專利名稱：一種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥附子領域，具體涉及一種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝。
背景技術：
附子為毛莨科植物烏頭(Aconi turn carmichaeli Debx)的子根,性微辛、大熱、有毒，歸心、腎、脾經，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效，被譽為“回陽救逆第一品藥”。前人稱其為藥中之圣藥，用于急、危、重癥，多能力挽狂瀾；施于慢性頑病痼疾，亦能起沉疴于須臾。附子的特有功效使其一直廣泛應用于臨床。然而，該植物全株有毒，以根頭最毒。附子的毒性成份為烏頭堿(Aconitine)，能溶于水與乙醇，毒性極大，人口服0.2mg烏頭堿即可發生中毒反應，3 5mg即能致死，故在《神農本草經》中列為下品。附子的“毒”和“效”是并存的，有毒性的一面，又有治療功效的一面，用之不當可發生毒副作用，而正確使用又往往產生速效、高效，治療很多危難重癥，故一些醫家稱為虎狼之藥而不敢使用，但一些名醫則稱其為特效藥，頑癥痼疾多能應手取效。東漢張仲景用生附子I枚，炮附子I 3枚，約合15g到60g不等。近代老中醫吳佩衡、劉民叔、李繼昌用附子量亦大，一般均在30g以上。吳佩衡甚至單劑用量500g，無毒副反應，相反療效顯著。但是，據報道，有人曾服附子9g而中毒。因此，附子的臨床應用始終存在潛在風險，附子毒性是臨床首要解決的問題?，F代藥理研究表明，附子具有抗炎、鎮痛、調節免疫等作用，在骨科臨床常用于治療關節炎、頸椎病、腰椎間盤突出癥、肩周炎、強直性脊柱炎等疾病，藥效顯著。附子的毒性與藥效成分緊密相關，其物質基礎主要是二萜雙酯類生物堿，包括烏頭堿(aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)和次烏頭堿(hypaconitine)。烏頭類生物堿毒性很強，易對神經和心血管系統造成嚴重傷害，引起心律失常、室性心動過速、心室纖維顫動、系統性麻痹、惡心、嘔吐、眩暈、休克和昏迷等。同時，烏頭堿類成分又具有很強的抗炎鎮痛活性，可顯著抑制角叉菜膠、蛋清、組織胺 及5-HT等多種致炎劑引起的大鼠足跖腫脹，明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫及組胺、5-HT引起的毛細血管通透性增加，減少炎性滲出液中白細胞的滲出。如今烏頭堿中毒成為附子臨床應用的最大顧忌。如何最大限度發揮藥效作用而產生最少副作用，是為附子的一大難題。從古到今，醫者和學者一直追求附子的“減毒增效”，提出了不同炮制方法、不同劑量以及不同配伍等減毒策略。《金匱要略》和《傷寒論》等經典方劑中多以甘草、干姜、白芍、大黃等與附子配伍，主要起到解毒的作用:即通過降低雙酯型生物堿含量或改變代謝途徑以減少有毒生物堿的機體吸收。炮制也是附子減毒的主要方法，如火神派吳佩衡等醫家用附子遵循三點原則:一是用炮制附子；二是與干姜、上肉桂等配伍使用；三是久煎。其中久煎最為講究，大劑量下常煎3小時并嘗之，待半小時后不麻口，才與它藥同煎服之。然而，上述減毒方法仍無法保證附子臨床應用的安全性，并未開發出真正的無毒附子。究其原因還是臨床對附子毒性、劑量、炮制方法的關聯度界限不明以及缺少附子減毒炮制的統一標準。此外，扶陽學派使用大劑量附子在臨床上沒有形成共識，與國家藥典相違背，制約了附子藥效的充分發揮。本發明正是針對上述問題研究獲得的應用開發性成果，具有較好的應用前景。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝。本工藝利用這類有毒生物堿易被加熱水解的原理，建立附子去毒新工藝。小鼠急性毒性實驗表明，通過本工藝去毒后的附子水煎液完全不具備急性毒性；高效液相色譜分析證明附子中的毒性成分烏頭堿類在制備過程中被完全降解成烏頭胺等成分；藥效實驗結果揭示，完全去毒后的附子仍具備抗炎活性，能對大鼠佐劑性關節炎模型發揮藥效作用。本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝，該工藝包括以下幾個步驟:1)取中等大小的泥附子，洗凈后晾干稱重，每50kg附子中加入25L食用膽巴水和12.5L清水浸泡7天；2)水煮I小時至透心后放清水中浸泡24小時，剝去 表皮，再浸泡10小時；3)縱切為2 3mm薄片，放置清水浸泡10小時，曬干至起卷角，用硫磺熏后再曬或烘到全干；4)加入5 10倍量體積水中浸泡30分鐘后煮沸，敞口久煎2小時(武火煮沸，文火煎煮2小時);5)離心取上清后獲得無毒附子藥液，濃縮后使用。所獲得的去毒附子藥液，高效液相色譜分析顯示其不含烏頭堿成分，少量含有中烏頭堿(0.56±0.02 μ g/g)和次烏頭堿(8.73±0.13 μ g/g);小鼠急性毒性檢測證明其不具急性毒性，最高灌胃劑量(190g/kg)下小鼠存活率100%;大鼠藥理學實驗揭示其具有抗炎活性，能有效改善佐劑性關節炎大鼠病征。作為優選，在步驟4)后，用四層紗布過濾，得第一次水煎液，藥渣再加入1~8倍量體積水，武火煮沸后文火煎煮2小時，用四層紗布過濾，得第二次水煎液，棄去藥渣；合并兩次水煎液，將水煎液濃縮成浸膏(在旋轉蒸發儀上50° C濃縮)，即為所述完全去除急性毒性并保留藥效活性的附子提取物。同時制備久煎半小時、I小時的附子提取物，與發明中去毒附子進行下述成分、毒性和藥效比較。烏頭類生物堿成分既是附子中的主要有效成分也是劇毒成分，主要有烏頭堿(aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)和次烏頭堿(hypaconitine),能產生明顯的心血管毒性、神經毒性和消化道毒性。通過煎煮等炮制工藝能將這類有毒的二萜雙酯型生物堿成分水解成為無毒的二萜非酯型生物堿。據此，本發明應用HPLC法對久煎半小時、I小時、以及去毒附子所含上述三種主要有毒成分的含量進行測定，在評價去毒工藝、揭示去毒機理的同時，為該工藝提供相應質量控制標準參考。這是本發明提供的第一個技術參數。進一步，本發明通過小鼠急性毒性實驗，確定久煎2小時為最佳的工藝條件，優于久煎半小時與I小時，能完全去除附子急性毒性。這是本發明提供的另一個技術參數，也為本工藝的質量控制標準提供參考。此外，本發明通過構建大鼠佐劑性關節炎模型，對久煎半小時、I小時、以及去毒附子低、中、高劑量下去毒附子的抗炎藥效進行評價，指標檢測結果證明附子完全去毒后仍能改善佐劑性關節炎表征，與未達到去毒效果的半小時、I小時久煎附子效果相同，能通過抑制白介素-1 (IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α )的表達發揮抗炎作用，從而證明本發明中的去毒附子仍能保留藥效活性，具有較好的應用價值。本發明的有益效果主要體現在:首次建立附子去毒工藝及其相關質量控制標準；首次證明無毒附子的藥效作用并將其應用于類風濕關節炎的實驗研究，為附子安全有效的臨床應用和診療方案優化提供科學依據。方法簡便、穩定，成本低，可確保附子的完全去毒，為附子在臨床的安全應用提供保障，預期可產生良好的經濟和社會效益。


圖1為三種有毒二萜雙酯型生物堿的水解過程示意圖。圖2為不同去毒條件下附子所含三種有毒生物堿的高效液相色譜圖；raw Fuzi:生附子；Bfp:普通炮制的白附片；dBfp-30:久煎30分鐘的去毒附子；dBfp-60:久煎60分鐘的去毒附子；dBfp-120:久煎120分鐘的去毒附子；其中久煎120分鐘后附子烏頭堿成分被完全水解。圖3為不同去 毒條件下附子所含三種有毒生物堿的含量比較示意圖；圖4為急性毒性實驗中三種去毒附子(dBfp-30、dBfp-60、dBfp-120)引起小鼠的累積死亡率和LD5tl比較示意圖；圖5為藥理實驗中三種去毒附子(dBfp-30、dBfp-60、dBfp-120)對佐劑性關節炎大鼠足跖腫脹程度的改善作用示意圖；圖6為藥理實驗中三種去毒附子(dBfp-30、dBfp-60、dBfp-120)基于白介素和腫瘤壞死因子的抗炎作用示意圖。
具體實施例方式下面通過結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。試劑及材料:生附子(四川江油)、白附片(浙江中醫藥大學飲片廠，批號:100424)，以上均經鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)的子根加工品。烏頭堿aconitine(中國藥品生物制品檢定所，批號:0720_9406)、中烏頭堿mesaconitine (中國藥品生物制品檢定所，批號:0799-9203)、次烏頭堿hypaconitine (中國藥品生物制品檢定所,批號:0798-9202);乙腈(美國TEDIA試劑公司)、四氫呋喃為色譜純；異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氨水、醋酸銨、醋酸等為分析純。弗氏不完全佐劑(Freund’s Incomplete Adjuvant):規格:IOml/支，SIGMA公司生產，批號:908024LC。弗氏完全佐劑FCA制備:將卡介苗加入FIA中配成含卡介苗濃度為10mg/ml的FCA，于振蕩器中振蕩，充分乳化。實驗動物及飼養條件:SPF級體重18(T220g雄性Wistar大鼠和體重18 22g雌雄各半的Kunming小鼠由中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號:SCXK (滬)2007-0005。飼養于屏障環境，溫度22土 1°C，相對濕度50 70%，換風次數15 20次/小時，光照15(T200LX，12小時明暗交替，噪音<50dB，設有溫度、濕度、光照、壓力梯度等自動控制和顯示系統；飼喂Co60輻照全價營養顆粒飼料，使用許可證:SYXK(浙)2008-0115。高效液相色譜儀(waters e2695，在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器);十萬分之一電子天平(BS224S，德國賽多利斯)、超聲機、中藥粉碎機等。紫外檢測器(德國Knauer公司，K-2501);電子天平(德國賽多利斯，BS224S) ;L_210型漩渦混合器(北京來亨科貿有限責任公司)電爐、不銹鋼鍋等。實施例1:去毒附子提取物的制備取中等大小的泥附子，洗凈后晾干稱重，每50kg附子中加入25L食用膽巴水和
12.5L清水浸泡7天，水煮I小時至透心后放清水中浸泡24小時，剝去表皮，再浸泡10小時后縱切為2 3_薄片，放置清水浸泡10小時，曬干至起卷角，用硫磺熏后再曬或烘到全干，加入5 10倍量水，浸泡30min以上，敞口，武火煮沸，文火煎煮2小時。用四層紗布過濾，得第一次水煎液。藥渣再加入Γ8倍量水，武火煮沸后文火煎煮2小時，用四層紗布過濾，得第二次水煎液，棄去藥渣。合并兩次水煎液，將所得去毒附子水煎液濃縮成浸膏(在旋轉蒸發儀上50° C濃縮)，使用前按不同濃度進行溶解稀釋。實施例2:去毒附子所含有毒烏頭堿的色譜分析與含量測定對照品溶液的制備:精密量取中烏頭堿對照品2.598lmg、烏頭堿對照品
3.3345mg、次烏頭堿對照品6.8230mg,分別定容于5mL容量瓶中，制成三個單標對照品溶液。從以上各對照品中分別取適量lmL、0.5mL、lmL，定容于IOmL容量瓶中，制備成混合標準品O供試品溶液的制備:取去毒附子浸膏10g，精密稱定置具塞錐形瓶中，加氨試液5mL，漩渦2min。精密加入乙醚50mL，用巴氏吸管反復吹打lmin，靜置過夜，分取乙醚層，下層再用乙醚洗滌兩次，每次25mL，用巴氏吸管反復吹打lmin，靜置30min，分取乙醚層。合并三次乙醚層，低溫回收后，用鹽酸甲醇定容于5mL容量瓶。色譜條件:色譜柱 HypersiLBDSC18 ;檢測波長235nm ;流速L Omin.mL-1 ;柱溫30 0C ;流動相為乙腈-0.1%三乙胺(45:55)。方法學考察:精密度考察:精密吸取中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿適量至5mL容量瓶中，在上述色譜條件下進行分析，連續進樣5次，計算峰面積及RSD ;穩定性考察:精密稱取去毒附子浸膏I份，制備成供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，分別在0、4、8、12、24、48h進樣，計算峰面積RSD ;線性關系考察:精密吸取上述對照品混合溶液，采用倍倍稀釋方法得系列標準溶液，精密吸取20 μ L，在相同色譜條件下進行分析，以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸；重復性考察:精密稱取去毒附子浸膏6份，制備成供試品溶液，在相同色譜條件下進行分析，計算含量及RSD ;加樣回收率考察:精密稱取9份已知含量的去毒附子浸膏，分別精密加入不同量的中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿對照品，按照制備成供試品溶液進行分析，計算加樣回收率及RSD。去毒附子中有毒二萜雙酯型生物堿的含量測定:按照上述方法學考察中的方法制備供試品溶液，精密吸取20 μ L注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進行分析，每份樣品平行測定三份，按照外標法計算含量和RSD。結果顯不:去毒附子中烏頭喊被完全水解，濃度含量為O ;中烏頭喊和次烏頭喊含量顯著降低。實施例3:去毒附子急性毒性評價上述Kunming小鼠分組后禁食12h，再一次灌胃給予不同劑量(70、100、130、160、190g/kg)去毒附子?？瞻讓φ战M給予相同體積無菌水。連續觀察14天，期間進行一般生理學檢測和死亡率統計，并計算出半數致死量LD5tl、最大耐受量MTD、最小致死劑量MLD、無明顯損害作用水平NOAEL等。結果顯示:去毒附子對小鼠沒有顯示急性毒性，致死率為O。實施例4:去毒附子抗炎藥效作用評價將上述Wistar大鼠進行隨機分組，出正常組外進行佐劑性關節炎造模:大鼠右后足爪皮內注射含卡介苗IOmg ml-1的弗氏完全佐劑0.1ml0每只動物lml/100g灌胃給予去毒附子(14g/kg生藥量)，連續14天。觀察期間，采用定量或半定量的方法，對各組大鼠的體重、肛溫、飲食量、飲水量、尿量、大便干濕程度、脫毛、激惹反應能力進行觀察、檢測。每3天進行一次。大鼠足跖腫脹度測量:用足跖容積儀每3天測量大鼠足趾體積，測試部位為右后足跖部(至踝關節)，造模前(0天)測試基礎值，以后每次測試所得結果減去基礎值即是足跖腫脹變化量。足跖腫脹率E%= (Vt-Vn) /Vn注:Vn致炎前容積Vt致炎后容積。血清樣本的制備:用10%水合氯醛溶液，3ml/kg，麻醉大鼠，腹腔靜脈取血置離心管中，3000rpm離心IOmin (4°C),分離血清,用eppendorf管分裝,按照IL-1和TNF- a試劑盒說明操作，于波長450nm的酶標儀上檢測其OD值。以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標繪制曲線圖，根據樣品的OD值求得各樣本的濃度。計量資料兩兩比較用t檢驗；檢驗其差異性，以P〈0.05或P〈0.01為其差異顯著性的標準。所有數據均采用SPSS17統計軟件包統計。結果顯示:去毒附子可改明顯善佐劑性關節炎大鼠的足腫脹程度(P〈0.01)。并通過調節血清IL-UTNF-a水平(P〈0.01)`發揮抗炎作用。最后，應當指出，以上實例僅是本發明較有代表性的例子。顯然，本發明的技術方案并不限于上述實例，還可以有許多變形，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝，其特征在于:該工藝包括以下幾個步驟:I)取中等大小的泥附子，洗凈后晾干稱重，每50kg附子中加入25L食用膽巴水和12.5L清水浸泡7天；2)水煮I小時至透心后放清水中浸泡24小時，剝去表皮，再浸泡10小時；3)縱切為2 3mm薄片，放置清水浸泡10小時，曬干至起卷角，用硫磺熏后再曬或烘到全干；4)加入5 10倍量體積水中浸泡30分鐘后煮沸，敞口久煎2小時；5)離心取上清后獲得無毒附子藥液，濃縮后使用。
2.根據權利要求1所述的能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝，其特征在于:在步驟4)后，用四層紗布過濾，得第一次水煎液，藥渣再加入Γ8倍量體積水，武火煮沸后文火煎煮2小時，用四層紗布過濾，得第二次水煎液，棄去藥渣；合并兩次水煎液，將水煎液濃縮成浸膏，即為附子提`取物。
全文摘要
本發明提供了一種能完全去除附子急性毒性并保留其藥效活性的制備工藝，該工藝包括以下幾個步驟1)取中等大小的泥附子，洗凈后晾干稱重，每50kg附子中加入25L食用膽巴水和12.5L清水浸泡7天；2)水煮1小時至透心后放清水中浸泡24小時，剝去表皮，再浸泡10小時；3)縱切為2~3mm薄片，放置清水浸泡10小時，曬干至起卷角，用硫磺熏后再曬或烘到全干；4)加入5~10倍量體積水中浸泡30分鐘后煮沸，敞口久煎2小時；5)離心取上清后獲得無毒附子藥液，濃縮后使用。本發明的有益效果主要體現在方法簡便、穩定，成本低，可確保附子的完全去毒，為附子在臨床的安全應用提供保障，預期可產生良好的經濟和社會效益。
文檔編號A61K125/00GK103181957SQ20131001433
公開日2013年7月3日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者童培建, 肖魯偉, 單樂天, 金紅婷, 吳承亮, 李昌煜, 朱英, 尹華, 王知青 申請人:浙江中醫藥大學