Fac VDa的抗體，但是由于短的血液半衰期存在需要高劑量、頻繁施用的另一個問題。因為短的半衰期，Fac W a應一天施用2-3次用于治療血友病，并且該頻繁施用也成為預防血友病的嚴重障礙。為了解決短血液半衰期的問題，研究已經提示已知的微膠囊、脂質體包封和多種化學修飾，但是成功的結果尚未報道。具體而言，已經嘗試化學修飾，使得Fac VD a表面的賴氨酸殘基或N-末端被化學修飾，或將能夠延長血液半衰期的載體，比如聚乙二醇、白蛋白、轉鐵蛋白和免疫球蛋白片段與其連接，或將半胱氨酸殘基插入到不直接影響Fac W a活性的區域以促進與其它載體的結合。但是，Fac YD a表面上的賴氨酸殘基或N-末端的化學修飾降低了 Fac VDa結合血小板的膜的能力。當其連接至其他載體時，載體干擾酶活性。半胱氨酸殘基的插入誘導非特異性二硫鍵的形成，結果造成酶活性的降低。如此，已經做出許多研究以開發具有改進的血液半衰期而不降低Fac VDa活性的衍生物，但是成功的結果尚未報道。
[0005]通過融合白蛋白至Fac VII a的C-末端制備的r VII a_FP (CSL Behring)處于臨床前階段，并且其在大鼠中的血液半衰期增加至比天然Fac YD a高6.7倍。但是，其仍具有非常短的4.38hrs的半衰期，并且因此不適于治療和預防血友病。通過使用聚乙二醇化的脂質體制劑制備的PEGLip-F W a (Omri)也處于臨床前階段,但是其血液半衰期僅僅比天然FacVIIa高2倍。
[0006]兩種產品，為具有延長的血液半衰期通過Fac YD a的Gla結構域突變和高糖基化制備的MAXY-YD (Bayer/Maxygen)和為具有延長的血液半衰期通過40K PEG糖基化制備的NN7128 (Novo/Neose)處于臨床研究，但是它們的血液半衰期僅僅比天然Fac YD a高5倍。因此，它們不適于有效治療和預防血友病。

【發明內容】

[0007]技術問題
[0008]基于該背景，本發明人已經做出許多努力以開發具有改進的血液半衰期同時保留Fac VII和Fac W a最大活性的衍生物。結果，他們發現通過融合一部分SODl (超氧化物歧化酶I)序列至Fac VII的C-末端制備的衍生物能夠容易地結合能夠延長血液半衰期的載體比如聚乙二醇、白蛋白、轉鐵蛋白和免疫球蛋白片段而不降低Fac VII或Fac W a的活性，并且具體而言，免疫球蛋白Fe區域、非肽基聚合物和Fac VII或Fac W a衍生物是經過共價鍵位點特異性地連接以使活性下降最小化并且顯著增加綴合物的血液半衰期，從而完成本發明。
[0009]技術方案
[0010]本發明的目的是提供Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物，其具有凝血因子W (因子VL FacVD )，或其活性形式凝血因子VDa (因子Vila，Fac VDa)的氨基酸序列，和在C-末端處的肽接頭。
[0011]本發明的另一目的是提供編碼Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物的多核苷酸。
[0012]本發明的仍另一目的是提供包括該多核苷酸的表達載體。
[0013]本發明的仍另一目的是提供引入該表達載體的轉化體。
[0014]本發明的仍另一目的是提供使用該轉化體用于制備Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物的方法。
[0015]本發明的仍另一目的是提供Fac VII或其活性形式Fac W a的綴合物，其通過將能夠延長血液半衰期的聚合物連接至該衍生物的肽接頭制備。
[0016]本發明的仍另一目的是提供Fac VII或其活性形式Fac W a的復合體，其通過將能夠延長血液半衰期的載體連接至該綴合物的一端制備。
[0017]本發明的仍另一目的是提供包括活化FacVD復合體的步驟在內的用于制備Fac W a復合體的方法。
[0018]本發明的仍另一目的是提供通過以上方法制備的Fac W a復合體。
[0019]本發明的仍另一目的是提供用于預防或治療血友病的藥學組合物，其包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分。
[0020]本發明的仍另一目的是提供用于血液凝結的藥學組合物，其包括該衍生物、綴合物或復合體作為活性成分。
[0021]本發明的仍另一目的是提供預防或治療血友病的方法，其包括向對象施用治療有效量的用于預防或治療血友病的藥學組合物的步驟。
[0022]本發明的仍另一目的是提供用于促進血液凝結的方法，其包括向對象施用治療有效量的用于血液凝結的藥學組合物的步驟。
[0023]本發明的優勢效果
[0024]本發明的Fac VII或Fac W a衍生物能夠結合能夠改進血液半衰期同時保留Fac W或Fac YD a的活性的載體，并且它們可廣泛地用于開發用于血友病的有效預防試劑或治療試劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1a是顯示293F細胞系中表達的Fac W -ATKAVC的蛋白質印記分析的結果的照片;
[0026]圖1b是顯示293F細胞系中表達的對照組和Fac W -GGGGSC的蛋白質印記分析的結果的照片；
[0027]圖1c是顯示示出293F細胞系中表達的Fac W -ATKAVC和Fac W -SODl 1-149的分子量差異的蛋白質印記分析結果的照片；
[0028]圖2是顯示純化的Fac W -ATKAVC的電泳結果的照片；
[0029]圖3是顯示Fac W -ATKAVC-PEG綴合物的電泳結果的照片；
[0030]圖4a是顯示Fac W a_ATKAVC-PEG_Fc綴合物的電泳結果的照片；
[0031]圖4b是顯示Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc綴合物的蛋白質印記分析結果的照片；和
[0032]圖5是顯示Fac VII和Fac W -ATKAVC的體外活性的濃度依賴性吸光度的圖。
【具體實施方式】
[0033]在實現上述目的的一個方面中，本發明提供Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物，其具有凝血因子Vn (因子VL FacW)的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)和在C-末端處的妝接頭。
[0034]如本文所使用，術語“凝血因子Vn (因子VL Fac νπ)”也稱為前轉變素，其為參與血液凝結的因子之一，并且具有48kDa的大小，它由具有12.Skb大小的基因編碼，并且主要在肝臟中產生，且是一種維生素K依賴性血漿蛋白質。已知FacVD結合血管外組織比如絲氨酸蛋白酶前體和平滑肌細胞、腫瘤組織或活化的白細胞的表面上的凝血因子III，并且因此活化凝血因子IX和X，導致外部血液凝結的開始。在本發明中，Fac VII可包括天然Fac VL保留天然Fac VII的正?；钚缘幕瘜W修飾的Fac VII衍生物，以及與天然Fac VII具有至少80%氨基酸序列同源性，優選85^^90%或95%氨基酸序列同源性，和更優選98%或99%氨基酸序列同源性同時它們保留天然FacVD的正?；钚缘淖凅w。但是，序列同源性不限于此，只要它們展示天然Fac VII的活性。
[0035]如本文所使用，術語“凝血因子YD a (因子YD a, Fac W a) ”意思是凝血因子YD (因子VL Fac YD)的活性形式，并且通過在位置152處的精氨酸和在位置153處的異亮氨酸之間的切割產生由輕鏈和重鏈組成的雙鏈Fac W a,活化單鏈Fac VII。由于活化的Fac YD a通過輔助凝血機理作用一不像其它凝血因子，即使注射高劑量的Fac VDa也不產生抗體。在本發明中，Fac VII可包括天然Fac W a,保留天然Fac W a的正常活性的化學修飾的Fac W a衍生物，和與天然Fac YD具有至少80%氨基酸序列同源性，優選85%、90%或95%氨基酸序列同源性，和更優選98%或99%氨基酸序列同源性同時它們保留天然Fac W a的正常活性的變體。但是，序列同源性不限于此，只要它們展示天然Fac VII的活性。 [0036]如本文所使用，術語“接頭(linker)”基本上指使用氫鍵、靜電相互作用、范德華力、二硫鍵、鹽橋、疏水相互作用、共價鍵或類似物能夠連接兩個不同的融合配偶體(例如，生物聚合物)的手段。優選地，它可具有在生理條件或其他標準肽條件(例如，肽純化條件、肽儲存條件)下參與至少一個二硫鍵的至少一個半胱氨酸?？赡苁褂冒腚装彼嶙鳛檫B接融合偶連體以及二硫鍵的反應性基團。另外，接頭對提供在載體之間的預定空間起作用或用作提供融合蛋白質柔性或剛性的鉸鏈，以及它簡單地對連接每個融合偶連體起作用。在本發明中，接頭是，但不具體限于，連接Fac VII或Fac YD a的C-末端以連接能夠延長血液半衰期的載體的肽接頭，并且優選地肽接頭的C-末端半胱氨酸殘基。它可以優選地是SODl (超氧化物歧化酶I)的部分序列(SEQ ID N0.30)，更優選地，選自SODl序列的I至149的部分序列(SEQ ID N0.31)，更優選地選自SODl序列的I至90的部分序列(SEQ ID N0.32)，甚至更優選地選自SODl序列的I至25的部分序列(SEQ ID N0.33)，和最優選地從SODl序列的I至6的部分序列(SEQ ID N0.5)。
[0037]如本文所使用，術語“S0D1 (超氧化物歧化酶I) ”意思是將反應性氧、超氧離子催化為氧和過氧化氫的歧化作用的酶，并且已知表示在暴露于氧的所有細胞中重要的抗氧化劑防衛。在本發明中，SODl用作能夠連接Fac VII與能夠延長血液半衰期的載體的肽接頭。通常在機體中發現的SODl被用作接頭，從而降低對接頭的免疫原性。肽接頭SODl序列中的VLKG (纈氨酸-亮氨酸-賴氨酸-甘氨酸)可被Fac W a衍生物識別和切割的自切割位點序列IPRI (異亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-異亮氨酸)替換。由于該自切割序列的替換，當活化時，通過Fac W a衍生物可去除對于活化不是必須的接頭區域。
[0038]在本發明中，自切割位點是包含具體序列的位點，其中多肽在其自身序列中具有相應的具體序列，并且識別和切割它。
[0039]如本文所使用，術語“Fac YD衍生物”意思是由通過將肽接頭連接至Fac VII的C-末端制備的氨基酸序列組成的修飾Fac VII。本發明的Fac VII衍生物意思是活化之前的形式，并且當通過具體的方法活化時，改變為Fac W a衍生物。在本發明中，除了在特定的步驟，例如，綴合物或類似物的制備過程中，Fac VII衍生物和Fac W a衍生物可具有等同的意思。在本發明中，Fac VII衍生物是，但不具體限于，通過將SODl序列的從I至6的ATKAVC(SEQID N0.5)連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.9)、通過將GGGGSC (SEQID N0.10)連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.13)、通過將SODl序列從I至149的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.14)、通過將SODl序列從I至90的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ IDN0.34)、通過將SODl序列從I至25的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.35)、通過將突變SODl序列從I至149的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.20)、通過將突變SODl序列從I至90的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.27)或通過將突變SODl序列從I至25的氨基酸序列連接至FacVD衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.24)。
[0040]如本文所使用，術語“Fac W a衍生物”意思是Fac VII衍生物的活性形式，其具有與Fac VII衍生物相同的氨基酸序列，但是通過在位置152和153處的氨基酸之間的切割被活化。在本發明中，Fac YD a衍生物是，但不具體限于，通過將SODl序列從I至6的ATKAVC (SEQID N0.5)連接至Fac VDa衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.9)、通過將GGGGSC (SEQID N0.10)連接至Fac W a衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.13)、通過將SODl序列從I至149的氨基酸序列連接至Fac W a衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.14)、通過將SODl序列從I至90的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQID N0.34)、通過將SODl序列從I至25的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.35)、通過將突變SODl序列從I至149的氨基酸序列連接至Fac W a衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.20)、通過將突變SODl序列從I至90的氨基酸序列連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.27)或通過將突變SODl序列從I至25的氨基酸序列連接至Fac W a衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.24)。
[0041]本發明人研究活化的FacVD的特性，并且它們旨在開發具有改進的血液半衰期而不降低Fac W a的活性的衍生物。非活化的Fac VII是通過連接輕鏈和重鏈的單鏈Fac VL并且僅僅暴露輕鏈的N-末端。但是，當它變成Fac YD a時，重鏈的活化位點通過在位置152處的精氨酸和在位置153處的異亮氨酸之間的切割而被暴露，并且在位置153處暴露的異亮氨酸變成重鏈的N-末端。重鏈和輕鏈的N-末端在Fac W a活化中起到重要的作用，和因此與天然Fac VII相比，在N-末端處的綴合可降低Fac VII的活性。
[0042]由于該原因，本發明人提供了通過使用SODl肽序列的片段作為接頭制備的FacVD衍生物，該肽片段包含結構上未暴露于外部并且因此不參與二硫鍵的半胱氨酸。另外，可被Fac W a衍生物識別和切割的自切割位點序列插入作為接頭連接的肽片段中，和因此可去除對于活化不是必須的接頭。本發明提供了具有在C-末端處包含SODl肽的游離半胱氨酸的片段的Fac VII衍生物。發現在溫育期間以最低水平產生二聚體形式的Fac VII衍生物，并且Fac VII衍生物能夠容易與能夠延長血液半衰期的載體形成綴合物，從而彌補天然Fac W和通過將半胱氨酸簡單插入Fac VD a制備的衍生物的缺點。
[0043]所以，通過將能夠顯著改進血液半衰期、保留血液凝結功能和顯著增加藥物順從性的物質連接至本發明的Fac VII或Fac W a衍生物的C-末端制備綴合物，從而制備比已知產品具有改進血液凝結和預防或治療血友病更卓越效果的產品。
[0044]在另一方面，本發明提供編碼FacVD衍生物的多核苷酸、包括該多核苷酸的表達載體、引入表達Fac VII衍生物的表達載體的轉化體、和使用該轉化體用于制備Fac VII衍生物的方法。
[0045]本 發明提供的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸是，但不具體限于，通過將編碼Fac W的區域連接至編碼肽接頭的區域制備的多核苷酸，以及優選編碼通過將SODl序列從I至6的ATKAVC (SEQ ID N0.5)連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.9)的多核苷酸(SEQ ID N0.8)，編碼通過將GGGGSC (SEQ ID N0.10)連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.13)的多核苷酸(SEQ ID N0.12)，編碼通過將SODl序列的I至149的氨基酸連接至Fac YD衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.14)的多核苷酸(SEQ IDN0.15)，編碼通過將突變SODl序列的I至149的氨基酸連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.20)的多核苷酸(SEQ ID N0.21)，編碼通過將突變SODl序列的I至90的氨基酸連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.27)的多核苷酸(SEQID N0.28)或編碼通過將突變SODl序列的I至25的氨基酸連接至Fac VII衍生物的C-末端制備的多肽(SEQ ID N0.24)的多核苷酸(SEQ ID N0.25)。
[0046]本發明提供的包括編碼FacVD衍生物的多核苷酸的表達載體是，但不具體限于，在真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(例如，人、猴、兔、大鼠、倉鼠、小鼠細胞等)、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(例如，大腸桿菌等)中能夠復制和/或表達多核苷酸的載體，并且優選地載體被可操作地連接至合適的啟動子以在宿主細胞中表達多核苷酸，并且包含至少一個篩選標記。更優選地，它可以是通過將多核苷酸引入噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒載體或逆轉錄病毒載體制備的表達載體。最優選地，它可以是包括通過將編碼SODl序列從I至6的ATKAVC (SEQ ID N0.5)的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸的表達載體pXOGC-F W -ATKAVC,包括通過將編碼GGGGSC (SEQ ID N0.10)的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸的表達載體pXOGC-F W -GGGGSC，包括通過將編碼SODl序列從I至149的氨基酸序列(SEQ ID N0.14)的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸的表達載體pXOGC-F YD-SODl 1-149，包括通過將編碼突變SODl序列的I至149的氨基酸的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’-末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸(SEQ ID N0.21)的表達載體pXOGC-F YD-SODlIPRI，包括通過將編碼突變SODl序列的I至90的氨基酸的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸(SEQ ID N0.28)的表達載體pXOGC-F YD-S0D11-90IPRI或包括通過將編碼突變SODl序列的I至25的氨基酸的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸(SEQ ID N0 .25)的表達載體 pXOGC-F YD-S0D11-25IPRI。
[0047]本發明提供的引入該表達載體的轉化體是，但不具體限于，細菌細胞比如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門菌；酵母細胞比如畢赤酵母；昆蟲細胞比如果蠅和夜蛾Sf9細胞；動物細胞比如CH0、COS、NS0,293和鮑斯黑素瘤細胞；或植物細胞，其通過引入表達載體而被轉化。它可以優選地是通過將表達載體引入293F或CHO細胞系制備的轉化體，和最優選地是通過將表達載體pXOGC-F W -ATKAVC引入CHO細胞系制備的HMF709。
[0048]本發明提供的用于制備Fac VII衍生物的方法包括以下步驟:(i)培養轉化體從而獲得培養液；和(ii)從培養液回收Fac VII衍生物。
[0049]該方法進一步包括活化回收的Fac VII衍生物的步驟，從而從制備的Fac VII衍生物制備Fac VDa衍生物。活化方法與如上所述的相同。
[0050]本發明人制備包括編碼FacVD衍生物的多核苷酸的表達載體pXOGC-F VD-ATKAVC，所述多核苷酸通過將編碼SODl序列從I至6的ATKAVC (SEQ ID N0.5)的多核苷酸連接至Fac VII基因的3’ -末端制備(實施例2-1)，并且將該表達載體引入293F細胞系(實施例3-1)或CHO細胞系(實施例3-2)，從而獲得轉化體。隨后，從轉化體表達Fac VII衍生物，并且純化表達的Fac VII衍生物(實施例4，圖2)。表達的Fac VII衍生物被活化以制備Fac W a衍生物，接著比較其活性與天然Fac VDa的活性(實施例6和圖4)。結果，發現由本發明的Fac YD衍生物制備的Fac W a衍生物顯示與天然Fac W a相當的活性。因此，從通過將表達載體pXOGC-F W -ATKAVC引入CHO細胞制備的轉化體選擇顯示最高表達水平的Fac W衍生物的克隆，并且命名為“HMF709”，并且保藏在韓國生物科學與生物技術研究所，韓國典型菌種保藏中心(IIIGwahangno, Yuseong-gu, Daejeon, Korea),編號為 “KCTC12022BP”。
[0051]在仍另一方面中，本發明提供Fac VII或其活性形式Fac W a的綴合物，其通過將能夠延長血液半衰期的聚合物連接至Fac VII衍生物的肽接頭制備。
[0052]本發明的聚合物可以是能夠延長血液半衰期的聚合物，比如聚乙二醇，并且選自蛋白質載體，比如免疫球蛋白片段、轉鐵蛋白、抗體和白蛋白。
[0053]本發明提供了通過將FacVD衍生物與蛋白質載體使用非肽基聚合物作為接頭體外連接而不使用遺傳重組方法制備的綴合物。
[0054]本發明的非肽基聚合物指設計以抗由血液或血清中的各種酶或免疫分子的降解的非肽基聚合物。不限于如下的非肽基聚合物可以選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸和其組合。并且非肽基聚合物可經除了肽鍵之外的任何種類的共價鍵彼此連接。進一步，本領域已知的其衍生物和通過任何本領域已知的技術容易制備的衍生物也在本發明的范圍內。在本發明中，非肽基聚合物可被連接至Fac VII衍生物或Fac VDa衍生物的肽接頭。非肽基聚合物可被連接至肽接頭的多個結合位點。優選地，非肽基聚合物可被連接至存在于Fac VII衍生物或Fac W a衍生物的肽接頭的C-末端。
[0055]非肽基聚合物可以包括反應性基團，其可包括，但不限于醛、丙醛、丁醛、馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺(丙酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基羧甲基、羥基琥珀酰亞胺基或碳酸琥珀酰亞胺酯)。另外，非肽基聚合物可具有單反應性基團或雙反應性基團。如果非肽基聚合物包括兩個或更多個反應性基團，它可以在一個反應性基團被連接至Fac VII衍生物的接頭，并且也在其它反應性基團連接至另一個載體比如抗體、免疫球蛋白片段、白蛋白或轉鐵蛋白。例如，當非肽基聚合物在一端具有反應性醛基并且在另一端具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團，非特異性反應可被最小化，并且它在非肽基聚合物的兩端選擇性結合Fac VII衍生物或Fac W a衍生物和載體方面是有效的。由于醛鍵，通過還原性烷基化產生的最終產品可以比酰胺鍵更穩定。另外，醛反應性基團與載體的氨基末端在低PH下選擇性地反應，并且在高pH，例如pH9.0下可與賴氨酸殘基形成共價鍵。
[0056]在仍另一方面中，本發明提供Fac VII或其活性形式Fac W a的復合體，其通過經非肽基聚合物將Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物與免疫球蛋白Fe區域連接制備。
[0057]經非肽基聚合物連接至載體比如抗體、免疫球蛋白片段、白蛋白和轉鐵蛋白，具別地，免疫球蛋白Fe的Fac VII復合體可通過以下步驟制備:(I)將在其一端具有醛或琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽基聚合物共價連接至免疫球蛋白Fe的胺基；(2)從步驟(1)的反應混合物回收綴 合物，其包括與非肽基聚合物在胺基處共價連接的免疫球蛋白Fe區域；(3)將Fac VII衍生物共價連接至回收的綴合物中具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團的非肽基聚合物的另一端，從而產生在非肽基聚合物的每個端具有免疫球蛋白Fe區域和Fac VII衍生物的Fac VII復合體；和(4)活化步驟(3)中產生的Fac VII綴合物,從而產生具有經非肽基聚合物連接的Fac W a和免疫球蛋白Fe區域的Fac W a復合體。[0058]進一步，Fac YD復合體可通過以下步驟制備:(I)將在其一端具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團的非肽基聚合物共價連接至Fac VII衍生物的C-末端硫氫基團；(2)從步驟(1)的反應混合物回收綴合物，其包括與非肽基聚合物共價連接的Fac VII衍生物；(3)將免疫球蛋白Fe區域共價連接至回收的綴合物中具有醛或琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽基聚合物的另一端，從而產生在非肽基聚合物的每個端具有免疫球蛋白Fe區域和Fac VII衍生物的Fac VII復合體；和(4)活化步驟(3)中產生的Fac VII綴合物,從而產生具有經非肽基聚合物連接的Fac W a和免疫球蛋白Fe區域的Fac W a復合體。
[0059]進一步，Fac W a復合體可通過以下步驟制備(I)將在其一端具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團的非肽基聚合物共價連接至Fac W a衍生物的C-末端硫氫基團；(2)從步驟(1)的反應混合物回收綴合物，其包括與非肽基聚合物共價連接的Fac VII衍生物；和(3)將免疫球蛋白Fe區域共價連接至回收的綴合物中具有醛或琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽基聚合物的另一端，從而產生在非肽基聚合物的每個端具有免疫球蛋白Fe區域和Fac W a衍生物的Fac W a復合體。
[0060]另一方面，非肽基聚合物可包括兩個或三個反應性末端，并且該兩個或三個反應性末端可以彼此相同或不同。例如，在其一端可具有馬來酰亞胺基團并且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當在其兩端都具有羥基反應性基團的聚(乙二醇)被用作非肽基聚合物時，通過已知的化學反應將羥基基團可活化成各種反應性基團或可使用具有可商購的修飾反應性基團的聚(乙二醇)，從而制備本發明的Fac VII綴合物和復合體。
[0061]所以，本發明的Fac VII綴合物和復合體中包括的非肽基聚合物可優選地是在一端具有甲基基團和在另一端具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團的非肽基聚合物，以及更優選地是在一端具有馬來酰亞胺、鄰位吡啶基二硫化物或硫氫反應性基團和在另一端具有醛或 琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽基聚合物，以及最優選地是在兩端分別具有馬來酰亞胺反應性基團和醛反應性基團的非肽基聚合物。
[0062]使用本發明的Fac VII衍生物用于制備綴合物或復合體的Fac VII衍生物可以是非活性形式或活化的Fac W a衍生物。但是，為了防止由于使用Fac W a衍生物在綴合物制備期間活化的Fac W a的降解，優選使用Fac VII。
[0063]作為載體，Fe區域可從人和其它動物一包括母牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠一分離的天然形式獲得。另外，免疫球蛋白Fe區域可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM,或可通過其組合或其混合物(hybrid)制造的Fe區域。優選地,它源自在人血液中最豐富的蛋白質中的IgG或IgM，并且最優選地源自IgG，其已知增強結合配體的蛋白質的半衰期。免疫球蛋白Fe可通過從人或動物有機體分離整個免疫球蛋白并且用特異蛋白水解酶處理它們而從天然免疫球蛋白獲得，并且也可通過重組技術從轉化細胞獲得。優選地，它是來自大腸桿菌的重組人類免疫球蛋白Fe區域。另一方面，將IgG劃分成IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類，并且本發明包括其組合和混合物。優選的是IgG2和IgG4亞類，并且最優選的是幾乎不具有效應子功能比如CDC(補體依賴細胞毒性)的IgG4的Fe區域。
[0064]即，作為本發明的藥物載體，最優選的免疫球蛋白Fe區域是源自人IgG4的非糖基化的Fe區域。源自人的Fe區域比源自非人的Fe區域更優選，源自非人的Fe區域可作為人體中的抗原并且引起不期望的免疫應答，比如產生抗抗原的新抗體。[0065]通過常規框內融合方法獲得的融合蛋白中使用的肽接頭具有的缺點在于它容易被蛋白水解酶體內切割，并且因此不能如期望地獲得通過載體增加活性藥物的血清半衰期的足夠效果。但是，在本發明中，對蛋白水解酶具有抗性的聚合物可用于維持類似于載體的肽的血清半衰期。所以，可沒有限制地使用任何非肽基聚合物，只要它是具有前述功能的聚合物，即，對體內蛋白水解酶具有抗性的聚合物。非肽基聚合物具有I至IOOkDa,并且優選地I至40kDa的范圍內的分子量。本發明的連接至免疫球蛋白Fe區域的非肽基聚合物，可以是一種聚合物或不同類型聚合物的組合。
[0066]在本發明的一種實施方式中，測定FacVD綴合物的體外活性。本發明旨在通過Fac VII和非肽基聚合物的位點特異性綴合使活性減少最小化。因此，使用天然Fac VII和Fac W -40kDa PEG 作為對照組測定 Fac W -ATKAVC 和 Fac W -ATKAVC_40kDa PEG 的活性(實施例7)。結果，發現與Fac VII相比，N-末端聚乙二醇化的Fac W _40kDa PEG的體外活性是約11%，并且與Fac VD -ATKAVC相比，C-末端聚乙二醇化的Fac W _ATKAVC_40kDa PEG的體外活性是約29 %。即，C-末端聚乙二醇化的Fac VD -ATKAVC-40kDa PEG維持比N-末端聚乙二醇化的Fac W -40kDa PEG的EC5tl高約2.5倍的活性，這指示通過使用ATKAVC的位點特異性綴合，Fac VII活性可維持在較高水平(表2)。
[0067]在另一實施方式中，測定通過將非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe區域連接至Fac VII綴合物制備的復合體的體外活性(實施例8)。結果，發現Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc的體外活性相比Fac W a-ATKAVC為約45% (表3)，這指示與非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe區域連接的復合體具有能夠改進血液半衰期同時保留Fac VII活性的載體，從而被廣泛地用于開發用于血友病的更有效的預防或治療試劑。 [0068]在仍另一方面中，本發明提供用于制備Fac W a綴合物的方法——包括活化Fac W綴合物的步驟，以及通過該方法制備的Fac W a綴合物。詳細地，用于制備Fac W a綴合物的方法可包括以下步驟:(i)將能夠延長血液半衰期的非肽基聚合物共價連接至Fac VII衍生物的C-末端硫氫基團；(ii)回收由連接至Fac VII衍生物的非肽基聚合物組成的Fac W綴合物；和(iii)活化回收的Fac VII綴合物從而產生具有連接至Fac W a區域的非肽基聚合物的Fac VD a綴合物。
[0069]另外，該方法包括以下步驟(i)將能夠延長血液半衰期的非肽基聚合物共價連接至Fac YD a衍生物的C-末端硫氫基團；和(ii)回收由連接至Fac W a衍生物的非肽基聚合物組成的Fac W a綴合物,從而產生具有連接至Fac W a區域的非肽基聚合物的Fac W a綴合物。
[0070]在該方法中使用的能夠延長血液半衰期的非肽基聚合物與上述是相同的，并且用于活化Fac VII或Fac VII綴合物的方法是，但不具體限于，通過將其附著至陰離子交換柱活化Fac VII或Fac VII綴合物的柱上(on_column)活化(自動活化)或通過使其在溶液相中反應活化Fac VII或Fac VII綴合物的溶液中活化。具體而言，柱上活化也稱為固相活化，并且在沒有另外組分的情況下，將FacVD或FacVD綴合物附著至陰離子交換柱后，通過“自動活化”進行。相反，溶液中活化是誘導Fac VII活化的方法，其考慮在Fac VII活化中需要的各種因素，例如鈣離子濃度、pH、溫度和Fac VII濃度。
[0071]本發明人表明，與不具有免疫球蛋白片段的天然Fac VII相比(韓國專利申請號2010-0062860)，通過經非肽基接頭將免疫球蛋白片段連接至天然Fac VII制備的綴合物的血液半衰期增加至約200倍。已熟知增加的半衰期不歸因于Fac VL而是歸因于非肽基接頭和免疫球蛋白片段。所以，通過使用制備的Fac VII衍生物制備的綴合物也預期具有增加的半衰期。
[0072]在仍另一方面中，本發明提供用于預防或治療血友病的藥學組合物或用于血液凝結的藥學組合物，其包括Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物，Fac VII或其活性形式Fac W a的綴合物，Fac VII或其活性形式Fac W a的復合體作為活性成分。
[0073]另外，本發明提供預防或治療血友病或促進血液凝結的方法，包括向對象施用治療有效量的藥學組合物。
[0074]如本文所使用，術語“預 防”意思是通過同時施用本發明組合物抑制或延緩血友病發生的所有行為，和術語“治療”意思是通過同時施用本發明組合物糖尿病的癥狀好轉或被有利地緩和的所有行為。
[0075]在本發明中，用于促進血液凝結的方法是通過從具有短半衰期的凝血因子Fac W或其活性形式Fac W a制備具有顯著增加的血液半衰期的衍生物、綴合物或復合體，促進凝血因子的行為。
[0076]進一步，本發明的藥學組合物可包括藥學上可接受的載體。如本文所使用，術語“藥學上可接受的載體”指對有機體不引起明顯的刺激并且不廢除施用化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑。對于口服施用，藥學上可接受的載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩裂齊?、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑和香料。對于可注射的制劑，藥學上可接受的載體可包括緩沖劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑。對于局部施用的制劑，藥學上可接受的載體可包括基質(base)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。本發明的藥學組合物可組合前述藥學上可接受的載體配制成多種劑型。例如，對于口服施用，藥學組合物可配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿劑或晶片。對于可注射的制劑，藥學組合物可配制成單位劑型，比如多劑量容器或作為單劑量劑型的安瓿。藥學組合物也可配制成溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊和長效制劑。
[0077]另一方面，適于藥學制劑的載體、賦形劑和稀釋劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、金合歡膠、藻酸鹽、凝膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，藥學制劑可進一步包括填料、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料和消毒劑。
[0078]在仍另一方面中，本發明提供了治療血友病的方法，包括向具有血友病的對象施用治療有效量的包括衍生物、綴合物、或復合體作為活性成分的用于預防或治療血友病的藥學組合物。就此而言，藥學組合物可單獨施用或與其它治療試劑同時或相繼組合施用。
[0079]如本文所使用，術語施用意思是通過某種適合的方法將預定量的物質引入患者。組合物可經任何常規路徑施用，只要它能夠到達期望的組織?？紤]多種施用方式，包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內，但是本發明不限于這些示例性施用方式。但是，由于肽當口服施用時被消化，用于口服施用的組合物的活性成分應被包衣或被配制以防止在胃中降解。優選地，多聚體可以以可注射的形式施用。另外，藥學組合物可使用能夠將活性成分輸送至靶細胞內的某種裝置施用。
[0080]進一步，本發明的藥學組合物可通過若干相關的因素確定，所述因素包括待治療的疾病的類型、施用路徑、患者的年齡、性別、體重和疾病嚴重性，以及通過用作活化組分的藥物的類型。
[0081]本發明的藥學組合物顯示卓越的體內效果和效價的持續時間，從而顯著減少施用其用于預防或治療血友病或用于促進血液凝結的數量和頻率。
[0082]【具體實施方式】
[0083]下文，將參考實施例更詳細地描述本發明。但是，這些實施例僅僅為了說明性的目的，并且本發明不旨在被這些實施例限制。
[0084]實施例1:制各包含Fac VII某閔的表汰載體
[0085]首先，使用聚合酶鏈式反應(PCR)技術獲得包含信號序列的人因子VII基因。為了擴增因子vn (Fac W )基因，將人胎兒肝臟cDNA庫(TAKARA BIO USA)用作模板，并且使用下列SEQ ID NOs.1和2的正向和反向引物進行PCR(95°C I分鐘變性；30個循環(95°C 30秒，60°C 30秒和68°C 90秒)；68°C 5分鐘)。此時，為了方便克隆，將限制酶BamHI的識別位點插入SEQ ID N0.1的引物和限制酶XhoI的識別位點插入SEQ ID N0.2的引物。隨后，檢查通過PCR獲得的約1.3kb的PCR產物的核苷酸序列(SEQ ID NOs.3和4)。
[0086]VII BHISS F:5’_cccggatccatggtctcccaggccctcaggctcc_3’ (SEQ ID N0.1)
[0087]VII XhoIAS R:5’-gggctcgagctagggaaatggggctcgcagg-3’ (SEQ ID N0.2)
[0088]為了在CMV啟動子的控制下表達獲得的PCR產物，將它克隆進入動物細胞表達載體pXOGC。該pXOGC載體是包括去除一個或更多個CCGCCC重復序列的DHFR啟動子和可操作地連接至其的編碼DHFR的核苷酸序列的表達載體(韓國專利號880509)。具體地，該PCR產物用限制酶，BamHI和XhoI在37°C下消化2小時，并且施加至PCR純化試劑盒(Qiagen，USA)從而獲得切割的DNA片段。將DNA片段與用限制酶BamHI和XhoI處理的pXOGC載體混合，并使用T4DNA連接酶克隆，從而制備包括Fac VII基因的表達載體。
[0089]實施例2:制備用于表達各種重組Fac VH衍生物的表達載體
[0090]實施例1中制備的包含Fac VII基因的表達載體(pX0GC_F W )用于獲得編碼在Fac VII的C-末端具有SODl的部分序列(超氧化物歧化酶1，SEQ ID N0.30)的Fac VII衍生物的多核苷酸，并且制備能夠表達衍生物的表達載體。
[0091 ] 實施例2-1:制備表達重組Fac VII衍生物的載體，pXOGC-F W -ATKAVC
[0092]制備表達重組Fac VII衍生物的載體pX0GC_F W -ATKAVC，其包含多核苷酸，所述多核苷酸進一步具有編碼在實施例1制備的表達載體pXOGC-F YD中包括的Fac VII基因的3’-末端處的SODl序列從I至6的序列的多核苷酸。詳細地，表達載體pXOGC-F YD用作模板，并且使用下列SEQ ID NOs.6和7的正向和反向引物進行PCR (95°C I分鐘變性；30個循環(95°C 60秒，60°C 60秒和68°C 90秒)；68°C 5分鐘)。此時，為了方便克隆，將限制酶EcoRI的識別位點插入SEQ ID N0.6的引物和將限制酶XhoI的識別位點插入SEQ ID N0.7的引物。隨后，檢查通過PCR獲得的約1.4kb的PCR產物的核苷酸序列(SEQ ID N0.8)。
[0093]FVII EcoRISS F (SEQ ID N0.6):
[0094]5' -ccggaattcatggccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggc-3'
[0095]F W SlXhoIAS R (SEQ ID N0.7):
[0096]5' -ccgctcgagtcagcacacggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggaggactcctgggc-3'
[0097]為了在CMV啟動子的控制下表達獲得的PCR產物，將它克隆進入動物細胞表達載體pXOGC。具體地，該PCR產物用限制酶，EcoRI和XhoI在37°C下消化2小時，并且施加至PCR純化試劑盒從而獲得切割的DNA片段。將DNA片段與用限制酶EcoRI和XhoI處理的pXOGC載體混合并使用T4DNA連接酶克隆，從而制備具有編碼Fac VII衍生物的多核苷酸的表達載體(pXOGC-F W -ATKAVC)，其包含編碼在Fac VII基因的3’ -末端連接的SODl序列從I至6的序列ATKAVC (SEQ ID N0.5)的多核苷酸。
[0098]實施例2-2:制備表達重組Fac VII衍生物的載體，pXOGC-F W -GGGGSC
[0099]制備表達重組Fac VII衍生物的載體pXOGC_F W -GGGGSC，其包含多核苷酸，所述多核苷酸進一步具有編碼在實施例1中制備的表達載體pXOGC-F VII中包括的Fac VII基因的3’ -末端處的6個氨基酸(GGGGSC，SEQ ID N0.10)的多核苷酸。為了實現此，以與在實施例2-1中相同的方式進行PCR，除了用SEQ ID NOs.6和11的正向和反向引物，并且檢查約
1.4kb的PCR產物的核苷酸序列(SEQ ID N0.12)。隨后，以與在實施例2-1中相同的方式制備表達載體(pXOGC-F W -GGGGSC)，不同之處是使用PCR產物，該表達載體包含在Fac W基因的3’-末端具有編碼GGGGSC (SEQ ID N0.10)的多核苷酸的編碼Fac VII衍生物的多核苷酸。
[0100]F vn #2XhoIAS R (SEQ ID N0.11):
[0101]5' -ccgctcgagtcagcaggagccgccgccgccgggaaatggggctcgcaggaggactcctgggc-3'
[0102]實施例2-3:制備表達重組Fac YD衍生物的載體，pXOGC-F W -SODlL149
[0103]制備表達重組Fac YD衍生物的載體pXOGC-F YD-SODl 1-149，其包含多核苷酸(SEQID N0.15)，所述多核苷 酸進一步具有編碼在實施例1中制備的表達載體pXOGC-F VII中包括的Fac VII基因的3’ -末端處的SODl (超氧化物歧化酶I)序列I至149的氨基酸的多核苷酸。
[0104]詳細地，將Fac VIIDNA序列(SEQ ID N0.3)用作模板，并且使用Fac VII正向引物(SEQ ID N0.16)和Fac VII反向引物(SEQ ID N0.17)進行PCR(95°C I分鐘變性;30個循環(950C 60秒，60°C 60秒和68°C 90秒)；68°C 5分鐘)。此時，為了方便克隆，將限制酶EcoRI的識別位點插入SEQ ID N0.16的引物和SODl的5’-末端的部分序列包含在SEQ ID N0.17的引物中。結果，獲得第一 PCR片段。
[0105]F VII EcoRISS F:5’_ccggaattcatggtctcccaggccctcaggctcc_3’ (SEQ ID N0.16)
[0106]F W SODInfAS R:5’_cggccttcgtcgcgggaaatggggctcgcaggag_3’ (SEQ ID N0.17)
[0107]接下來，將S0DlcDNA(RC200725，OriGene, USA)用作模板，并且使用SODl正向引物(SEQ ID N0.18)和SODl反向引物(SEQ ID N0.19)進行PCR(95°C I分鐘變性;30個循環(95°C 60秒，60°C 60秒和68°C 40秒);68°C 5分鐘)。此時，為了方便克隆，Fac VII的3’ -末端的部分序列包含在SEQ ID N0.18的引物中和將限制酶XhoI的識別位點插入SEQID N0.19的引物中。結果，獲得第二 PCR片段。
[0108]F VII SODInfSS F:5’-gagccccatttcccgcgacgaaggccgtgtgcgt-3’ (SEQ ID N0.18)
[0109]SODXhoIAS R:5，_ccgctcgagtcaaattacaccacaagccaaacga_3，(SEQ ID N0.19)
[0110]將如此獲得的第一和第二 PCR片段用作模板和使用Fac YD正向引物(SEQ IDN0.16)和SODl反向引物(SEQ ID N0.19)進行第二 PCR。最終，獲得第三PCR片段(95°C I分鐘變性；30個循環(950C 60 #, 600C 60秒和68°C 120秒)；68°C 5分鐘)。
[0111]為了在CMV啟動子的控制下表達獲得的第三PCR產物，將它克隆進入動物細胞表達載體pXOGC。具體地，第三PCR產物用限制酶，EcoRI和XhoI在37°C下消化2小時，并且施加至PCR純化試劑盒從而獲得切割的DNA片段。將該DNA片段與用限制酶EcoRI和XhoI處理的pXOGC載體混合并使用T4DNA連接酶克隆，從而制備具有編碼Fac VII衍生物的多核苷酸的表達載體(pXOGC-F W -SODl 1-149)，其包含編碼在Fac VII基因的3’-末端處連接的SODl序列從I至149的氨基酸的多核苷酸。
[0112]實施例2-4:制備表達重組Fac VII衍生物的載體，pXOGC-F W -SODlIPRI
[0113]旨在將Fac VII的自切割位點插入在實施例2-3中制備的表達載體pXOGC-F W-SOD11-149中包括的SODl基因。為了實現此，制備表達重組Fac VII衍生物的載體pXOGC-F YD-SODlIPRI，其包含編碼氨基酸序列(SEQ ID N0.20)的多核苷酸(SEQ IDN0.21)，所述氨基酸序列通過將用 IPRI 替換 FacVD-SODl 1-149 (SEQ ID N0.14)的 451-454氨基酸中的SODl的7至10氨基酸(VLKG)突變的SODl的1-149氨基酸連接至Fac VII的C-末端制備。
[0114]詳細地,將實施例2-3中獲得的第三PCR片段用作模板和使用正向和反向引物(SEQ ID NOs.22和23)進行PCR。最終，獲得第四PCR片段(95°C 30秒變性；18個循環(950C 30 秒，55V 60 秒和 68°C 9 分鐘)；68°C 9 分鐘)。
[0115]檢測約9kb的第四PCR產物的核苷酸序列(SEQ ID N0.21)。
[0116]vn SODlmutSS F: (SEQ ID N0.22)
[0117]5' -cccgcgacgaaggccgtgtgcattccgaggatcgacggcccagtgcagggcatc-3'
[0118]F W SODlmutAS R: (SEQ ID N0.23)
[0119]5' -gatgccctgcactgggccgtcgatcctcggaatgcacacggccttcgtcgcggg-3'
[0120]隨后，將第四PCR產物用限制酶DpnI在37°C下消化I小時以切割非突變的序列，并且通過轉化克隆進入大腸桿菌，從而制備表達載體(pXOGC-F YD -SODlIPRI)，其包含編碼在Fac VII的C-末端處具有突變SODl的1-149的氨基酸的Fac VII衍生物的多核苷酸。
[0121]實施例2-5:制備表達重組Fac VII衍生物的載體，pXOGC-F W -SODlL25IPRI
[0122] 制備表達重組Fac VII衍生物的載體pX0GC_F W -S0D11-25IPRI，其包含編碼氨基酸序列(SEQ ID N0.24)的多核苷酸(SEQ ID N0.25)，所述氨基酸序列通過將用IPRI替換SODl的7至10氨基酸(VLKG)突變的SODl的1_25氨基酸連接至Fac VII的C-末端制備。
[0123]詳細地，將實施例2-4中制備的表達載體pXOGC-F W -S0D1IPRI用作模板，并且使用正向和反向引物(SEQ ID NOs.16和26)進行PCR(95°C I分鐘變性；30個循環(95°C 60秒，60°C 60秒和68°C 90秒)；68°C 5分鐘)。最終，獲得第五PCR片段。
[0124]S0Dl_25XhoIAS R:5，_ccgctcgagtcaactttccttctgctcgaaattg_3，(SEQ IDN0.26)
[0125]隨后，將第五PCR產物用限制酶EcoRI和XhoI在37°C下消化2小時，并且施加至PCR純化試劑盒從而獲得切割的DNA片段。將該DNA片段與用限制酶EcoRI和XhoI處理的pXOGC載體混合并使用T4DNA連接酶克隆，從而制備表達載體(pXOGC-F YD-SODl 1-25IPRI)，其包含編碼在Fac VII基因的C-末端處連接的具有突變SODl序列的I至25的氨基酸的Fac VII衍生物的多核苷酸。
[0126]實施例2-6:制備表達重組Fac VII衍生物的載體，pXOGC-F W -SODl 1-90IPRI
[0127]制備重組Fac VII衍生物表達載體pX0GC_F W -SODl 1-90IPRI，其包含編碼氨基酸序列(SEQ ID N0.27)的多核苷酸(SEQ ID N0.28)，所述氨基酸序列通過將用IPRI替換SODl的7至10氨基酸(VLKG)突變的SODl的1_90的氨基酸連接至Fac VII的C-末端制備。
[0128]詳細地，將實施例2-4中制備的表達載體pXOGC-F W -SODlIPRI用作模板，并且使用正向和反向引物(SEQ ID NOs.16和29)進行PCR(95°C I分鐘變性；30個循環(95°C 60秒，60°C 60秒和68°C 100秒)；68°C 5分鐘)。最終，獲得第五PCR片段。
[0129] S0Dl_90XhoIAS R:5，_ccgctcgagtcagtcagcagtcacattgcccaag_3，(SEQ IDN0.29)
[0130]隨后，將第五PCR產物用限制酶EcoRI和XhoI在37°C下消化2小時，并且施加至PCR純化試劑盒從而獲得切割的DNA片段。將該DNA片段與用限制酶EcoRI和XhoI處理的pXOGC載體混合并使用T4DNA連接酶克隆，從而制備表達載體(pXOGC-F YD-SODl 1-90IPRI)，其包含編碼在Fac YD基因的C-末端處連接的具有突變SODl序列的I至90的氨基酸的Fac VII衍生物的多核苷酸。
[0131]實施例3:Fac VII衍牛物的表汰
[0132]使用實施例2中制備的每種表達載體表達多種Fac VII衍生物。
[0133]實施例3-1:Fac VII衍生物在293F細胞系中的表達
[0134]在FacVD的C-末端沒有任何核苷酸的表達載體(對照)，以及表達載體(pXOGC-F W -S0D11-149、pXOGC-F W -SODl 1-25IPR1、pXOGC-F W -SODl 1-90IPR1、pXOGC-F W -ATKAVC或pXOGC-F W -GGGGSC)，其每個表達載體具有通過在Fac YD的C-末端融合SODl 1-149序列、突變SODl 1-25序列、突變SODl 1_90序列、SODl 1_6序列或GGGGSC序列制備的多核苷酸，被引入Freestyle?293F細胞系(Invitrogen,目錄號R79007)以制備每種轉化體。從每種轉化體表達不同的Fac VII衍生物。
[0135]為了實現此，在293F細胞在37°C和8% CO2下，以120rpm或更高的速度搖動培養時，293F細胞系每隔一天傳代培養。當培養細胞的數目達到IOX IO5個細胞/ml和活力為85%或更高時，將在實施例2中制備的每種表達載體引入至其，從而獲得轉化體。詳細地，將500 μ lFreestyle? max試劑,500 μ g每種表達載體，以及IOml的0ptipro?SFM (Invitrogen,目錄號 12309-050)添加至 500ml 的具有 10 X IO5 個細胞/ml 的細胞的Freestyle?293表達培養基(Invitrogen，目錄號12338-018)中，和混合并在室溫下靜置10分鐘，用于將每種表達載體引入293F細胞系。此后，將對于Fac VII活化必須的50 μ g的維生素K添加至其中，并且在37°C和8% CO2下，以120rpm或更高的速度搖動培養3天。在培養完成后，在3000rpm下離心細胞5分鐘以獲得上清液。收集和純化上清液中包括的每種Fac VII衍生物。隨后，使用抗Fac VII的抗體進行蛋白質印記以檢測每種表達的Fac W衍生物(圖1a至Ic)。
[0136]圖1a是顯示在293F細胞系中表達的Fac YD -ATKAVC的蛋白質印記分析的結果的照片，其中M是尺寸標識(預染的蛋白質梯，fermentas)，泳道I是在還原條件下Fac W -ATKAVC的蛋白質印記分析的結果，和泳道2是在非還原條件Fac W -ATKAVC的蛋白質印記分析的結果。如圖1a中所顯示，在非還原條件下檢測到約20至30%的二聚體形式，并且在還原條件下沒有檢測到二聚體形式。
[0137]進一步，圖1b是顯示在293F細胞系中表達的對照組和Fac W -GGGGSC的蛋白質印記分析結果的照片，并且圖1c是顯示示出在293F細胞系中表達的Fac W -ATKAVC和Fac VD -SODl 1-149的分子量差異的蛋白質印記分析結果的照片。
[0138]如圖1b和Ic中顯示，發現多種Fac VII衍生物可正常地在293F細胞系中產生。
[0139]實施例3-2:Fac VII衍生物(pX0GC_F W -ATKAVC)在CHO細胞系中的表達
[0140]將在實施例2-1中制備的表達載體pXOGC-F W -ATKAVC引入至缺少DHFR顯示不完全 DNA 合成的 DG44/CH0 細胞系(CH0/dhfr_)中(Urlaub 等，Somat.Cell.Mol.Genet.，12，555-566，1986)，以獲得轉化體，并且從該轉化體表達Fac W -ATKAVC衍生物。
[0141]詳細地，培養DG44/CH0細胞系以達到80至90 %匯合，并且將細胞用Opt1-MEM(Gibco，目錄號 51985034)沖洗 3 次。
[0142]另一方面，將3ml的Opt1-MEM和5 μ g的表達載體pXOGC-F W -ATKAVC的混合物，以及 3ml 的 Opt1-MEM和 20 μ I 的 lipofectamine (Gibco，目錄號 18324-012)的混合物分別在室溫下靜置30分鐘。隨后，混合該混合物，并且添加至培養的DG44/CH0細胞系中。然后，將細胞在37°C和5% CO2下培養約18小時，導致表達載體pXOGC-F YD-ATKAVC引入至DG44/CHO細胞系中。隨后，將培養的細胞用補充10%?83的01^1^12(6讓(30，目錄號11330)沖洗3次，并且然后將培養基添加至其，接著培養48小時。通過胰蛋白酶處理分開培養的細胞，并且它們被接種至包含10% FBS和lmg/ml的G418 (Cellgro，目錄號61-234-RG)的MEM-α培養基(WELGENE，目錄號LM008-02))而沒有選擇培養基(HT補充(次黃嘌呤-胸苷))。直到轉化的細胞存活形成集落，每隔2天或3天用選擇培養基替代該培養基。因此，從分離的細胞選擇轉化的細胞。此時，為了增加Fac W -ATKAVC衍生物在選擇的轉化細胞中的表達水平，將IOnM MTX(Sigma,目錄號M8407)添加至選擇培養基以逐漸增加濃度，并且2至3周后，MTX的含量增加至 30nM。
[0143]此外，為了降低轉化細胞的異質性，進行有限稀釋法以獲得單一克隆。詳細地，將轉化細胞稀釋至96-孔板的每個孔中的0.7個細胞的比例，并且培養2至3周以檢測是否觀察到單一克隆。當在孔中觀察到單一克隆的聚簇形成時，將該單一克隆轉移至24-孔板，并且通過ELISA分析每個克隆的細胞生長速率和Fac VII衍生物的表達水平，從而選擇顯示最高表達水平的Fac VII衍生物的克隆。將它命名為“HMF709”，并且于2011年9月23日保藏在韓國生物科學與生物技術研究所，韓國典型菌種保藏中心(IIIGwahangno, Yuseong-gu,Daejeon, Korea)，編號為 “KCTC12022BP”。
[0144]實施例4:Fac Vn -ATKAVC 的鈍化
[0145]培養在實施例3-2中制備的轉化體以表達Fac VD-ATKAVC，并且將培養液在3000rpm下離心5分鐘以獲得上清液。
[0146]使用0.2 μ m微孔過濾膜過濾該上清液，將0.6M硫酸銨添加至其，并且將該混合物施加至丁基HP柱。使用包含0.6-0M硫酸銨的濃度梯度的緩沖溶液(20mM Tris-HCl pH7.5)進行洗脫，以獲得包含Fac W -ATKAVC的活性餾分。
[0147]用IOmM磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)替代獲得的活性餾分的緩沖溶液，將其施加至Heparin HP柱并且使用0-1.0M NaCl濃度梯度緩沖溶液(IOmM磷酸鈉，pH7.0)洗脫，從而獲得包含Fac W -ATKAVC的活性餾分。
[0148]濃縮活性懼分并且施加至Superdex75柱，然后使用150mM NaC120mMTris-HCl (pH7.5)緩沖溶液洗脫，從而獲得包含Fac W -ATKAVC的活性餾分。用2mM苯甲脒20mM Tris-HCl (pH7.5)緩沖溶液替代獲得的活性餾分的緩沖溶液，將其施加至Q FF柱。然后，進行沖洗(2mM苯甲脒0.2M NaCl20mM Tris-HCl (pH8.0)緩沖液)，再平衡(2mM苯甲脒
0.1M NaCl20mM Tris-HCl (pH8.0)緩沖液)，和濃度-梯度洗脫(2mM苯甲脒 25mM NaCl35mMCaCl2, 20mM Tris-HCl (ρΗ8.0)緩沖液)，以純化 Fac W -ATKAVC。
[0149]通過SDS PAGE檢測純化的Fac W -ATKAVC的純度(圖2)。圖2是顯示純化的Fac W -ATKAVC的電泳結果的照片，其中M是尺寸標識，泳道I是在還原條件下的Fac VII I，泳道2是在還原條件下的Fac W -ATKAVC,泳道3是在非還原條件下的Fac VL以及泳道4是在非還原條件下的Fac VD -ATKAVC。
[0150]實施例5:制各Fac W -ATKAVC和PEG的綴合物 [0151 ] 實施例4中純化的Fac W -ATKAVC與具有不同的分子量的PEG綴合以制備綴合物。
[0152]實施例5-1:制備 Fac W _ATKAVC_40kDa PEG 綴合物
[0153]為了Fac YD -ATKAVC 的 C-末端用 40kDa mPEG-馬來酰亞胺(NOF，Japan)聚乙二醇化，在存在IOOmM磷酸鹽緩沖溶液(pH5.5)的情況下將Fac YD-ATKAVC (lmg/ml)和40kDamPEG-馬來酰亞胺以1:20的摩爾比混合，將還原劑——2mM三芳基膦添加至其，并且在25°C下反應2小時。結果，制備了單聚乙二醇化的Fac VD -ATKAVC(Fac W _ATKAVC_40k PEG綴合物)(圖3)。圖3是顯示Fac W -ATKAVC和PEG的綴合物的電泳結果的照片，其中M是尺寸標識，泳道I是在非還原條件下的Fac VD -ATKAVC-40kDa PEG綴合物，和泳道2是在非還原條件下的Fac VD -ATKAVC-5kDa PEG綴合物。
[0154]實施例5-2:制備 Fac W _ATKAVC_5kDa PEG 綴合物
[0155]以與實施例5-1相同的方式進行Fac W -ATKAVC的C-末端用醛_5kDa PEG-馬來酰亞胺(NOF，Japan)聚乙二醇化，不同之處是使用醛_5kDa PEG-馬來酰亞胺代替40kDamPEG-馬來酰亞胺，從而制備聚乙二醇化的Fac W -ATKAVC (Fac W _ATKAVC_5kDa PEG綴合物)(圖3)。
[0156]實施例5-3:制備 Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc 復合體
[0157]為了將馬來酰亞胺-1OkDa PEG-醛(NOF，Japan)的醛反應性基團連接至免疫球蛋白Fe區域的N-末端，在存在IOOmM磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)的情況下將免疫球蛋白Fe區域和馬來酰亞胺-1OkDa PEG-醛以1:1的摩爾比混合，并且在蛋白質濃度為10mg/ml的條件下添加還原劑——20mM Na-CNBH3。該混合物在低溫(4~8°C )下反應2小時。為了獲得單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe區域(馬來酰亞胺-1OkDa PEG-Fc)，使用Sourcel5Q進行陽離子交換色譜，并且在20mM Tris緩沖溶液(pH7.5)中使用氯化鈉濃度梯度進行洗脫。
[0158]另一方面，FacVD-ATKAVC的C-末端在IOmM Glycil-甘氨酸緩沖溶液(pH5.5)中使用還原劑——0.5~2mM三苯基膦-3，3’，3’ ’ -三磺酸三鈉鹽水合物——在室溫下還原2小時。
[0159]將C-末端-還原的Fac W -ATKAVC和單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe區域(馬來酰亞胺-1OkDa PEG-Fc)以1:4~1:20的摩爾比混合，并且在I~2mg/ml的總蛋白質濃度下、存在50mM Tris緩沖溶液(pH7.5)的情況下在室溫下反應2小時。首先，使用Sourcel5Q進行陽離子交換色譜，并且在20mM Tris緩沖溶液(pH7.5)中使用氯化鈉濃度梯度洗脫Fac W -ATKAVC-1Ok PEG-Fc 復合體。
[0160]為了活化Fac VD -ATKAVC-PEG-Fc復合體中的Fac VL在低溫(4~8°C )下基于Fac VII以約4mg/ml在0.1M Tris-HCl緩沖溶液(ρΗ8.0)中進行溶液反應18小時。[0161]使用Superdex200和IOmM Glycil-甘氨酸緩沖溶液(ρΗ5.5)進行體積排阻色譜，從而純化最終的Fac VD a-ATKAVC-PEG-Fc。
[0162]通過SDS PAGE和蛋白質印記檢測純化的Fac W a_ATKAVC-PEG_Fc的純度(圖4)。圖4a是顯示純化的Fac W a_ATKAVC-PEG_Fc綴合物的電泳結果的照片，其中M是尺寸標識，泳道I是在還原條件下的Fac VD a-ATKAVC-PEG-Fc，以及泳道2是在非還原條件下的Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc ο圖4b是顯示純化的Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc的蛋白質印記分析結果的照片，其中泳道I是在還原條件下的Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc,以及泳道2是在非還原條件下的 Fac W a-ATKAVC-PEG-Fc ο
[0163]實施例6:Fac VII和 Fac W -ATKAVC 的體外活件(ECfJ
[0164]為了測定Fac VII和Fac W -ATKAVC的體外活性，使用商業試劑盒(Chromogenix,C0ASET)進行顯色測定。根據 European Pharmacopoeia “2.7.10.ASSAY OF HUMANCOAGULATION FACTOR VT 進行活性試驗。
[0165]稀釋的Fac YD和Fac W -ATKAVC通過促凝血酶原激酶和Ca2+離子被活化。通過活化的Fac YD a和Fac W a-ATKAVC將FX活化為FXa，并且通過活化的FXa，將底物S-2765 (N-a-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)水解和解離成肽和發色基團pNA。監測解離的pNA在405nm處的吸光度，以測定Fac YD a和Fac W a-ATKAVC的體外活性。
[0166]使用Softmax Pro4.0程序的4_參數模型通過回歸分析檢測根據Fac VII和Fac W -ATKAVC濃度的吸光度變化，并且使用獲得的EC5tl值比較兩種物質之間的活性。
[0167]試驗結果(圖5和表1)顯示了 Fac W -ATKAVC的體外活性顯示相當于或高于天然Fac VII的效價。
[0168]【表1】
[0169]在Fac VII 和 Fac VI1-ATKAVC 之間的 EC5tl 比較
[0170]
【權利要求】
1.Fac Vn或其活性形式Fac W a的衍生物，其包括凝血因子YD (因子VI1、Fac W )的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)和連接在其C-末端的肽接頭。
2.根據權利要求1所述的衍生物，其中所述肽接頭的所述C-末端氨基酸殘基是半胱氨酸。
3.根據權利要求1所述的衍生物，其中所述肽接頭是SODl(超氧化物歧化酶)的部分序列。
4.根據權利要求3所述的衍生物，其中所述SODl的部分序列通過用自切割位點序列IPRI (異亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-異亮氨酸)替換序列中的VLKG (纈氨酸-亮氨酸-賴氨酸-甘氨酸)突變。
5.根據權利要求1所述的衍生物，其中所述衍生物由選自下述的氨基酸序列組成:SEQID NOs.9、13、14、20、24 和 27。
6.一種多核苷酸，其編碼權利要求1至5任一項所述的Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物。
7.根據權利要求6所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由選自下述的核苷酸序列組成:SEQ ID NOs.8、12、15、21、25 和 28。
8.—種表達載體,其包括權利要求6所述的多核苷酸。
9.根據權利要求8所述的表達載體，其中所述載體選自pXOGC-FYD -ATKAVC、pXOGC-F W -GGGGSC、pXOGC-F W -SOD 11-1 49、pX0GC_F W -SODlIPRI,pXOGC-F W -S0D11-25IPRI 和 pXOGC-F W -SODl1-90IPRI。
10.一種轉化體,其包括權利要求8所述的表達載體。
11.根據權利要求10所述的轉化體，其中所述轉化體由獲取號KCTC12022BP識別。
12.制備FacVII衍生物的方法，其包括下述步驟: (i)培養權利要求10所述的轉化體從而獲得培養液；和 (?)從所述培養液回收所述FacVD衍生物。
13.根據權利要求12所述的方法，進一步包括活化所回收的FacVII衍生物的步驟。
14.一種Fac VII或其活性形式Fac W a的綴合物，其中將能夠延長血液半衰期的非肽基聚合物連接至權利要求1至5任一項所述的Fac VII或其活性形式Fac W a的衍生物的所述妝接頭。
15.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述非肽基聚合物連接至所述FacVII或其活性形式Fac W a的衍生物的所述C-末端。
16.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述非肽基聚合物具有一種或更多種選自下述的反應性基團:醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基團、鄰位吡啶基二硫化物、硫氫和琥珀酰亞胺衍生物。
17.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物是丙酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基羧甲基、羥基琥珀酰亞胺基或碳酸琥珀酰亞胺酯。
18.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述非肽基聚合物具有兩個或三個反應性末端。
19.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述非肽基聚合物在兩端分別具有馬來酰亞胺反應性基團或醛反應性基團。
20.根據權利要求14所述的綴合物，其中所述非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇非肽基共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂質非肽基聚合物、幾丁質、透明質酸和其組合。
21.—種Fac VII或其活性形式Fac W a的復合體，其由經非肽基聚合物連接至免疫球蛋白Fe區域的權利要求1至5任一項所述的Fac VII或Fac W a衍生物組成。
22.根據權利要求21所述的復合體，其中所述非肽基聚合物選自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸和其組合。
23.根據權利要求21所述的復合體，其中所述非肽基聚合物具有一個、兩個或三個反應性末端。
24.根據權利要求21所述的復合體，其中所述非肽基聚合物在兩端分別具有馬來酰亞胺反應性基團或醛反應性基團。
25.根據權利要求21所述的復合體，其中所述免疫球蛋白Fe區域由選自下述的一種至四種結構域組成:CH1、CH2、CH3和CH4結構域。
26.根據權利要求21所述的復合體，其中所述免疫球蛋白Fe區域進一步包括鉸鏈區域。
27.根據權利要求21所述的復合體，其中所述免疫球蛋白Fe區域源自IgG、IgA、IgD、IgE 或 IgM0
28.根據權利要求21所述的復合體，其中所述免疫球蛋白Fe區域是IgG4Fc區域。
29.根據權利要求21所述的復合體，其中所述免疫球蛋白Fe區域是人去糖基化IgG4Fc 區域。
30.制備FacW a復合體的方法，其包括下述步驟: (i)在PH5.0~pH9.0下，共價連接在其一端具有琥珀酰亞胺衍生物或醛反應性基團的非肽基聚合物至免疫球蛋白Fe的胺基； (?)從步驟(i)的反應混合物回收綴合物，其包括與所述非肽基聚合物在所述胺基處共價連接的所述免疫球蛋白Fe區域； (iii)共價連接權利要求1至5任一項所述的FacVII衍生物的C-末端硫氫基團至回收的綴合物中所述非肽基聚合物的另一端，從而產生在所述非肽基聚合物的每個端具有所述免疫球蛋白Fe區域和所述Fac VII衍生物的Fac VII復合體；和 (iv)活化步驟(iii)中產生的所述FacVD復合體，從而產生具有經所述非肽基聚合物連接的Fac W a和所述免疫球蛋白Fe區域的Fac W a復合體。
31.一種用于制備Fac W a復合體的方法，包括下述步驟: (i)在PH5.0~pH9.0下，共價連接在其一端具有琥珀酰亞胺衍生物或醛反應性基團的非肽基聚合物至免疫球蛋白Fe的胺基； (?)從步驟(i) 的反應混合物回收綴合物，其包括與所述非肽基聚合物在所述胺基處共價連接的所述免疫球蛋白Fe區域；和 (iii)共價連接權利要求1至5任一項所述的Fac W a衍生物的C-末端硫氫基團至回收的綴合物中所述非肽基聚合物的另一端，從而產生在所述非肽基聚合物的每個端具有所述免疫球蛋白Fe區域和所述Fac W a衍生物的Fac W a復合體。
32.制備FacYD a綴合物的方法，其包括下述步驟: (i)共價連接具有反應性基團的非肽基聚合物至權利要求1至5任一項所述的Fac W衍生物的C-末端硫氫基團，所述反應性基團選自:醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基團、鄰位吡啶基二硫化物、硫氫和琥珀酰亞胺衍生物； (?)回收通過共價連接所述非肽基聚合物至所述Fac VII衍生物制備的Fac VII綴合物；和 (iii)活化所回收的Fac VII綴合物，從而產生具有連接至所述Fac W a區域的所述非肽基聚合物的Fac VD a綴合物。
33.制備FacVDa綴合物的方法，其包括下述步驟: (I)共價連接具有反應性基團的非肽基聚合物至權利要求1至5任一項所述的Fac W a衍生物的所述C-末端硫氫基團，所述反應性基團選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基團、鄰位吡啶基二硫化物、硫氫和琥珀酰亞胺衍生物；和 (?)回收通過共價連接所述非肽基聚合物至所述Fac W a衍生物制備的所述Fac W a綴合物。
34.—種Fac W a復合體,其由連接至權利要求32或33所述的回收的Fac YD a綴合物中所述非肽基聚合物另一端的免疫球蛋白Fe區域組成。
35.根據權利要求30至33任一項所述的方法，其中所述FacVII衍生物、Fac VII綴合物或Fac VII復合體的活化通過柱上活化或溶液中活化進行。
36.根據權利要求30至33任一項所述的方法，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
37.一種Fac W a綴合物或Fac W a復合體,其通過權利要求30至33任一項所述的方法制備。
38.一種Fac VII或其活性形式Fac W a的復合體，其由經非肽基聚合物連接載體的Fac VII衍生物或Fac W a衍生物組成，所述非肽基聚合物選自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸和其組合。
39.根據權利要求14所述的復合體，其中構成所述FacVII綴合物或Fac W a綴合物的所述非肽基聚合物的一端連接至選自抗體、白蛋白、和轉鐵蛋白的載體。
40.根據權利要求38所述的復合體，其中所述載體選自抗體、白蛋白和轉鐵蛋白。
41.根據權利要求38所述的復合體，其中所述非肽基聚合物具有一個、兩個或三個反應性末端。
42.根據權利要求38所述的復合體，其中所述非肽基聚合物在兩端分別具有馬來酰亞胺反應性基團或醛反應性基團。
43.用于預防或治療血友病的藥學組合物，其包括作為活性成分的權利要求1至5任一項所述的Fac VII衍生物或Fac W a衍生物、權利要求14至20任一項所述的Fac VII綴合物或Fac W a綴合物、權利要求21至29任一項所述的Fac VII復合體或Fac W a復合體或權利要求37所述的Fac W a綴合物或Fac W a復合體。
44.用于促進血液凝結的藥學組合物，其包括作為活性成分的權利要求1至5任一項所述的Fac VII衍生物或Fac W a衍生物、權利要求14至20任一項所述的Fac VII綴合物或Fac W a綴合物、權利要求21至29任一項所述的Fac VII復合體或Fac W a復合體或權利要求37所述的Fac VII a綴合物或Fac W a復合體。
45.用于預防或治療血友病的方法，其包括向對象施用治療有效量的權利要求43所述的用于預防或治療血友病的藥學組合物的步驟。
46.用于 促進血液凝結的方法，其包括向對象施用治療有效量的權利要求44所述的用于促進血液凝結的藥學組合物的步驟。
【文檔編號】A61K38/36GK103974716SQ201280060378
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年10月5日 優先權日:2011年10月6日
【發明者】金大振, 李炳善, 洪性煥, 許容豪, 鄭圣燁, 權世昌 申請人:韓美科學株式會社