一種人工軟組織及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種人工軟組織及其制備方法，該人工軟組織由具有流道結構的單層支架與實質細胞通過逐層堆積構成，在流道結構的內壁上還粘附有非實質細胞；其制備方法首先采用壓印方法結合光固化方法來制造具有流道結構的單層軟組織支架，在單層軟組織支架完成之后，利用打印方法向流道內注入明膠與非實質細胞的混合物，通過溫度控制使流道結構內的明膠固化起支撐作用，通過逐層累積最終形成立體結構，再將該立體結構置于35～45℃下，此時會有一部分內皮細胞，貼著流道結構內壁上，滿足了內皮細胞貼壁生長的條件，有利于生成血管，形成了人工軟組織。本發明采用了打印和壓印相結合，提高了重復性結構的制造效率，同時又能提高精細結構的成型精度。
【專利說明】一種人工軟組織及其制備方法【【技術領域】】
[0001]本發明涉及一種人工組織及支架的生物制造【技術領域】，具體涉及一種人工軟組織及其制備方法。
【【背景技術】】
[0002]軟組織工程通過將特定細胞種植在生物可降解支架上，在體外或體內構建出具有生物活性與功能的人工器官替代物，有望從根本上解決當前器官移植手術的供需矛盾。采取細胞打印技術，通過計算機輔助逐層堆積細胞或細胞基質等天然材料來制造三維器官，它可以個性化控制細胞分布和精確化控制細胞成型。但是，目前細胞打印采取的方法主要存在問題是逐點掃描、效率低，在重復性結構中顯得尤為突出。
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【發明內容】
】
[0003]為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種人工軟組織及其制備方法，采用打印和壓印技術相結合，來解決打印技術在制作重復性結構組織中的不足。
[0004]為達到上述目的，本發明一種人工軟組織的制備方法，包括以下步驟:
[0005]步驟I)通過計算機輔助設計出具有流道結構的單層軟組織支架模型，其中，單層軟組織支架模型的厚度T為1.5~3mm，流道結構寬度為0.5~2mm，深度為0.5~Imm ;
[0006]步驟2)制備步驟I)中的單層軟組織支架模型的物理模型，利用液態硅膠在真空條件下填充物理模型，真空負壓為0.05~0.15MPa，然后在常溫下靜置放置5~12小時使其固化，固化之后，脫模即可獲得流道結構負型，該流道結構負型的厚度為3~IOmm ;
[0007]步驟3)向成型槽內注入支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液，其中，支架材料或者支架材料與實質細胞的質量分數為I~10% ；
[0008]步驟4)使用步驟2)中制備的流道結構負型去壓成型槽內的支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液；
[0009]步驟5)在流道結構負型的上方采用光交聯固化方法使得支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液固化，以完成第一層具有流道結構的單層軟組織支架，然后分離流道結構負型，得到單層軟組織支架；
[0010]步驟6)向步驟5)中成型的單層軟組織支架的流道結構中填充滿明膠與非實質細胞的混合物水溶液，利用溫度控制使其固化，以完成該層流道結構的填充，其中，明膠與非實質細胞的質量分數為5~20%，固化前明膠與非實質細胞的混合物水溶液的溫度為32~380C，固化后其溫度為5~20°C ;
[0011]步驟7)在單層軟組織支架成型后，成型槽內的托盤下降距離H，重復上述步驟3)至步驟6)，以實現具有多層軟組織支架的成型，其中，距離H等于單層軟組織支架的厚度T，當第N層結構成型時，托盤需下降的距離為N*T，其中N > I ;
[0012]步驟8)當獲得需要的多層軟組織支架成型后，托盤向上移動，使成型后的多層軟組織支架取出，然后置于35~45°C溫度下，使多層軟組織支架流道結構內的明膠融化，即可獲得帶有流道結構的人工軟組織，其中，部分非實質細胞粘附于流道結構的內壁上。
[0013]本發明進一步改進在于:步驟2)中，利用快速成型、切削加工、電加工或激光加工技術制備單層軟組織支架模型的物理模型。[0014]本發明進一步改進在于:步驟2)中，所述液態硅膠為硅膠與交聯劑XR-500的混合物，其質量比為100:1.5~100:2。
[0015]本發明進一步改進在于:步驟3)中，所述的支架材料為殼聚糖、聚乙二醇或光固化膠原。
[0016]本發明進一步改進在于:步驟5)中，采用光交聯固化方法使得溶液固化時，光源與流道結構負型上表面的距離為O~80mm，紫外光的波長為350~400nm，光源強度為10~
2000麗/cm2。
[0017]本發明進一步改進在于:步驟6)中，為實現明膠與非實質細胞的混合物水溶液按需供量填充，先計算得出單層軟組織支架的流道結構體積為V，因此每次需向單層軟組織支架的流道結構內填充混合溶液的體積為V。
[0018]本發明的另一個目的，一種軟組織，其由具有流道結構的單層軟組織支架通過逐層堆積構成，支架內部分布著實質細胞，在所述流道結構的內壁上還粘附有非實質細胞。
[0019]本發明一種人工軟組織及其制備方法，采用打印與壓印技術相結合，并利用溫度控制和光固化方法來制造多層軟組織支架，在多層軟組織支架完成之后，利用溫度控制使壓印形成的流道結構內的明膠融化，形成可進一步用于體外培養或體內植入的人工軟組織，此時會有一部分內皮細胞，貼著流道壁，滿足了內皮細胞貼壁生長的條件，有利于生成血管。
[0020]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
[0021 ] 1、可以直接成型包含復雜空間微流道系統的人工軟組織。
[0022]2、模擬自然軟組織，有利于支架降解向自然組織的轉變。
[0023]3、采用了打印和壓印技術相結合，提高了重復性結構的制造效率和精細結構的制造精度。
[0024]4、每層軟組織支架的厚度與微流道結構的精度由流道結構負型決定，而流道結構負型則可通過先進制造技術如微制造、快速成形技術制造，自然器官血管系統內尺寸最小的毛細血管能夠達到5 μ m，其在微制造技術所能成形的尺度范圍內，而打印技術則可實現微觀血管系統與定制化宏觀外形的一體化成形。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0025]圖1是向成型槽注入支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液示意圖。
[0026]圖2是單層軟組織支架壓印示意圖。
[0027]圖3是在流道結構負型的上方采用光交聯固化方法使得溶液固化示意圖。
[0028]圖4是向流道結構內注入明膠與非實質細胞的混合物水溶液示意圖。
[0029]圖5是托盤下降距離H示意圖。
[0030]圖6是再次向成型槽注入支架材料水溶液或者支架材料與細胞的混合物水溶液示意圖。[0031]圖7是第二層單層軟組織支架壓印示意圖。
[0032]圖8是再次在流道結構負型的上方采用光交聯固化方法使得溶液固化示意圖。
[0033]圖9是再次向流道結構內注入明膠與非實質細胞的混合物水溶液示意圖。
[0034]圖10是托盤再次下降距離H示意圖。
[0035]圖11是托盤上移示意圖。
[0036]圖12是托盤上移后取出的多層人工軟組織示意圖。
[0037]圖13是最終成型的人工軟組織示意圖。
[0038]其中:1、成型槽；2、托盤；3、第一注射泵；4、支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液；5、流道結構負型；6、明膠與非實質細胞的混合物水溶液；7、第二注射泵。
【【具體實施方式】】
[0039]下面結合附圖對本發明進一步詳述描述。
[0040]參見圖1至圖13所示，本發明`一種人工軟組織的制備方法，包括以下步驟:
[0041]步驟I)采用計算機輔助軟件Pro/Engineer、SolidWorks或UG設計出具有流道結構的單層軟組織支架模型，其中，單層軟組織支架模型的厚度T為1.5~3mm，流道結構寬度為0.5~2臟，深度為0.5~I臟。
[0042]步驟2)利用快速成型、切削加工、電加工或激光加工技術制備步驟I)中的單層軟組織支架模型的物理模型，利用液態硅膠在真空條件下填充物理模型，真空負壓為0.05~
0.15MPa，然后在常溫下靜置放置5~12小時使其固化，固化之后，脫模即可獲得流道結構負型5，所述的流道結構負型5的厚度為3~IOmm ;其中，液態硅膠為硅膠與交聯劑XR-500的混合物，其質量比為100:1.5~100:2。
[0043]步驟3)用第一注射泵3向成型槽I內的托盤2上注入材料為殼聚糖、聚乙二醇或光固化膠原的支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液4，其中，支架材料或者支架材料與實質細胞的質量分數為I~10%,參見圖1所示。
[0044]步驟4)使用步驟2)中制備的流道結構負型5壓成型槽I內的支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液4,參見圖2所示。
[0045]步驟5)在流道結構負型5的上方采用光交聯固化方法使得支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液4固化，其中，光源與流道結構負型5上表面的距離為O~80mm,紫外光的波長為350~400nm,光源強度為10~2000mw/cm2,以完成第一層具有流道結構的單層軟組織支架，然后分離流道結構負型5，得到單層軟組織支架，參見圖3所
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[0046]步驟6)用第二注射泵7向步驟3)中成型的單層軟組織支架的流道結構中填充滿明膠與非實質細胞的混合物水溶液6，利用溫度控制使其固化，以完成該層流道結構的填充，其中，明膠與非實質細胞的質量分數為5~20%，固化前明膠與非實質細胞6的混合物水溶液的溫度為32~38°C，固化后其溫度為5~20°C，該步驟中，為實現明膠與非實質細胞的混合物水溶液6按需供量填充，先計算得出單層軟組織支架的流道結構體積為V，因此每次需向單層軟組織支架的流道結構內填充混合溶液的體積為V，參見圖4所示。
[0047]步驟7 )在單層人工軟組織成型后，成型槽I內的托盤2下降距離H，重復上述步驟3)至步驟6)，以實現具有多層軟組織支架的成型，其中，距離H等于單層軟組織支架的高度T，當第N層結構成型時，托盤需下降的距離為N*T，其中NS 1，參見圖5至圖10所示。
[0048]步驟8)當獲得需要的多層人工軟組織成型后，托盤向上移動，使成型后的多層人工軟組織取出，然后置于35~45°C溫度下，使多層人工軟組織支架流道結構內的明膠融化，即可獲得帶有流道結構的人工軟組織，其中，部分非實質細胞粘附于流道結構的內壁上。
[0049]參見圖11至圖13所示，將獲得的人工軟組織植入動物體內或經生物反應器培養再植入體內，即可得到所需的自然軟組織。
【權利要求】
1.一種人工軟組織的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)通過計算機輔助設計出具有流道結構的單層軟組織支架模型，其中，單層軟組織支架模型的厚度T為1.5~3mm，流道結構寬度為0.5~2mm，深度為0.5~Imm ; 2)制備步驟I)中的單層軟組織支架模型的物理模型，利用液態硅膠在真空條件下填充物理模型，真空負壓為0.05~0.15MPa，然后在常溫下靜置5~12小時使其固化，固化之后，脫模即可獲得流道結構負型，該流道結構負型的厚度為3~IOmm ; 3)向成型槽內注入支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液，其中，支架材料或者支架材料與實質細胞的質量分數為I~10% ； 4)使用步驟2)中制備的流道結構負型去壓成型槽內的支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液； 5)在流道結構負型的上方采用光交聯固化方法使得支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液固化，以完成第一層具有流道結構的單層軟組織支架，然后分離流道結構負型，得到單層軟組織支架； 6)向步驟5)中成型的單層軟組織支架的流道結構中填充滿明膠與非實質細胞的混合物水溶液，利用溫度控制使其固化，以完成該層流道結構的填充，其中，明膠與非實質細胞的質量分數為5~20%，固化前明膠與非實質細胞的混合物水溶液的溫度為32~38°C，固化后其溫度為5~20°C ; 7 )在單層軟組織支架成型后，成型槽內的托盤下降距離H，重復上述步驟3 )至步驟6 )，以實現具有多層軟組織支架的成型，其中，距離H等于單層軟組織支架的厚度T，當第N層結構成型時，托盤需下降的距離為N*T，其中N > I ; 8)當獲得需要的多層軟組織支`架成型后，托盤向上移動，使成型后的多層軟組織支架取出，然后置于35~45°C溫度下，使多層軟組織支架流道結構內的明膠融化，即可獲得帶有流道結構的人工軟組織，其中，部分非實質細胞粘附于流道結構的內壁上。
2.如權利要求1所述的人工軟組織的制備方法，其特征在于:步驟2)中，利用快速成型、切削加工、電加工或激光加工技術制備單層軟組織支架模型的物理模型。
3.如權利要求1所述的人工軟組織的制備方法，其特征在于:步驟2)中，所述液態硅膠為硅膠與交聯劑XR-500的混合物，其質量比為100:1.5~100:2。
4.如權利要求1所述的人工軟組織的制備方法，其特征在于:步驟3)中，所述的支架材料為殼聚糖、聚乙二醇或光固化膠原。
5.如權利要求1所述的人工軟組織的制備方法，其特征在于:步驟5)中，采用光交聯固化方法使得支架材料水溶液或者支架材料與實質細胞的混合物水溶液固化時，光源與流道結構負型上表面的距離為O~80mm，紫外光的波長為350~400nm，光源強度為10~2000麗/cm2。
6.如權利要求1所述的人工軟組織的制備方法，其特征在于:步驟6)中，為實現明膠與非實質細胞的混合物水溶液按需供量填充，先計算得出單層軟組織支架的流道結構體積為V，每次需向單層軟組織支架的流道結構內填充混合溶液的體積為V。
7.—種如權利要求1-6任一項的制備方法制備的人工軟組織，其特征在于:由具有流道結構的單層軟組織支架通過逐層堆積構成，在所述流道結構的內壁上還粘附有非實質細胞。
【文檔編號】A61F2/02GK103505304SQ201310426054
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】劉亞雄, 王振, 賀健康, 李滌塵, 連芩, 王玲, 靳忠民, 王滿毅 申請人:西安交通大學