一種重組大熊貓il-2免疫佐劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組大熊貓IL-2免疫佐劑的制備方法，本發明的重組大熊貓IL-2免疫佐劑一種效果顯著且又提取簡便，且能直接應用于生產及臨床應用的重組大熊貓IL-2(gpIL-2)免疫佐劑，提高犬瘟熱疫苗以及其他常規疫苗的免疫效果，控制疾病的發生與流行，保護大熊貓的健康。犬瘟熱素有“毀滅性傳染病”之稱，已成為威脅大熊貓種群數量和生命安全的首要烈性傳染病，嚴重影響了大熊貓的健康發展。本發明重組大熊貓IL-2(gpIL-2)免疫佐劑能顯著增強犬瘟熱疫苗免疫效果，對犬瘟熱的防治具有重要意義。
【專利說明】一種重組大熊貓IL-2免疫佐劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及的是一種重組大熊貓IL-2(gpIL-2)免疫佐劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]大熊貓被譽為中國的“國寶”，是世界級珍稀野生動物，然而它卻瀕臨滅絕，除了人為原因對大熊貓棲息地的破壞以外，疾病死亡成為當前大熊貓種群瀕危的關鍵原因之一。在大熊貓所患的40多種疾病中，犬瘟熱是威脅大熊貓種群數量和生命安全的首要烈性傳染病。疫苗免疫目前是預防控制CDV的主要措施，但當前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低與安全性差兩大難題。因此，在安全劑量疫苗接種下提高大熊貓機體的免疫力，成為當今疫苗開發研究的焦點。細胞因子是由免疫效應細胞和其他相關細胞產生，具有多種生物學活性，在免疫應答的產生和調節中具有重要作用。
[0003]白細胞介素2(IL_2)是白細胞介素家族中的重要成員，其被作為免疫佐劑增強疫苗免疫效果的報道屢見不鮮。
[0004]IL-2是T細胞生長因子，它最重要的作用是誘導T淋巴細胞增殖(從GO期進入S期)和分化。T細胞受多種刺激后能分泌IL-2，IL-2又作用于T細胞自身，誘導自身增殖、分化和發揮功能，這種作用稱為“自分泌作用”。IL-2能增強T細胞的殺傷活性，在體外與IL-4、IL-5和IL-6 —起共同誘導細胞毒性T細胞(TC)的產生，并使其活性大大增強，延長其生長期；在體內IL-2也能增強抗原誘導的TC活性，甚至可以輔助抗原和半抗原直接在裸鼠體內誘導產生TC。由IL-2誘導產生的TC輸入體內后可產生明顯抗腫瘤作用。
[0005]IL-2能誘導自然殺傷 細胞(NK細胞)增殖，增強NK細胞的活性，誘導淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL細胞)，并刺激它們產生細胞因子。NK細胞表面有IL-2R鏈，IL-2刺激NK細胞活化和增殖，并能促進NK細胞分泌IFN- Y，增加其表達IL-2R亞基等。高濃度的IL-2在體外還能誘導NK細胞來源、T細胞來源的LAK細胞增殖并促進其活性。
[0006]IL-2對B細胞的生長及分化均有一定的促進作用。能促使B細胞表達高親和力的IL-2R，其中α鏈由B細胞促分裂原誘導表達，而β鏈由IL_4或IL_6誘導表達。IL-2除了支持B細胞生長外，還能促進免疫球蛋白(IgM/IgG)的分泌，誘導J鏈合成從而加速IgM向著分泌IgG2轉換。IL-2能增強激活(感染、自身免疫病、腫瘤等)B細胞以及白血病細胞所產生的IL-2受體(IL-2R)的表達，并刺激其增殖和免疫球蛋白的生成:此外，IL-2還能刺激少突狀神經膠質細胞產生髓堿性蛋白，對該種細胞的增殖則呈雙向性調節。
[0007]在人和動物的細胞因子中，IL-2是最先搞清楚分子結構、受體組成和生物學功能的細胞因子，IL-2研究一直居于細胞因子的最前沿，其應用也是研究得最廣泛的。在動物醫學上，重組IL-2已在一些動物疾病的免疫預防、免疫治療和構建新一代基因工程苗等方面顯示出廣闊的應用前景。
[0008]IL-2因能增強機體的免疫水平，提高機體的抗病能力，因而用于細菌性、病毒性和寄生蟲性疾病的免疫治療。此外，IL-2還可影響藥物的代謝，使藥物的代謝時間延長，作用時間增加，從而提高藥物療效。是第一個為美國食品藥物管理局(FDA)認可用于治療癌癥的細胞因子藥物。張光勤用IL-2結合抗生素等藥物治療山羊痘病與鏈球菌混合感染，結果表明重組白細胞介素2是治療山羊痘與鏈球菌混合感染的有效藥物，可顯著提高山羊痘與鏈球菌混合感染的治愈率，并縮短其療程。秦翠麗等通過用白細胞介素-2對40例大腸桿菌病兔的治療試驗，治愈38只，死亡2只，治愈率為95%，表明白細胞介素-2對兔大腸桿菌病有顯著療效。李祥瑞將重組IL-2用于豬鏈球菌病的治療，取得了很好的效果。在寄生蟲方面,Lillehoj等報道,在E.1meriatenella或E.acervulina感染雞的前一天或感染后的第一天，用ConA活化雞淋巴細胞產生的細胞因子處理雞，可以明顯降低球蟲感染雞卵囊的排出量。

【發明內容】

[0009]本發明旨在提供一種效果顯著且又提取簡便，且能直接應用于生產及臨床應用的重組大熊貓IL-2(gpIL-2)免疫佐劑，提高犬瘟熱疫苗以及其他常規疫苗的免疫效果，控制疾病的發生與流行，保護大熊貓的健康。
[0010]本發明的技術方案如下:
[0011]一種重組大熊貓IL-2免疫佐劑的制備方法，包括以下步驟:
[0012]Al、大熊貓IL-2全基因克?。?br> [0013]All大熊貓外周血淋巴細胞體外培養；
[0014]無菌條件下采取健康大熊貓抗凝血2ml，置于EDTA_Na2真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀釋；緩慢加入4ml淋巴細胞分離液于稀釋后的大熊貓外周血中，2000r/min離心20min ;小心將白細胞移于另一試管,加等量RPMI1640液,2000r/min離心15min,去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗滌2次，去`上清；沉淀淋巴細胞用含10 μ g/mL ConA, 10%小牛血清、100 μ g/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMI1640液懸浮，取10 μ L細胞懸液計數，將細胞懸液稀釋至5 X IO6個/mL，分裝于細胞培養瓶中，CO2培養箱中37°C培養24h ；
[0015]A12 總 RNA 提??；
[0016]A13cDNA 的合成；
[0017]以上步抽提的總RNA為模板,按照Prime Script? RT reagent kit反轉錄試劑盒的操作步驟進行反轉錄；
[0018]A14引物的設計與合成；
[0019]根據GenBank中已報道的大熊貓IL_2cDNA序列,運用引物設計軟件01igo6.0設
計兩對擴增IL-2全基因的引物，具體序列如下表所示:
[0020]
引物名稱引物序列
Pl GAATTCATGTACAAAATGCAACTCT
[0021]
IL-2 P2 GTCGACTTAAGTCAGTGTTGAGAAGAT[0022]A15目的基因的PCR擴增；
[0023]以大熊貓基因組cDNA為模板，以IL-2P1/P2為引物進行PCR擴增；反應條件為:95°C預變性5min ;95°C變性40s，58°C退火40s，72°C復性50s，該步驟進行30個循環；72°C延伸IOmin ;于10°C保存；
[0024]A16目的基因PCR產物的TA克?。?br> [0025]A161目的片段的回收；
[0026]A162目的片段與克隆載體連接；
[0027]將上步回收的產物與pMD18-T Simple Vector進行連接，16°C連接過夜；
[0028]A163DH5 α感受態細胞的制備；
[0029]Α164連接產物的轉化；
[0030]Α17重組質粒的初步鑒定；
[0031]Α2、大熊貓白介素2的原核表達、多克隆抗體的制備；
[0032]Α21引物設計與合成；
[0033]根據大熊貓IL-2基因測序結果，運用01igo7.0設計一對引物:IL_2P1/P2 ;擴增編碼IL-2成熟肽的cDNA堿基序列；
[0034]
【權利要求】
1.一種重組大熊貓IL-2免疫佐劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: Al、大熊貓IL-2全基因克??； All大熊貓外周血淋巴細胞體外培養； 無菌條件下采取健康大熊貓抗凝血2ml，置于EDTA-Na2真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀釋；緩慢加入4ml淋巴細胞分離液于稀釋后的大熊貓外周血中，2000r/min離心20min ;小心將白細胞移于另一試管，加等量RPMI1640液,2000r/min離心15min,去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗滌2次，去上清；沉淀淋巴細胞用含10 μ g/mL ConA,10 %小牛血清、100 μ g/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMI1640液懸浮，取10 μ L細胞懸液計數，將細胞懸液稀釋至5X IO6個/mL，分裝于細胞培養瓶中，CO2培養箱中37°C培養24h ； A12總RNA提取； A13cDNA的合成； 以上步抽提的總RNA為模板,按照Prime Script? RT reagent kit反轉錄試劑盒的操作步驟進行反轉錄； A14引物的設計與合成； 根據GenBank中已報道的大熊貓IL_2cDNA序列，運用引物設計軟件01igo6.0設計兩對擴增IL-2全基因的引物，具體序列如下表所示: 引物名稱引物序列
Pl GAATTC ATGTACAA AATGCAACTCT
IL-2 P2 GTCGACTTA AGTCAGTGTTGAGAAGAT A15目的基因的PCR擴增； 以大熊貓基因組cDNA為模板，以IL-2P1/P2為引物進行PCR擴增；反應條件為:95°C預變性5min ;95°C變性40s，58°C退火40s，72°C復性50s，該步驟進行30個循環；72°C延伸IOmin ;于 10°C 保存； A16目的基因PCR產物的TA克隆； A161目的片段的回收； A162目的片段與克隆載體連接； 將上步回收的產物與PMD18-T Simple Vector進行連接，16°C連接過夜； A163DH5 α感受態細胞的制備； Α164連接產物的轉化； Α17重組質粒的初步鑒定； Α2、大熊貓白介素2的原核表達、多克隆抗體的制備； Α21引物設計與合成； 根據大熊貓IL-2基因測序結果，運用01igo7.0設計一對引物:IL-2P1/P2 ;擴增編碼IL-2成熟肽的cDNA堿基序列；
【文檔編號】A61K39/39GK103509815SQ201310362812
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】李德生, 朱玲, 張和民, 王承東, 易悅, 劉驍 申請人:四川臥龍國家級自然保護區管理局, 四川農業大學