抑郁癥的調節因子及其應用的制作方法【專利摘要】本發明提供了抑郁癥的調節因子及其應用。具體地，本發明提供了βCaMKII抑制劑在制備預防和/或治療抑郁癥的藥物中應用。本發明的研究表明，在外側韁核過表達βCaMKII(而非αCaMKII)可誘導出快感缺乏和行為絕望的核心抑郁癥狀。在外側韁核下調βCaMKII的表達水平，降低它的激酶活性或者阻斷它的下游分子GluR1則可以逆轉動物的抑郁表型。【專利說明】抑郁癥的調節因子及其應用【
技術領域：
】[0001]本領域涉及生物技術及醫藥領域，特別地，涉及抑郁癥的調節因子及其應用。【
背景技術：
】[0002]重度抑郁癥（MDD)，是最常見和最致殘的精神疾病之一，其具有以下特點，心情低落，動力缺失，絕望，無法感受開心，也被稱為快感缺乏（1)。對于導致MDD的原因，現今觀點認為，在響應外界刺激比如壓力時，特定大腦環路的神經活動發生了改變。而這種改變是由于特定分子及細胞水平的變化所引起的。最近，外側韁核（LHb)，作為從邊緣前腦向眾多單胺中心傳遞信息的核心腦區，已經成為抑郁癥病理生理學和治療研究的關鍵大腦區域。LHb神經元被厭惡情緒激活，包括壓力，沮喪，恐懼或預期的負回報。與之一致的是，神經影像學研究已經確定了在抑郁狀態下韁核活躍度的提高。此外，最近的一項研究發現，在動物抑郁模型中，突觸活性和LHb神經元峰值輸出都得到增強。然而LHb中這些異常細胞過程的分子機制以及誘導抑郁癥的刺激如壓力如何導致這些變化的產生仍然需要研究確定。[0003]為了對抑郁癥進行預防和治療，本領域迫切需要抑郁癥調節的相關因子及其作用機制，并開發可用于預防和/或治療抑郁癥的藥物。【
發明內容】[0004]本發明的目的就是提供可用于預防和/或治療抑郁癥的活性成分和藥物[0005]在本發明的第一方面，提供了一種βCaMKII抑制劑的用途，用于制備預防和/或治療抑郁癥的藥物。[0006]在另一優選例中，所述的抑制劑選自下組：[0007]⑴干擾βCaMKII表達的干擾RNA或其前體；[0008](ii)激酶活性下降或喪失的突變型βCaMKII蛋白或其編碼序列；[0009](iii)抑制βCaMKII活性的抑制劑；[0010](iv)βCaMKII的競爭性抑制劑；[0011](V)抗βCaMKII的抗體；[0012](vi)阻遏βCaMKII調控AMPARGluRl通路的拮抗劑。[0013]在另一優選例中，所述的干擾RNA是βRNAi(SEQIDNO.:1，5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'）。[0014]在另一優選例中，所述的突變型βCaMKII蛋白是βCaMKII蛋白顯性失活因子，較佳地為PK43R(WaymanGAetal.2011)。[0015]在另一優選例中，所述的PCaMKII的抑制劑包括KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant_AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，CelI-permeable)〇[0016]在另一優選例中，所述組分（vi)是AMPARGluRl的顯性失活因子，較佳地為GluRICt。[0017]在另一優選例中，所述的抑制劑或拮抗劑包括以下形式：多核苷酸、多肽、表達載體、小分子化合物、或其組合。[0018]在另一優選例中，所述的表達載體選自下組：病毒載體。[0019]在另一優選例中，所述的βCaMKII抑制劑還用于制備降低外側韁核的神經元峰電位輸出的藥物和/或降低外側韁核的突觸效能的藥物。[0020]在另一優選例中，所述藥物是靶向作用于外側韁核的藥物，或所述藥物是施用于外側韁核區域或附近區域的藥物。[0021]在本發明的第二方面，提供了一種可用于預防和/或治療抑郁癥的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：[0022]藥學上可接受的載體；和[0023]有效量活性成分，其中所述的活性成分為βCaMKII抑制劑或拮抗劑。[0024]在另一優選例中，所述的活性成分對aCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。[0025]在另一優選例中，所述的活性成分對δCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。[0026]在另一優選例中，所述的活性成分對YCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。在另一優選例中，所述的活性成分對YCaMKII有抑制/拮抗作用。[0027]在另一優選例中，所述的活性成分選擇性抑制βCaMKII，而對其他CaMKII(包括aCaMKII、YCaMKII、和δCaMKII)無或基本上無抑制/拮抗作用。[0028]在另一優選例中，所述PCaMKII抑制劑或拮抗劑選自下組：PCaMKII-RNAi、βK43R、KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant-AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，Cell-permeable)〇[0029]在另一優選例中，所述的藥物組合物為口服制劑、注射劑、靶向制劑等。[0030]在本發明的第三方面，提供了一種βCaMKII蛋白或其編碼序列和/或βCaMKII促進劑的用途，它被用于制備一試劑或組合物，所述試劑或組合物用于構建抑郁癥動物模型。[0031]在另一優選例中，所述的抑郁癥動物模型中，PCaMKII是高表達的。[0032]在另一優選例中，所述的抑郁癥動物模型中，βCaMKII在外側韁核中是高表達的。[0033]在另一優選例中，所述的高表達（按mRNA水平或蛋白水平）指彡150%，較佳地彡200%，更佳地彡200%。[0034]在另一優選例中，所述高表達（按mRNA水平或蛋白水平）的上限為<2000%、較佳地彡1000%、更佳地彡500%。[0035]在本發明的第四方面，提供了一種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，包括步驟：[0036](1)給抑郁癥動物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動物模型的外側韁核中βCaMKII是高表達的；和[0037](2)觀察所述抑郁癥動物模型中的抑郁癥的相關癥狀和/或指標，并與對照組進行比較；[0038]其中，所述抑郁癥動物模型中抑郁癥的相關癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質。[0039]在另一優選例中，所述的動物模型為非人哺乳動物，如嚙齒動物、兔、靈長動物。[0040]在另一優選例中，在步驟（2)，通過動物行為學實驗觀察抑郁癥狀。[0041]在另一優選例中，所述的動物行為學實驗選自下組：習得無助實驗、強制游泳實驗、蔗糖偏好實驗、懸尾實驗、新奇抑制攝食實驗。[0042]在另一優選例中，所述的癥狀選自下組：習得無助（按杠桿次數減少）、放棄游泳提早且靜止時間增加、糖水消耗減少、掙扎減少、攝食抑制增加。[0043]在另一優選例中，所述的指標包括：βCaMKII的表達水平、βCaMKII的活性水平。[0044]在另一優選例中，所述的施用（或給藥）包括口服施用。[0045]在另一優選例中，所述的對照組包括：陰性對照組和/或陽性對照組。[0046]在另一優選例中，所述的陰性對照組包括：未施用測試物的對照組；或施用測試物之前的同一試驗組。[0047]在本發明的第五方面，提供了一種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，包括步驟：[0048](1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和[0049](2)檢測所述測試組的體外檢測體系中βCaMKII的表達水平和/或活性，并與陰性對照組進行比較；[0050]其中，如果與加入了陰性對照組相比，測試組中PCaMKII的表達水平顯著下降，和/或βCaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質。[0051]在另一優選例中，所述的體外檢測體系包括細胞體系；較佳地為神經元細胞體系；較佳地為外側韁核神經元體系。[0052]在另一優選例中，所述的顯著下降指，與陰性對照相比，測試組中PCaMKII的表達水平或活性是陰性對照組的5-90%，較佳地10-60%，更佳地20-50%。[0053]在另一優選例中，所述的步驟（2)還包括與陽性對照組進行比較。[0054]在另一優選例中，所述方法還包括以下一個或多個步驟：[0055]對上一步驟篩選出的潛在物質，進一步測試其對GluRl的膜部分的影響；[0056]對上一步驟篩選出的潛在物質，施用于動物模型，觀察其對抑郁癥癥狀的影響。[0057]在另一優選例中，在測試其對GluRl的膜部分的影響時，如果與陰性對照組（或空白對照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質。[0058]在另一優選例中，所述的GluRl含量是在神經元細胞膜上的GluRl含量。[0059]在本發明的第六方面，提供了一種GluRl抑制劑的用途，用于制備預防和/或治療抑郁癥的藥物。[0060]在另一優選例中，所述藥物還用于降低外側韁核的神經元峰電位輸出和突觸效能。[0061]在另一優選例中，所述的GluRl抑制劑是βCaMKII抑制劑。[0062]在另一優選例中，所述的GluRl抑制劑是GluRl的競爭性抑制劑，包括顯性失活因子，較佳地為GluRlCt。[0063]在另一優選例中，所述的GluRl抑制劑選自下組：多核苷酸、多肽、表達載體、小分子化合物、或其組合。[0064]在本發明的第七方面，提供了一種預防和/或治療抑郁癥的方法，包括步驟：給需要的對象施用安全有效量的βCaMKII抑制劑。[0065]在另一優選例中，所述的施用是施用于外側韁核區域。[0066]在本發明的第八方面，提供了一種降低神經元峰電位輸出和突觸效能的方法，包括步驟：給需要的對象施用安全有效量的βCaMKII抑制劑。[0067]在另一優選例中，所述的對象是哺乳動物，包括嚙齒動物（如大鼠、小鼠）、靈長動物（如人）。[0068]在另一優選例中，所述的施用是施用于外側韁核區域。[0069]在本發明的第九方面，提供了一種預防和/或治療抑郁癥的方法，包括步驟：給需要的對象施用安全有效量的GluRl抑制劑。[0070]在另一優選例中，所述的施用是施用于外側韁核區域。[0071]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。【專利附圖】【附圖說明】[0072]圖1顯示了抑郁大鼠LHb中βCaMKII的上調。（A)cLH大鼠的抑郁癥表型。數字代表所用動物數量。LH測試中，最大壓力數設置為15。（B)基于穩定同位素標記的高通量定量蛋白質組學實驗略圖。簡要地，未標記的韁核（14N)WT或cLH大鼠進行解剖，勻化，并以1:1的比例與15N標記的大鼠總腦組織勻漿混合。濃縮膜部分，500g蛋白質樣品被用于標準質譜分析。計算每個已鑒定肽段的14N/15N比例。比較cLH和對照組每個蛋白質肽段比率詳情請看方法部分。（C)在3個獨立的蛋白質組學運行中確定βCaMKII的蛋白質組學分析，基于總的肽段，或獨特的肽段（不為家系里其他成員所共有的肽段）。（D，E)Westernblot分析顯示在cLH大鼠韁⑶或的海馬（E)膜部分PCaMKII的變化。組織的大量微管蛋白被用作加載控制。蛋白表達進行定量標準化。（F)韁中PCaMKIImRNA的qPCR分析。（G)外側韁核部分（LHb)中CaMKII水平增加，如左邊IHC圖像和右邊定量圖所示。比例尺，200μm。(H)在急性習得無助和慢性應激（CMS)抑郁模型中βCaMKII水平增加。ALH和ANLH為受到LH壓力的大鼠組，但ALH)表現LH癥狀，ANLH沒有表現LH癥狀。（I)Westernblot分析顯示cLH大鼠用生理鹽水或抗抑郁藥丙咪嗪處理后韁膜部分中PCaMKII水平。數據是平均值土SEM。*P〈0.05，#P〈0.01，*#P〈0.001與對照組相比。N.S.表示差異不顯著。其他的圖標相同。[0073]圖2顯示了小鼠和大鼠中βCaMKI(而非aCaMKII)的過表達引起抑郁行為。（A)AAV載體工程改造用來過表達控制結構，PCaMKII，aCaMKII，或激酶死亡突變體PCaMKII的示意圖。ITR，反向末端重復序列；巨細胞病毒（CMV)，巨細胞病毒啟動子；Ubi:泛素啟動子；2A:允許多種非融合蛋白翻譯的病毒2A連接肽。（B)WT小鼠或大鼠用于行為測試的實驗范式。（C)小鼠LHb雙邊AAV-βCaMKII病毒注射圖示（使用抗GFP和核標記Hoechst復染色）。比例尺，50μΜ.(D-I)動物抑郁模型，小鼠（D-G)和大鼠（Η，Ι)，動物LHb中表達不同病毒構建物對行為的影響。（F，G)對比LHb感染細胞分數繪制的在強迫游泳中標準化不動時間（F)或蔗糖偏好測試（G)。數據采用注射AAV對照小鼠平均值進行標準化。*P<0.05，**P〈0.01，***P〈0.OOl相比于未注射WT#P<0.05與AAV對照。[0074]圖3顯示了βCaMKII的過表達增強LHb神經元突觸活性和的峰電位輸出。（A)外側韁核配對記錄示意圖（左圖）。右圖：在透射（頂部）和熒光（底部）光學顯微鏡下βCaMKII感染LHb神經元配對修補（綠色箭頭）和相鄰的未受感染神經元（紅色箭頭指出）。比例尺，10μΜ.⑶全細胞模式下檢測到的對照組LHb神經元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神經元的mEPSC痕跡示例。（C，D)mEPSC間期和平均頻率的累積分布(左），被AAV-βCaMKII(C)或AAV-aCaMKII⑶感染神經元的mEPSC振幅（右）。每一行代表一對對照神經元和相鄰的病毒感染神經元的值。（E)全細胞模式下檢測到的對照組LHb神經元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神經元的自發發放峰電位痕跡示例。（F，G)被AAVICaMKII(F)或AAV-aCaMKII(G)感染神經元的平均自發放電頻率。[0075]圖4顯示了LHb中βCaMKII敲除能救治cLH大鼠的抑郁癥表型和降低LHb神經元突觸活度。（A)工程修飾用來過表達βCaMKII的RNAi的AAV載體示意圖。Hl:人Hl啟動子。（B)用βCaMKIIRNAi構建物特異性敲除βCaMKII而不是aCaMKII。在293tn細胞中pSUPER-βCaMKII-RNAi構建物是和AAV-βCaMKII或AAV-aCaMKII質粒共轉染，并在western分析前先表達48小時。左：代表westernblot。右：敲除效果定量。（C)病毒侵染cLH大鼠行為測試的實驗范式。（D-E)cLH大鼠LHb表達AAV-βRNAi和AAV-βK43R后強迫游泳試驗（D)和習得無助測試（E，F)中的行為影響。（F)每類動物百分比。LH:彡5桿壓迫習得無助大鼠。NLH:彡10桿壓迫非習得無助大鼠。（G)亞病毒感染次區域表征。上圖：AAVIRNAi病毒感染cLH大鼠腦片中外側韁核（LHb-L)和內側韁核（LHb-m)分區圖例。比例尺，10010μM。下圖：對比cLH大鼠LHb-I和LHb-m感染率繪制的在習得無助實驗中行為響應。（H)cLH大鼠AAV-βRNAi感染LHb神經元mEPSCs發生改變。上圖：mEPSC痕跡示例。被AAV-βRNAi感染LHb神經元的mEPSC間期和平均頻率累積分布（左下），mEPSC振幅（右下）。*Ρ〈〇·05,**Ρ〈0·01，*#Ρ〈0·001跟cLH/AAV-對照比較[0076]圖5顯示了阻斷GluRl-typeAMPA受體的突觸結合（一個βCaMKII的下游分子）可減輕抑郁。（A，B)Westernblot分析顯示cLH大鼠韁核蛋白提取物膜部分的GluRl的表達水平增加（A)，抗抑郁藥丙咪嗪處理后明顯下降（B)。（C)用AAV-0CaMKII-2A-GluRlCt病毒共同表達βCaMKII和GluRlCt增強了LHb中CaMKII和GluRl的免疫組織化學信號。右：IHC信號量化。比例尺，100μΜ.(D，Ε)雙側LHb內βCaMKII和GluRlCt共表達阻斷了^CaMKII過表達引起的強迫游泳實驗（D)和快感缺乏（E)表型。（F)模型圖解：在正常狀態下，LHb對VTA和DRN具有相對較弱抑制。在抑郁狀態，壓力引起的PCaMKII的表達水平上調，這導致GluRl膜運輸增加，增加LHb神經元突觸效能和峰電位輸出。因此，LHb對于VTA和DRN的抑制被增強，進而導致快感缺乏及行為絕望。[0077]圖6顯示了蛋白質組學數據分析。（A)數據統計流程圖.（B)標準化數據分布.（C)為了驗證這一實驗技術，一個樣品被分成兩個相同部分并在質譜儀上運行兩次。兩次實驗重復數據相互比較，表現出高度相關。[0078]圖7顯示了經過蛋白質組學篩選鑒定的的候選蛋白表達水平八個上調（A)，四個下調（B)。值得注意的是，絕大部分表達上調蛋白為神經元中豐富的分子，絕大部分表達下調蛋白為參與基礎代謝功能的催化分子。[0079]圖8顯示了表達水平上調候選蛋白的qRT-PCR驗證結果。*ρ〈(λ05,#ρ〈(λ01與對照組相比[0080]圖9顯示了CamKII家族另外三個成員的測定結果。（A,B)western印跡分析顯示cLH大鼠韁核（A)或海馬⑶膜部分中的α-，δ-和Y-CaMKII的變化。[0081]圖10顯示了單側注射病毒構建物的過表達水平估算的結果。（A)經由這三種病毒單側注射的小鼠冠狀鬧切片示意圖。頂部面板：用抗GFP(綠色）染色或直接可視化tdTomato(紅色）的腦切片，Hoechst(藍色）復染色的腦切片。左：非注射側。右：注射側。D3V:背第三室。底部面板：相同小鼠的相鄰腦切片，用抗CamKII抗體染色，以用于B圖中的定量化。（B)注射側和非注射側的CaMKII的信號強度比所代表過表達水平。11=5€(^4八￥-βCaMKII-2A-GFP，n=4forAAV-aCaMKII-2A-tdTomato和AAV-βCaMKII-K43R-2A-GFP.[0082]圖11顯示了小鼠LHb病毒靶向區域示意圖.⑷大部分病毒表達所在的前后區域。左圖為來自于注射AAV-PCaMKII病毒小鼠的腦切片示意圖。右圖為改編自Paxinos&Franklin2004圖冊的對應原理圖。[0083]圖12顯示了注射不同病毒小鼠的開放場實驗結果。㈧總位移距離。⑶開放場實驗中中心停留時間。[0084]圖13顯示了LHb中異質性mEPSC響應圖。（A)LHb不同子區域內mEPSC記錄。每個點代表一個神經元的記錄。mEPSC響應頻率被顏色標注。（B)每個點代表該區域記錄的一對神經元。各對神經元mEPSC頻率的值都已標注。（C)圖B所記錄的成對神經元中一個神經元對比另一個神經元的mEPSC頻率。值得注意的是，盡管位置不同，來自同一對的神經元表現出高度相同的mEPSC頻率。[0085]圖14顯示了韁核蛋白裂解物全部或者膜部分GluRl的表達水平。（A)顯示cLH大鼠和對照大鼠的韁核總組分或者膜部分GluRl水平變化的western印跡分析示意圖。（B)GluRl水平變化的定量化。【具體實施方式】[0086]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現βCaMKII是抑郁癥的一個至關重要的調節因子，結合了分子、行為和電生理等手段，確定了PCaMKII是導致韁核過度活躍和行為抑郁的關鍵分子，在此基礎上完成了本發明。[0087]具體地，在外側韁核過表達βCaMKII(而非aCaMKII)不僅可以明顯增強突出傳遞效率和外側韁核神經元的動作電位輸出，而且可以誘導出快感缺乏和行為絕望的核心抑郁癥狀。在外側韁核下調PCaMKII的表達水平，降低它的激酶活性或者阻斷它的下游分子GluRl則可以逆轉動物的抑郁表型。以上結果表明PCaMKII是調節LHb神經元在抑郁癥的病理發生中發揮功能的關鍵分子。[0088]定義[0089]如本文所用，術語CaMKII,是指鈣調蛋白激酶II(CaMkinaseII)。[0090]如本文所用，術語"βCaMKII抑制劑"和"βCaMKII拮抗劑"可互換使用，都指能夠抑制和/或拮抗βCaMKII的表達水平或蛋白活性、以及阻止或阻遏βCaMKII功能的物質。[0091]如本文所用，術語mEPSCs，是指微型興奮性突出后電流。[0092]如本文所用，AMPAR,α-氛基-3-輕基_5_甲基_4_異惡唑丙酸（a-amin〇-3_hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid(AMPA))受體[0093]方法[0094]本發明提供了一種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，包括步驟：[0095](1)給抑郁癥動物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動物模型中βCaMKII是高表達的；和[0096](2)觀察所述抑郁癥動物模型中的抑郁癥的相關癥狀和/或指標，并與對照組進行比較；[0097]其中，所述抑郁癥動物模型中抑郁癥的相關癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質。[0098]另外，所述的動物模型為非人哺乳動物，如嚙齒動物、兔、靈長動物。[0099]此外，在步驟（2)，通過動物行為學實驗觀察抑郁癥狀。所述的動物行為學實驗包括：強迫游泳實驗，蔗糖偏好實驗，開放場實驗。所述的指標包括：βCaMKII的表達水平、βCaMKII的活性水平。[0100]本發明還提供了另一種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，包括步驟：[0101](1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和[0102](2)檢測所述測試組的體外檢測體系中βCaMKII的表達水平和/或活性，并與陰性對照組進行比較；[0103]其中，如果與加入了陰性對照組相比，測試組中PCaMKII的表達水平顯著下降，和/或βCaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質。所述的體外檢測體系包括細胞體系；較佳地為神經元細胞體系。[0104]另外，所述的顯著下降指，與陰性對照相比，測試組中PCaMKII的表達水平或活性是陰性對照組的5-90%，較佳地10-60%，更佳地20-50%。所述的步驟（2)還包括與陽性對照組進行比較。[0105]此外，所述方法還包括以下一個或多個步驟：[0106]對上一步驟篩選出的潛在物質，進一步測試其對GluRl的膜部分的影響；[0107]對上一步驟篩選出的潛在物質施用于動物模型，觀察其對抑郁癥癥狀的影響。[0108]在測試其對GluRl的膜部分的影響時，如果與陰性對照組（或空白對照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質。所述的GluRl含量是在神經元細胞膜上的GluRl含量。[0109]應用[0110]本發明可以應用于抑郁癥預防和/或治療，也可以應用于藥物的篩選和制備。[0111]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。[0112]通用材料和方法[0113]動物材料[0114]雄性CHL癥大鼠（4-7周齡）和同齡的SpragueDawley大鼠。CHL大鼠飼養如前所述（1)。大鼠兩只/籠，12小時的明暗周期（7am-7pm有光）。成年（10-14周齡）C57BL/6小鼠被用于行為測試：4只/籠，12小時明暗周期（5am-5pm有光）。大鼠和小鼠都能夠自由攝取穩定的水和食物，所有的動物實驗經過中科院神經科學研究所動物保護和使用委員會的批準。[0115]蛋白組學[0116]對三組大腦樣品進行蛋白質組學分析，每組包括野生型SD大鼠對照和先天習得無助（cHL)大鼠，其中先天習得無助大鼠在習得無助實驗和強迫游泳實驗中都表現出抑郁行為。異氟醚麻醉后取下大腦，迅速解剖取下僵帶組織，液氮冷凍。不同樣本的韁組織和經15N標記（大鼠15N喂食兩代使得原子富集15N達95%)的大鼠全腦組織分別加入預冷勻漿緩沖液（320mMsucrose,4mMHEPESρΗ7·4,ImMMgCl2和0·5mMCaCl2,5mMNaF,ImMNa3VO4，EDTA_free，ProteaseInhibitorcocktailtablets(Roche))，用玻璃勻楽器制成勻漿。用Bradford測定蛋白含量（Bio-Rad)，將各樣本勻漿分別和15N全腦勻漿按蛋白比例(w/w)1:1混合。混合物800g，4°C離心15min取上清，上清液1000g，15min離心取沉淀。沉淀即為細胞膜部分，將IOOug沉淀溶于勻漿緩沖液中，用多維蛋白質鑒定技術分析（MudPIT)⑶。對于每個蛋白，在肽水平估算14N/15N的比值，然后求蛋白水平的平均值。成千上萬的蛋白的該比值求log轉化為正態分布，歸一化使得中值為0。正態化之后，CHL的該值除以對照的該值就是這個蛋白在抑郁癥下的變化情況。正態化后的平均比值減去2倍標準差就是每個蛋白的顯著值。變化>50%并且顯著值>0的蛋白作為候選，進行下一步驗證。對每個蛋白取log之后的變化倍數進行Student'st-test，p值見表1。[0117]病毒構建[0118]通過標準方法設計和構建AAV-βCaMKII-2A-EGFP,AAV-aCaMKII-2A_tdTomat〇,AAV-βCaMKII-K43R-2A-EGFP,AAV-βCaMKII-2A-Glu-RlCt,AAV-GFP-CRE和AAV-GFP質粒。βCaMKII和aCaMKII全長cDNA從SD大鼠cDNA文庫中得到。2A信號肽序列從plenti-2A_EGFP質粒中推斷獲得，AAV骨架序列由AAV-GFP-CRE質粒（LisaMonteggia惠贈）克隆得到。對于AAV-βCaMKII-2A-EGFP質粒，[0119]1)將βCaMKII序列先力P到plenti-Ubiquitin-2A_EGFP質粒上，得至IjUbiquitin-βCaMKII-2A-EGFP質粒，再通過BglII和XhoI酶切位點引入AAV骨架。[0120]2)aCaMKII通過BamHl和Xbal酶切位點克隆到pLenti-2A_tdTomato載體上，PCR擴增Ienti載體上的aCaMKII-2A-tdTomato段，然后通過Xball和BsrGl內切酶克隆到AAV載體上。[0121]3)ΑΑν-βCaMKII-K43R-2A-EGFP質粒，βCaMKII-K43R片段通過XbaLl和EcoRl酶切位點克隆到AAV-2A-EGFP上。[0122]4)ΑΑν-βCaMKII-2A-EGFP-GluRlCt質粒，從pSindbis-EGFP-GluRICt質粒中擴增得到EGFP-GluRlCt片段，與AAV-βCaMKII-2A連接。[0123]5)βCaMKII的短發夾寡聚核苷酸序列（shRNAi)是5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'，AAV-βCaMKII-RNAi由NeuronBiotech公司合成（shanghai，china)。[0124]這些構建物都是用前面所述AAV2方法生成的。[0125]簡言之，將一個AAV載體與兩個輔助載體（pXX680和pXX2)，一起轉染到HEK293TN細胞。轉染后兩天，用肝素瓊脂糖柱從細胞裂解液中純化病毒，并超濃縮得到終體積。AAV2的輔助質粒pM680和pXX2從UniversityofNorthCarolina購得。用10倍梯度稀釋的病毒感染HEK293TN細胞測定病毒效價。[0126]抗抑郁治療[0127]cLH大鼠的通過連續14天注射丙米嗪（10mg/kg，sigma)進行抗抑郁治療。注射后分析行為測試。[0128]立體定向注射和組織學[0129]向小鼠注射病毒時，腹腔注射氯胺酮（l〇〇mg/kg體重）和賽拉嗪（8mg/kg)麻醉后，置于立體定位架上（Stoeltinginstruments)。手術前所有的小鼠群居2周以上。將0.8-lul純化濃縮的AAV病毒（?1012感染單位/ml)雙側注入到每只小鼠的LHb位置（前囪坐標位置：-1.32mm前后側（AP)，±I.04mm內外側（ML)，-2.48mm背腹側（DV)，冠狀面中線14°角），使用玻璃微電極緩慢注入（?100_150nl/min)，輸液完成后5min注射電極緩慢撤回。[0130]向大鼠注射病毒，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg體重）麻醉，LHb位置（SD大鼠4周齡，從前囪門起AP-3.0mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.4mm;CHL大鼠4周齡，從前囪門起AP-3.0mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.45mm;CHL大鼠6周齡，從前囪門起AP-3.3mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.7mm)注射1-1.5ul的AAV病毒，微電極束上發現了微弱的標簽效應。術后至少7天，開展行為實驗或者電生理實驗。行為實驗結束后檢查注射位置，只使用正確注射的那些動物數據。注射了AAV-αCaMKII-tdTomato的大鼠或者小鼠的腦切片在熒光顯微鏡下檢查，其它標記了GFP的病毒在顯微檢查之前用抗體檢查GFP蛋白。每個大腦的韁區切成6組連續的切片（小鼠30um的切片，每組6片；大鼠40um切片，每組8-9片）。所有的切片在安裝到固定片之前用Hoechst復染色。計算韁區的感染率。感染率計數是通過使用ImageJ在一組從前到后的腦切片中進行的，一個區的總神經數是用兩個對照組的一組切片里的NeuN信號取平均。用感染細胞數除以總神經元數就是感染率。[0131]免疫組化和免疫印跡[0132]灌流：大鼠或小鼠用10%水合氯醛深度麻醉，用磷酸鹽緩沖液（PBS)和含4%多聚甲醛（w/v)的磷酸鹽進行心臟灌流。大腦在同樣4%多聚甲醛溶液過夜后固定處理，然后浸泡在30%蔗糖（PBS)溶液中1天（小鼠）或3天（大鼠）。冰凍的大腦在冠狀面上用滑動切片機（CM1950,Leica)切成30um(小鼠）或40um(大鼠）切片。切片浸泡在PBS中4°C冷藏以待后用。抗體是兔抗CaKMII(1:300,Epitomics)兔抗GluRl(1:300,Chemicon)，鼠抗NeuNantibody(l:1000,Chemicon),兔抗GFPantibody(l:1000,Invitrogen),雞抗GFPantibody(1:1000,ABCAM),AlexaFluor488羊抗兔IgG,AlexaFluor488羊抗雞IgG,AlexaFluor594羊抗鼠IgG(alll:1000,Invitrogen),生物素標記的羊抗兔IgG,生物素標記的羊抗鼠IgG(all1:250,Vectorlaboratories),Cy3-偶聯鏈霉親和素，Cy2-偶聯鏈霉親和素(alll:1000,JacksonImmunoResearch)。特別的是對于CaKMII和GluRl的著色，我們米用了三步放大操作：切片依次使用CaKMII抗體或GluRl抗體、生物素標記的二抗、Cy3或Cy2偶聯鏈霉親和素孵育。所有的切片最后用Hoechst孵育。突光成像采用OlympusFluoviewFVlOOO共聚焦顯微鏡（10X、20X物鏡）和OlympusMVXIOmicroscope(MVPLAP02XC物鏡）。圖片分析軟件為Image-ProPlus和ImageJ。CaKMII和GluRl的熒光強度定量：在20X下相同設置下捕獲LHb感染側和未感染側共聚焦圖像，并通過Image-ProPlus進一步分析。Hoechst信號的區域值除以IHC信號的綜合光密度（IOD)得到熒光強度。比較LHb的病毒注入側和未注入側的熒光強度得到過表達水平。[0133]免疫印跡：韁或海馬組織的處理與之譜分析的處理相同。10%PAGE膠SDS電泳，每泳道上樣量5_8ug蛋白，轉模做western印跡，抗體是anti-βCaMKII(1:4000,invitrogen)，anti-aCaMKII(1:2000,millipore)，anti-γCaMKII(1:1000,PTG)，anti-δCaMKII(1:500,SantaCruz)和anti-tubulin(1:10000,Bio-Rad)。使用高靈敏度的ECL試劑（GEHelthcare)〇[0134]切片準備[0135]用異氟烷將SD大鼠（出生后40-50天）麻醉后，灌注20ml預冷解剖緩沖液（25.OmMNaH⑶3,I.25mMNaH2PO4,2.5mMKC1，0·5mMCaCl2,7.OmMMgCl2,25.OmMglucose,110.OmMcholinechloride,11.6mMascorbicacid和3.ImMpyruvicacid,gassedwith95%02和5%C02)，斷頭后快速解剖大腦，冠狀韁在氧化的冷凍解剖緩沖液中用振動切片機（DSKII)切成350μπι切片。韁切片在含氧的ACFS溶液NaCl，2.5mMKC1，26mMNaH⑶3,ImMNaH2PO4,IOmMglucose,I.3mMMgCl2和2.5mMCaCl2,gassedwith95%02和5%C02)中恢復兩小時，轉移至持續供給含氧的ACFS溶液的槽中。[0136]電生理[0137]外側韁神經元膜片鉗實驗溫度27±1°C，使用Multiclamp700B放大器（MolecularDevices)和配備紅外微分干涉對比的奧林巴斯光學顯微鏡。電極電阻為3-4ΜΩ。為了mEPSC記錄，在ΤΤΧ(1μM)和印防己毒素（100μM)存在的ACSF溶液中，在-60mv下將神經元夾緊。胞內溶液包含CsMeS03115mM,CsC120mM,HEPESlOmM,MgCl22.5mM,Na2-ATP4mM,Na-GTPO.4mM,Na-phosphocreatinelOmM,EGTA0.6mM。數據通過Digidatal322A(MolecularDevices)在2kHz過濾并在IOkHz隨機抽樣。mEPSC分析米用MiniAnalysisProgram(Synaptosoft)，閾值幅度為5PA。為了測定自發發放率，將神經元接上細胞連接裝置，在存在印防己毒素(picrotoxin)的ACSF溶液中。電極電阻6-7ΜΩ，電極內溶液為NaC1118mM，HEPES10mM。每個細胞記錄50次掃描，每次掃描持續7s，數據通過pClamplO軟件分析。[0138]行為實驗[0139]所有行為實驗都是在黑夜生理節奏期進行（小鼠18:00-23:00);大鼠19:00-24:00).[0140]習得無助實驗范例依據前面所述優化的說明書進行（5)。實驗是對同窩cLH或野生型SD大鼠進行。范式包含兩個部分。"訓練部分"包括在刺激室（coulbourn儀器）中，120次不可避免的、不受控的0.8mA足底電刺激超過40分鐘，隨機刺激持續時間和范圍從5秒到15秒間隔刺激時間，總刺激持續時間為20分鐘。"測試部分"訓練24小時后進行，習得無助表型是由一個桿壓迫任務進行評估，期間一個光照指示桿被放入刺激室中。這一部分包括15次可逃避的0.8mA強度電刺激和24s實驗間隔。每次刺激持續了60秒，但是能被桿壓迫終止。超過10次失敗被定義為"習得無助"（LH);少于5次失敗為"非習得無助"（NLH)。[0141]強迫游泳實驗中，大鼠或小鼠被放置在水缸中6min(水溫23-25°C;對于小鼠，水缸直徑12cm，高度25cm;對于大鼠，水缸直徑為20cm，高度40cm。水的深度是為了防止動物用它們的后肢觸底）。大鼠在前一天有一個額外的15min游泳引導。動物行為被從側面錄像記錄。每個動物在測試最后4min的不動時間由不知動物處理方式的觀察員計算。不動的定義是浮動或靜止不動，這意味著除了保持頭部露出水面的動作不存在任何其他運動。[0142]蔗糖偏好測試中，先將小鼠單獨安置1周，然后習慣于兩瓶1%蔗糖喂食3天，接著兩瓶水喂食一天。然后小鼠停止進水24小時,然后暴露在兩瓶裝滿1%鹿糖或水前2h。Ih后兩瓶位置互換。測定各流體的總消耗量，蔗糖偏好被定義2h測試中的蔗糖溶液消耗量占蔗糖溶液和水總消耗量的比例。[0143]開放場試驗是在所有其他的行為測試之后進行的。在一個明亮房間內，大鼠或小鼠被放置在一個塑料盒的中心（對于小鼠：40cmX40cmX40.5cm;對于大鼠80cmX80cmX40cm)6min，測試期間，動物行為被錄像，隨后使用EthoVisionPro視頻跟蹤系統和軟件（Noldus)分析。使用軟件計算小鼠移動的總距離和在盒子中心所花的時間。[0144]統計分析[0145]所有的數據都以平均值土SEM。對于所有的行為數據，采用two-tailedStudent'st-testsQAAV-βCaMKII-2A_EGFP和AAV-αCaMKII-2A_tdTomato過表達的westernblot數據和電生理數據，采用雙尾配對t檢驗。AAV-βCaMKIIRNAi的電生理檢測數據，采用pairedWilcoxon-tests。[0146]實施例I[0147]選擇性的培育表型習得性無助cLH大鼠，結果如圖IA所示，表現為在從可逃脫足底電擊下逃脫次數明顯減少，這種表現能被慢性抗抑郁藥治療逆轉（丙咪嗪，ip，IOmg/kg，14天）（圖1A)。cLH大鼠在強迫游泳測試中也表現為不動性增加（圖1A)。[0148]實施例2[0149]分離cLH和野生型對照組大鼠的雙側韁核組織，進行定量蛋白質組學分析。[0150]提取蛋白質用于15N穩定同位素標記的定量蛋白質組學分析（圖1B)。為了減少樣品的復雜性，我們提取了膜蛋白組分并進行了三次獨立樣本分析（圖6、圖7、圖8,表1)。研究表明cLH大鼠韁核內βCaMKII表達顯著上調（是野生型對照的1.9倍，P=O.01，圖1C)。對CaMKII家族的其他亞型也進行了檢測：aCaMKII在不同樣品中的表達水平相差很大，但仍然觀察到了上調趨勢；SCaMKII保持不變；YCaMKII顯示了1.3倍的增加（P=O.0013)(圖9)。由于大腦中PCaMKII比YCaMKII更豐富，我們針對這個CaMKII的亞型進行研究。通過Western印跡分析二次驗證，確定了cLH韁核樣品膜蛋白提取物中PCaMKII較對照組有0.86倍的增加（P=O.003)(圖1D)，但cLH海馬樣品中則沒有增加（P=O.33,圖1E)。實時定量PCR檢測顯示βCaMKII的mRNA水平表現出0.37倍的增加（P=0.04)(圖1F)，這表明轉錄調控至少部分導致了蛋白水平的變化。免疫組化的韁腦切片染色顯示：CaMKII蛋白表達水平的增加發生在外側韁（圖1G)。[0151]表1[0152]【權利要求】1.一種PCaMKII抑制劑的用途，其特征在于，用于制備預防和/或治療抑郁癥的藥物。2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自下組：⑴干擾0CaMKII表達的干擾RNA或其前體；(ii)激酶活性下降或喪失的突變型PCaMKII蛋白或其編碼序列；(iii)抑制0CaMKII活性的抑制劑；(iv)0CaMKII的競爭性抑制劑；(v)抗PCaMKII的抗體；(vi)阻遏PCaMKII調控AMPARGluRl通路的拮抗劑。3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑或拮抗劑包括以下形式：多核苷酸、多肽、表達載體、小分子化合物、或其組合。4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PCaMKII抑制劑還用于制備降低外側韁核的神經元峰電位輸出的藥物和/或降低外側韁核的突觸效能的藥物。5.-種可用于預防和/或治療抑郁癥的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括：藥學上可接受的載體；和有效量活性成分，其中所述的活性成分為0CaMKII抑制劑或拮抗劑。6.-種PCaMKII蛋白或其編碼序列和/或@CaMKII促進劑的用途，其特征在于，用于制備一試劑或組合物，所述試劑或組合物用于構建抑郁癥動物模型。7.-種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，其特征在于，包括步驟：(1)給抑郁癥動物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動物模型的外側韁核中3CaMKII是高表達的；和(2)觀察所述抑郁癥動物模型中的抑郁癥的相關癥狀和/或指標，并與對照組進行比較；其中，所述抑郁癥動物模型中抑郁癥的相關癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質。8.-種篩選用于預防和/或治療抑郁癥潛在物質的方法，其特征在于，包括步驟：(1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和(2)檢測所述測試組的體外檢測體系中PCaMKII的表達水平和/或活性，并與陰性對照組進行比較；其中，如果與加入了陰性對照組相比，測試組中0CaMKII的表達水平顯著下降，和/或3CaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下一個或多個步驟：對上一步驟篩選出的潛在物質，進一步測試其對GluRl的膜部分的影響；對上一步驟篩選出的潛在物質，施用于動物模型，觀察其對抑郁癥癥狀的影響；在測試其對GluRl的膜部分的影響時，如果與陰性對照組（或空白對照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預防和/或治療抑郁癥的潛在物質；所述的GluRl含量是在神經元細胞膜上的GluRl含量。10.-種GluRl抑制劑的用途，其特征在于，用于制備預防和/或治療抑郁癥的藥物；較佳地，所述藥物還用于降低外側韁核的神經元峰電位輸出和突觸效能。【文檔編號】A61K39/395GK104338135SQ201310347938【公開日】2015年2月11日申請日期:2013年8月9日優先權日:2013年8月9日【發明者】胡海嵐,李坤,周濤申請人:中國科學院上海生命科學研究院