一種側鏈修飾的長效glp-1類似物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了所述GLP-1類似物具有下列通式A：7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAW LVKGR G37通式A，其中，X13為蘇氨酸或側鏈修飾的賴氨酸（K-nX），X20為亮氨酸或側鏈修飾的賴氨酸（K-nX），X22為甘氨酸或側鏈修飾的賴氨酸（K-nX），X26為無側鏈修飾的賴氨酸(K-NH2)或側鏈修飾的賴氨酸（K-nX）；X13、X20，X22和X26中有且只有一個為賴氨酸K-nX，其中n=4～10，X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸。本GLP-1類似物能夠有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因為半衰期短而無法在臨床上使用的現狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領域較有應用前景。本發明還公開了所述GLP-1類似物的制備方法及其應用。
【專利說明】一種側鏈修飾的長效GLP-1類似物的制備方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及糖尿病相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及一種具有側鏈的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類的體內半衰期的GLP-1類似物。本發明還涉及該GLP-1類似物的制備方法以及其在制備糖尿病藥物中的應用。

【背景技術】
[0002]本發明涉及的GLP-1 (glucagon-1 ikepeptide-Ι,以下簡稱:GLP_1)是主要由小腸L細胞分泌的一種37個氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-1 (7-37) 0H和GLP-1 (7-36)NH2 (Mojsov S，J Clin Invest.1987Feb; 79 (2): 616-9)。GLP-1 明顯減低人用餐后的血糖，能刺激胰島素的產生，同時還能起到一定減肥效應，并且不會引起低血糖癥(Drucker D J，Diabetes.1998Feb; 47 (2): 159-69)。近期研究還表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker DJ，2003Dec; 144 (12):5145-8)。此外，因為GLP-1為完全人源化多肽，作為臨床藥物在安全上具有較大優勢。然而，GLP-1 (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘，每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便。
[0003]目前已經有不少研究采用GLP-1類似物融合蛋白技術解決GLP-1類似物在體內的存留時間(CN90101167.3、CN200710018734.2、CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7)，然而，
現有的技術與臨床理想的目標還有很大距離，普遍都還沒有達到臨床標準，最近NovoNorisk生產的利拉魯肽為GLP-1類似物，其對GLP-1進行了棕櫚酸的修飾，并于2009年于美國上市。但是利拉魯肽也存在半衰期短的問題，其劑型仍需每日注射。
[0004]因此，目前存在對解決GLP-1體內半衰期短的方法的需求。


【發明內容】

[0005]除非另外指出，本文所述的“Fmoc策略”是指以聚合物樹脂作為固相反應基質，將氨基端Fmoc保護的氨基酸在偶聯試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。其具體方法參見 Fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach, 2000, OxfordUniversity Press.
[0006]本發明的一個目的是針對臨床上GLP-1類似物在體內存留時間較短，需要每天注射給藥的缺限，提供一種半衰期較長的GLP-1的類似物。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種GLP-1類似物在制備治療糖尿病的藥物中的應用，以及該GLP-1類似物在制備治療和/或預防肥胖癥的藥物中的應用。
[0008]本發明的又一個目的是提供一種以GLP-1類似物作為有效成分的藥用組合物，其包含上述GLP-1類似物。其中，所述的藥物組合物還包含一種或多種藥學上可接受的輔料，并且所述藥物組合物優選為注射劑，進一步優選為凍干粉針或溶液注射劑。
[0009]用于實現上述目的的技術方案如下:
[0010]一方面，本發明提供一種GLP-1類似物，所述GLP-1類似物具有下列通式:
[0011]7haegt fx13sdv ssy x20e x22qaa x26efiaw lvkgr g37
[0012]其中，X13為蘇氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(K_nX)，X2CI為亮氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(1(-1^)，&2為甘氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(1(-1^)，&6為賴氨酸(K-NH2)或側鏈修飾的賴氨酸(K-nX) ;Χ13、Χ20, Χ22和Χ26中有且只有一個為側鏈修飾的賴氨酸(Κ-ηΧ)，其中η=4?10，X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸。
[0013]所述的具有通式的GLP-1類似物，具有下列通式1:
[0014]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (nX) EFIAff LVKGR G37
[0015](I)
[0016]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0017]優選地，所述GLP-1類似物為:
[0018]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0019]SEQ ID N02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0020]SEQ ID N03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GG)EFIAff LVKGR G37 ;或
[0021]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GGG)EFIAff LVKGR G37 ;或
[0022]SEQ ID N05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0023]SEQ ID N06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA A) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0024]SEQ ID N07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AA) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0025]SEQ ID N08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AAA) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0026]SEQ ID N09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0027]SEQ ID N010:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0028]SEQ ID N011:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV) EFIAff LVKGR G37 ;或
[0029]SEQ ID N012:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37。
[0030]另外所述具有通式的GLP-1類似物，也可以具有下列通式II:
[0031]7HAEGT FTSDV SSYLE K (nX) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0032](II)
[0033]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0034]優選地，所述GLP-1類似物為:
[0035]SEQ ID N013:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0036]SEQ ID N014:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0037]SEQ ID N015:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0038]SEQ ID N016:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0039]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0040]SEQ ID N018:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0041]SEQ ID N019:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0042]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0043]SEQ ID N021:7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0044]SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0045]SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0046]SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G37。
[0047]所述具有通式的GLP-1類似物，也可以具有下列通式III:
[0048]7HAEGT FTSDV SSY K (nX) Ε GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0049](III)
[0050]其中η=4?10，優選為η=5?8 ;Χ為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0051 ]優選地，所述GLP-1類似物為:
[0052]SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0053]SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0054]SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0055]SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0056]SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0057]SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0058]SEQ ID N031:7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0059]SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0060]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0061]SEQ ID N034:7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0062]SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0063]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV)E GQAA KEFIAff LVKGR G37。
[0064]所述具有通式的GLP-1類似物，也可以具有下列通式IV:
[0065]7HAEGT FK (nX) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0066](IV)
[0067]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0068]優選地，所述GLP-1類似物為:
[0069]SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0070]SEQ ID N038: 7HAEGT FK(GGGGG G)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0071]SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0072]SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0073]SEQ ID N041:7HAEGT FK (AAAAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0074]SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0075]SEQ ID N043: 7HAEGT FK (AAAAA AA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0076]SEQ ID N044:7HAEGT FK (AAAAA AAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0077]SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0078]SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0079]SEQ ID N047: 7HAEGT FK (VVVVV VV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
[0080]SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37。
[0081]另一方面，本發明提供上述GLP-1類似物的制備方法，所述制備方法包括Fmoc策略的固相多肽合成。
[0082]又一方面，本發明提供上述GLP-1類似物在制備治療糖尿病，肥胖癥及其相關疾病和預防肥胖癥的藥物中的應用。
[0083]并且，本發明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述GLP-1類似物和一種或多種藥學上可接受的輔料。
[0084]所述藥物組合物優選為注射劑，進一步優選為凍干粉針或溶液注射劑。
[0085]以下是本發明的詳細描述:
[0086](l)GLP-l 類似物
[0087]本發明所述的GLP-1類似物的通式如下:
[0088]通式:
[0089]7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAff LVKGR G37
[0090]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 為人源 GLP-1 序列，上述通式 A 的GLP-1類似物為人工序列，分別在第13、20、22或26位氨基酸上進行了修飾，由帶側鏈的賴氨酸K-nX取代了原有的氨基酸。其中11=4?10，乂可為617^1&，￥&1。
[0091]基于26位氨基酸突變為帶側鏈的賴氨酸K-nX通式可優選為:
[0092]通式1:
[0093]7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (nX) EFIAff LVKGR G37
[0094]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0095]基于22位氨基酸突變為帶側鏈的賴氨酸K-nX通式可優選為:
[0096]通式II:
[0097]7HAEGT FTSDV SSYLE K (nX) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0098]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0099]基于20位氨基酸突變為帶側鏈的賴氨酸K-nX通式可優選為:
[0100]通式III:
[0101]7HAEGT FTSDV SSY K (nX) Ε GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0102]其中η=4?10，優選為η=5?8 ;Χ為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0103]基于13位氨基酸突變為帶側鏈的賴氨酸K-nX通式可優選為:
[0104]通式IV:
[0105]7HAEGT FK (nX) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
[0106]其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸；
[0107](2)本發明的藥用組合物
[0108]本發明的含有GLP-1類似物可以與一種或多種藥學上可接受的輔料共同制成藥用組合物，這些輔料包括:水溶性填充劑、PH調節劑、穩定劑、注射用水、滲透壓調節劑等坐寸。
[0109]本發明所述的水溶性填充劑輔料為選自以下的一種或一種:甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。
[0110]PH調節劑為選自以下的一種或一種:枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀或氫氧化銨、碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機或無機酸和堿及鹽等。
[0111]穩定劑為選自以下的一種或一種:EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷。
[0112]滲透壓調節劑是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。
[0113](3)注射劑的制備方法
[0114]本發明的藥用組合物可以通過肌肉、靜脈內、皮下注射途經進行給藥，優選的劑型為凍干粉或溶液注射劑。
[0115]冷凍干燥注射劑的制備方法:取GLP-1類似物溶液適量，加入水溶性填充劑、穩定齊?、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在0-10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個規格含有GLP-1類似物在5 μ g至lj lmg之間。
[0116]注射液的制備方法:取GLP-1類似物溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、穩定齊IJ、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0.1-0.5%活性炭，在0-10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，封口即得，每個規格含有GLP-1類似物在5 μ g到lmg之間。
[0117](4)藥用組合物的用途
[0118]本發明的GLP-1類似物可以用在制備糖尿病治療藥物方面。具體地，本發明的組合物可以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式給藥。雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變，本發明的GLP-1類似物在相當寬的劑量范圍內是有效的。在成人的治療中，劑量范圍在5 μ g/人一lmg/人，每日一次或每幾日一次給藥。實際劑量應該由醫生根據有關的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態、給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應，患者癥狀的嚴重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發明的范圍。
[0119]本發明的GLP-1類似物克服了 GLP-1半衰期短的問題，所提供的GLP-1類似物在體內的半衰期可達到15?75小時以上，較單獨給藥的GLP-1的半衰期(半衰期僅為3-5分鐘)明顯延長，極大地便利了其臨床推廣和應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0120]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中:
[0121]圖1為實施例2中含GLP-1類似物(SEQ ID N01-12)的降血糖實驗；其中，圖1-A表示GLP-1類似物(SEQ ID NO 1-6)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ1-6及對照；圖1-B表示GLP-1類似物(SEQ ID N07-12)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ7-12及對照；
[0122]圖2為實施例3中含GLP-1類似物(SEQ ID N013-24)的降血糖實驗；其中，圖2-A表示GLP-1類似物(SEQ ID N013-18)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ13-18及對照；圖2-B表示GLP-1類似物(SEQ ID N019-24)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ19-24及對照；
[0123]圖3為實施例4中含GLP-1類似物(SEQ ID N025-36)的降血糖實驗；其中，圖3-A表示GLP-1類似物(SEQ ID N025-30)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ25-30及對照；圖3-B表示GLP-1類似物(SEQ ID N031-36)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ30-36及對照；
[0124]圖4為實施例5中含GLP-1類似物(SEQ ID N037-48)的降血糖實驗，其中，圖4-A表示GLP-1類似物(SEQ ID N037-42)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ37-42及對照；圖4-B表示GLP-1類似物(SEQ ID N043-48)的降血糖實驗，其中對應于每個時間點的七個數據條從左到右依次代表SEQ43-48及對照；
[0125]圖5為實施例6中描述了 GLP-1類似物在人血清中的穩定性的圖；
[0126]圖6為實施例7中描述了 GLP-1類似物在人血清中的穩定性的圖。
[0127]圖7為實施例8中描述了 GLP-1類似物在人血清中的穩定性的圖。

【具體實施方式】
[0128]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0129]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0130]實施例1:多肽的固相合成
[0131]使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSB1公司生產的CS336X型儀器進行本發明的多肽的合成。合成的方法按照生產商的儀器說明書進行。
[0132]將制得的多肽使用HPLC C18半制備柱進行純化，流動相為乙腈。經脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。
[0133]實施例2:GLP-1類似物(通式I)相關的降血糖功能
[0134]本實施例中，采用的多肽如下:
[0135]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0136]SEQ ID N02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G) EFIAff LVKGR G37 ；
[0137]SEQ ID N03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0138]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0139]SEQ ID N05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0140]SEQ ID N06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA A) EFIAff LVKGR G37 ；
[0141]SEQ ID N07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AA)EFIAff LVKGR G37 ；
[0142]SEQ ID N08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (AAAAA AAA) EFIAff LVKGR G37 ；
[0143]SEQ ID N09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0144]SEQ ID N010:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V) EFIAff LVKGR G37 ；
[0145]SEQ ID N011:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV) EFIAff LVKGR G37 ；
[0146]SEQ ID N012:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37 ；
[0147]將上述多肽各lmg溶于1ml生理鹽水制成多肽溶液，將此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/組，購自中科院上海實驗動物中心)，給藥30分鐘后將400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分別于葡萄糖注射后2小時、24小時、48小時、72小時及96小時測定小鼠的血糖(注:每次測血糖前兩個小時再次給相同劑量的葡萄糖)，結果見圖1，其中本實施例中的對照(空白)為向小鼠皮下注射生理鹽水，用量lml，葡萄糖的注射與其他試驗組相同。
[0148]實施例3 =GLP-1類似物(通式II)相關的降血糖功能。
[0149]本實施例中，采用的多肽如下:
[0150]SEQ ID N013:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0151]SEQ ID N014:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0152]SEQ ID N015:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0153]SEQ ID N016:7HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GGG) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0154]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0155]SEQ ID N018:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0156]SEQ ID N019:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0157]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0158]SEQ ID N021:7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0159]SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0160]SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0161]SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0162]將上述多肽各lmg溶于lml生理鹽水制成多肽溶液，將此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/組，購自中科院上海實驗動物中心)，給藥30分鐘后將400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分別于葡萄糖注射后2小時、24小時、48小時、72小時及96小時測定小鼠的血糖(注:每次測血糖前兩個小時再次給相同劑量的葡萄糖)，結果見圖2，其中本實施例中的對照(空白)為向小鼠皮下注射生理鹽水，用量lml，葡萄糖的注射與其他試驗組相同。
[0163]實施例4 =GLP-1類似物(通式III)相關的降血糖功能
[0164]本實施例中，采用的多肽如下:
[0165]SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0166]SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0167]SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0168]SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0169]SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0170]SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0171]SEQ ID N031:7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0172]SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0173]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0174]SEQ ID N034:7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0175]SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0176]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0177]將上述多肽各lmg溶于lml生理鹽水制成多肽溶液，將此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/組，購自中科院上海實驗動物中心)，給藥30分鐘后將400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分別于葡萄糖注射后2小時、24小時、48小時、72小時及96小時測定小鼠的血糖(注:每次測血糖前兩個小時再次給相同劑量的葡萄糖)，結果見圖3，其中本實施例中的對照(空白)為向小鼠皮下注射生理鹽水，用量lml，葡萄糖的注射與其他試驗組相同。
[0178]實施例5:GLP-1類似物(通式IV)相關的降血糖功能
[0179]本實施例中，采用的多肽如下:
[0180]SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0181]SEQ ID N038: 7HAEGT FK (GGGGG G) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0182]SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0183]SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0184]SEQ ID N041:7HAEGT FK (AAAAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0185]SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0186]SEQ ID N043: 7HAEGT FK(AAAAA AA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0187]SEQ ID N044:7HAEGT FK(AAAAA AAA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0188]SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0189]SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0190]SEQ ID N047: 7HAEGT FK(VVVVV VV)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0191]SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0192]將上述多肽各lmg溶于lml生理鹽水制成多肽溶液，將此多肽溶液皮下注射于小鼠(200 μ 1/只，6只/組，購自中科院上海實驗動物中心)，給藥30分鐘后將400微克葡萄糖注射于每只小鼠。分別于葡萄糖注射后2小時、24小時、48小時、72小時及96小時測定小鼠的血糖(注:每次測血糖前兩個小時再次給相同劑量的葡萄糖)，結果見圖4，其中本實施例中的對照(空白)為向小鼠皮下注射生理鹽水，用量lml，葡萄糖的注射與其他試驗組相同。
_3] 實施例6:GLP-1類似物在人血清中的穩定性測定
[0194]本實施例中，采用的多肽如下:
[0195]SEQ ID N01:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0196]SEQ ID N04:7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG GGG) EFIAff LVKGR G37 ；
[0197]用真空采血針(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血樣三份，而后立即于離心機上13000rpm離心20分鐘，取上層血清備用。
[0198]將上述兩條多肽及GLP-1標準品(購自上海生工公司，其序列為:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.lmg溶于0.5ml生理鹽水中，充分溶解后分別加入到lml血清中，將血清標記為空白組(0.lmg GLP-1溶于0.5ml生理鹽水中)、N01實驗組(0.lmg序列為SEQ ID N01的肽溶于0.5ml生理鹽水中)和N04實驗組(0.lmg序列為SEQID N04的肽溶于0.5ml生理鹽水中)。于37°C孵育0，0.1，0.3，2.5，5，10，15及24h后，分別取50 μ 1血清混合物，用GLP-1酶聯免疫檢測試劑盒(購自ALPCO Immunoassays)對各組血清進行檢測，于SpectraMax M5酶標儀上讀取吸光值，算出不同血清樣品中GLP-1類似物在不同時間點的濃度，結果見圖5。其中圓圈代表空白組，倒三角代表N01實驗組，正三角代表N04實驗組。結果表明Nol及No4實驗組的半衰期>24h。
_9] 實施例7 =GLP-1類似物在人血清中的穩定性測定
[0200]本實施例中，采用的多肽如下:
[0201]SEQ ID N017:7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0202]SEQ ID N020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37
[0203]用真空采血針(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血樣三份,而后立即于離心機上13000rpm離心20分鐘,取上層血清備用。
[0204]將上述多肽及GLP-1標準品(購自上海生工公司，其序列為:SEQ ID NO 49，HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.1mg溶于0.5ml生理鹽水中，充分溶解后分別加入到血清中，將血清標記為空白組(0.1mgGLP-1溶于0.5ml生理鹽水中)、N0.17實驗組(0.1mg序列為SEQ ID N017的肽溶于0.5ml生理鹽水中)和N020實驗組(0.1mg序列為SEQID N02520 的肽溶于 0.5ml 生理鹽水中)。于 37°C孵育 O, 0.5，I, 4，8，12，24，48，72 及 96h后，分別取50 μ I血清混合物,用GLP-1酶聯免疫檢測試劑盒(購自ALPCO Immunoassays)對各組血清進行檢測，于SpectraMax M5酶標儀上讀取吸光值，算出不同血清樣品中GLP-1類似物在不同時間點的濃度，結果見圖6。其中倒三角代表空白組，空心圓圈代表N0.17實驗組，實心圓圈代表N0.20實驗組。結果表明N0.17及N0.20實驗組的半衰期為48h。
[0205]實施例8 =GLP-1類似物在人血清中的穩定性測定
[0206]本實施例中，采用的多肽如下:
[0207]SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
[0208]SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37 ；
[0209]用真空采血針(BD B1sciences, Franklin Lakes, NJ)取志愿者血樣三份,而后立即于離心機上13000rpm離心20分鐘,取上層血清備用。
[0210]將上述多肽及GLP-1標準品(購自上海生工公司，其序列為:SEQ ID N049,HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG)各0.1mg溶于0.5ml生理鹽水中，充分溶解后分別加入到血清中，將血清標記為空白組(0.1mgGLP-1溶于0.5ml生理鹽水中)、N0.33實驗組(0.1mg序列為SEQ ID N033的肽溶于0.5ml生理鹽水中)和N036實驗組(0.1mg序列為SEQ ID N036的肽溶于0.5ml生理鹽水中)。于37°C孵育0，0.5，1，4，8，12，24及48h后，分別取50 μ I血清混合物,用GLP-1酶聯免疫檢測試劑盒(購自ALPCO Immunoassays)對各組血清進行檢測，于SpectraMax M5酶標儀上讀取吸光值，算出不同血清樣品中GLP-1類似物在不同時間點的濃度，結果見圖7。其中倒三角代表代表空白組，空心圓圈N0.33實驗組，實心圓圈代表N0.36實驗組。結果表明N0.33及N0.36實驗組的半衰期為24h。
【權利要求】
1.一種GLP-1類似物，所述GLP-1類似物具有下列通式:
7HAEGT FX13SDV SSY X20E X22QAA X26EFIAff LVKGR G37 其中，X13為蘇氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(K-nX)，X2tl為亮氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(K-nX)，X22為甘氨酸或側鏈修飾的賴氨酸(K-nX)，X26為無側鏈修飾的賴氨酸(K-NH2)或側鏈修飾的賴氨酸(K-nX) ；X13>X20, X22和X26中有且只有一個為側鏈修飾的賴氨酸(Κ-ηΧ)，其中η=4?10，X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸。
2.如權利要求1所述的GLP-1類似物，其特征在于，所述GLP-1類似物具有下列通式I:
7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(nX)EFIAff LVKGR G37
(I) 其中η=4?10，優選為η=5?8 ;Χ為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸； 優選地，所述GLP-1類似物為:
SEQ ID NOl I7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν02: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (GGGGG G)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν03: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GG)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν0417HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(GGGGG GGG)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν05: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν06: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA A)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν07: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AA)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν08: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK(AAAAA AAA)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν09: 7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV)EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID NOlO I7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV V)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID NOl II7HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VV)EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01217HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK (VVVVV VVV)EFIAff LVKGR G37。
3.如權利要求1所述的GLP-1類似物，其特征在于，所述GLP-1類似物具有下列通式II:
7HAEGT FTSDV SSYLE K(nX)QAAK EFIAff LVKGR G37
(II) 其中η=4?10，優選為η=5?8 ;Χ為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸； 優選地，所述GLP-1類似物為:
SEQ ID Ν01317HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν01417HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG G) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01517HAEGT FTSDV SSYLE K (GGGGG GG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01617HAEGT FTSDV SSYLE K(GGGGG GGG)QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01717HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID Ν01817HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA A) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν01917HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν020: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (AAAAA AAA) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID Ν02117HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV)QAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N022: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV V) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N023: 7HAEGT FTSDV SSYLE K (VVVVV VV) QAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N024:7HAEGT FTSDV SSYLE K(VVVVV VVV)QAA KEFIAff LVKGR G370
4.如權利要求1所述的GLP-1類似物，其特征在于，所述GLP-1類似物具有下列通式III:
7HAEGT FTSDV SSY K (nX)E GQAAK EFIAff LVKGR G37
(III) 其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸； 優選地，所述GLP-1類似物為:
SEQ ID N025: 7HAEGT FTSDV SSYK(GGGGG)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N026: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG G)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N027: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N028: 7HAEGT FTSDV SSYK (GGGGG GGG) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N029: 7HAEGT FTSDV SSYK(AAAAA)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N030: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA A)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N03117HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N032: 7HAEGT FTSDV SSYK (AAAAA AAA) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N033: 7HAEGT FTSDV SSYK(VVVVV)E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N03417HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV V) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N035: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VV) E GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N036: 7HAEGT FTSDV SSYK (VVVVV VVV) E GQAA KEFIAff LVKGR G37。
5.如權利要求1所述的GLP-1類似物，其特征在于，所述GLP-1類似物具有下列通式IV:
7HAEGT FK(nX)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37
(IV) 其中n=4?10，優選為n=5?8 ;X為甘氨酸、丙氨酸或纈氨酸； 優選地，所述GLP-1類似物為:
SEQ ID N037: 7HAEGT FK (GGGGG)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N038: 7HAEGT FK (GGGGG G) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N039: 7HAEGT FK (GGGGG GG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N040: 7HAEGT FK (GGGGG GGG) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N04117HAEGT FK (AAAAA)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N042: 7HAEGT FK (AAAAA A) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N043: 7HAEGT FK (AAAAA AA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N04417HAEGT FK (AAAAA AAA) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N045: 7HAEGT FK (VVVVV)SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ；
SEQ ID N046: 7HAEGT FK (VVVVV V) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N047: 7HAEGT FK (VVVVV VV) SDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G37 ;或
SEQ ID N048: 7HAEGT FK (VVVVV VVV) SDV SSYLE GQAA KEFIAff LVKGR G37。
6.如權利要求1-5中任一項所述的GLP-1類似物的制備方法，所述制備方法包括Fmoc策略的固相多肽合成。
7.如權利要求1-5中任一項所述的GLP-1類似物在制備治療糖尿病、肥胖癥及其相關疾病的藥物中的應用。
8.如權利要求1-5中任一項所述的GLP-1類似物在制備預防肥胖癥的藥物中的應用。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求1-5中任一項所述的GLP-1類似物和一種或多種藥學上可接受的輔料。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物優選為注射劑，進一步優選為凍干粉針或溶液注射劑。
【文檔編號】A61P3/10GK104262481SQ201310347849
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】孔維苓, 鄭學敏, 王玉麗, 徐為人, 湯立達, 龔珉 申請人:天津藥物研究院有限公司