靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法。靈芝子實體多糖注射劑的制備方法包括靈芝子實體多糖水提液的Severage法去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析純化、靈芝子實體多糖純品的制備、靈芝子實體多糖注射液的制備。靈芝子實體多糖有許多的生物活性，包括調節免疫功能、抗腫瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促進核酸與蛋白質生物合成等。但目前的靈芝多糖藥品多為口服藥劑，靈芝子實體多糖的活性會因口服而受到限制，而注射劑通過靜脈注射或腹腔注射能夠直接進入人體直接起藥效作用，是口服的藥效不可比擬的。目前市場上還沒有靈芝子實體多糖的注射劑，本發明開發的靈芝子實體多糖注射劑是安全的，可供醫學臨床應用。
【專利說明】靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法
[0001]【技術領域】本發明涉及一種注射劑及其制備方法，具體涉及一種靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法
【背景技術】靈芝(fefloofe/ma屬于擔子菌,多孔菌科目iPolyporaceae'),氣
芝科，靈芝屬，我國民間視其為神草仙藥，將子實體、孢子粉、菌絲入藥。最早的藥學著作《專著神農本草經》把靈芝列為上品，謂其“久味苦平，主治胸中結，益心氣，補中，增智慧，不忘，久服輕身不老”。靈芝具有抗癌、清除自由基、延緩衰老、增強免疫力、降低膽固醇、降血脂、降血糖、清除毒素等藥效。 [0002]現代醫學研究表明；靈芝的主要活性成分包括靈芝多糖、三萜化合物、生物堿、腺苷等，其中靈芝多糖(GLPS)是靈芝的主要活性成分之一。靈芝中有幾種活性成份已被分離與鑒定，如三萜類化合物、多糖、核苷、留醇類、生物堿。多糖是靈芝的主要活性成份。
[0003]多糖類物質易溶于熱水，但不溶于高濃度的有機溶劑，根據這個原理，提取多糖的主要方法熱水浸提法，一般是利用熱水溶解多糖，然后利用有機溶劑(乙醇)等作為介質將多糖沉淀下來，該法比較簡單，設備要求低，也可以用酶輔助法、超聲波或微波機械輔助方法提取。酶輔助法是利用纖維素酶或胰蛋白酶降解糖細胞內存在著的蛋白質、纖維素、果膠質等成分。超聲或微波的輔助也是熱水浸提的基礎之上，利用超聲或微波的機械剪切力作用破壞細胞壁，使多糖物質較為容易的釋放溶解入水中。超臨界流體萃取法是最近幾年研究的熱點方法，是利用超臨界二氧化碳萃取技術，此法對多糖結構破壞小，產品質量高，但是成本高，操作繁瑣。
[0004]靈芝多糖有許多的生物活性，包括調節免疫功能、抗腫瘤、抗感染、降血糖、降血月旨、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促進核酸與蛋白質生物合成等。
[0005]抗腫瘤活性:靈芝多糖具有抑制腫瘤生長，激活免疫細胞的作用，靈芝多糖雖然不能直接殺死腫瘤細胞，但是可以促進機體巨噬細胞的增殖，并能激活巨噬細胞吞噬癌變細胞的能力，同時也具有增強機體免疫反應及自然殺傷細胞的活性，進而起到抑制腫瘤細胞作用。
[0006]免疫調節功能:普遍認為靈芝多糖主要是通過直接或間接激活T細胞、B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞調控免疫應答、維持免疫平衡、誘導T細胞活性變化、維持細胞群及內環境的平衡穩定等而實現免疫調節功能。據報道靈芝多糖可明顯促進T細胞、B細胞、巨噬細胞的數量、活性和免疫應答等而實現其免疫調節功能。
[0007]清除自由基和抗衰老作用:許多疾病的發展都與人體自由基有密切關系，當人體自由基過多，就會對人體各種細胞器官造成損傷，所以控制體內自由基的數量對于維持人體健康具有十分重要的意義。據報道靈芝多糖有助于提高細胞的存活率，對四氧嘧啶引發的小鼠氧自由基損傷也有很好的保護作用。李明春等人報道靈芝多糖對小鼠細胞自由基的產生有抑制作用，并對PMA引起的自由基的產量有拮抗作用。靈芝多糖也具有抗衰老的作用，可以降低過氧化脂質的含量，同時也可以提高過氧化氫酶(CAT)的作用。
[0008]血管系統:靈芝多糖具有縮短小鼠血栓長度，減輕血栓重量的作用[]。此外靈芝的提取液能有效緩解心臟舒張功能障礙和防止在心肌缺血和再灌注時產生的不可逆心肌損傷。
[0009]降血糖、護肝，抗氧化及抗輻射:靈芝多糖可以明顯的降低小鼠血糖水平，同時，試驗也表明對肝損傷和腎損傷都有一定的保護和修復作用。此外，靈芝的熱水浸膏對抗輻射、 抗氧化、抗誘變等有較強的活性作用，而且熱水提取法對其活性幾乎沒有損失。靈芝多糖也能顯著提高人體淋巴結細胞的活性指數，對肝臟有很好的保護作用，對肝炎有一定的療效。 羅少洪在研究中也表明靈芝多糖對降血糖也具有很好的功效。另外，靈芝多糖還具有抗菌消炎、去火、修復細胞、延緩疲勞、抗毒素、降低膽固醇等活性作用。
[0010]
【發明內容】
本發明的目的在于提供一種靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法，為醫學應用提供更加有效的靈芝產品。
[0011]本發明的目的是通過以下技術方案實現的。
[0012]本發明的靈芝子實體多糖注射劑的制備方法，包括靈芝子實體多糖水提液去蛋白，純化、注射劑制備，其特征在于制備步驟如下:
(1)靈芝子實體多糖水提液去蛋白:把靈芝子實體水提物，放入烘箱105°C烘至恒重， 稱取靈芝子實體多糖粉于燒杯中，加入去離子水，其中靈芝子實體多糖粉與水的重量比為 1: 240~250，沸水水浴Ih后5000r/min離心20 min，取上清液，在旋轉蒸發儀中IOOr/ min，75°C濃縮至含水率為19%~20%，得靈芝子實體多糖濃縮物，將靈芝子實體多糖濃縮物用Sevage法進行脫蛋白處理，取脫蛋白處理后的上清液加入4~5倍體積的無水乙醇， 放置冰箱4°C過夜，5000r/min離心IOmin取沉淀物，并于烘箱105°C干燥；將烘干的干物質利用索氏提取器，在75°C下分別用丙酮、無水乙醚和無水乙醇回流6h，沉淀物105°C烘干， 獲得脫蛋白靈芝子實體多糖；所述Sevage試劑，即氯仿與乙醇體積比為5:1的混合液；所述將靈芝子實體多糖濃縮物進行脫蛋白處理，即往靈芝子實體多糖濃縮物中加入2倍重量的Sevage試劑，潤旋振蕩儀上3000r/min震蕩IOmin后，10000r/min離心IOmin,取上清液；加入重量為上清液2倍的Sevage試劑，渦旋振蕩儀上3000r/min震蕩IOmin后，1000Or/ min離心lOmin，取上清液，如此反復處理8次，得脫蛋白處理后的上清液；
(2)純化:
A、DEAE-52纖維素柱層析階段`性梯度洗脫:取步驟(1)制備的脫蛋白靈芝子實體多糖， 加入重量比為19~20:1的去離子水溶解，并用DEAE-52纖維素柱層析純化；層析柱的規格是2.6 X 60cm，裝柱高為35cm，先用去離子水洗柱，而后用濃度為0.lmol/L的NaCl溶液洗脫，最后用濃度為0.5mol/L的NaCl溶液進行洗脫，洗脫流速為1.3mL/min，每300s收集一管，每管6.5mL,計滴自動部份收集器自動收集洗脫液，取對應管號為28~44管的洗脫液，合并為DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫液；
B、靈芝子實體多糖純品的制備
取步驟A的DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫液用去離子水透析48h后，在旋轉蒸發儀中100r/min, 75°C濃縮至IOmL~20 mL,并加入4~5倍體積無水乙醇,醇沉,取沉淀物并105°C干燥，獲得靈芝子實體多糖純品；
(3)靈芝子實體多糖注射液的制備
取注射生理鹽水復溶靈芝子實體多糖純品，使溶液中靈芝子實體多糖濃度為2.1mg/ mL,按活性炭與生理鹽水的重量體積比(mg/mL)為0.04%,加入活性炭，沸水煮浴20min, 45 iim過濾后裝瓶滅菌。[0013]本發明使用的化學制劑均為分析純。
[0014]本發明還保護利用上述方法制備的靈芝子實體多糖注射劑。
[0015]本發明的優點:
靈芝具有抗癌、清除自由基、延緩衰老、增強免疫力、降低膽固醇、降血脂、降血糖、清除毒素等藥效。現代醫學研究表明，靈芝多糖(GLPS)是靈芝的主要活性成分。靈芝多糖有許多的生物活性，包括調節免疫功能、抗腫瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基、促進核酸與蛋白質生物合成等。目前，市場上的靈芝多糖藥品多為口服藥劑，靈芝多糖的活性會因口服而受到限制，而注射劑通過靜脈注射或腹腔注射直接進入人體，注射劑的藥效與口服藥劑的藥效是不可比擬的。
[0016]【具體實施方式】為了充分公開本發明的靈芝子實體多糖注射劑及其制備方法，以下結合實施例加以說明。
[0017]實施例1:一種靈芝子實體多糖注射劑的制備方法稱取脫蛋白的靈芝子實體多糖純品1.2g，溶在600mL的注射生理鹽水中，調節靈芝子實體多糖濃度為2.lmg/mL，加入
0.24mg活性炭，沸水煮浴20min，45 u m過濾后分裝于3mL安瓶，每瓶裝2mL，121°C濕熱高壓蒸汽滅菌30min，得供靜脈注射或腹腔注射用的靈芝子實體多糖注射劑。
[0018]將該靈芝子實體多糖注射劑于5°C冰箱中或室溫避光保存放置六個月，未見固體析出，注射液的澄清度檢查符合中國2010版藥典。
[0019]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種靈芝子實體多糖注射劑的制備方法，包括靈芝子實體多糖水提液去蛋白、純化、 靈芝子實體多糖注射液制備，其特征在于制備步驟如下:(1)靈芝子實體多糖水提液去蛋白:把靈芝子實體水提物，放入烘箱105°C烘至恒重， 稱取靈芝子實體多糖粉于燒杯中，加入去離子水，其中靈芝子實體多糖粉與水的重量比為 1: 240~250，沸水水浴Ih后5000r/min離心20 min，取上清液，在旋轉蒸發儀中IOOr/ min，75°C濃縮至含水率為19%~20%，得靈芝子實體多糖濃縮物，將靈芝子實體多糖濃縮物用Sevage法進行脫蛋白處理，取脫蛋白處理后的上清液加入4~5倍體積的無水乙醇， 放置冰箱4°C過夜，5000r/min離心IOmin取沉淀物，并于烘箱105°C干燥；將烘干的干物質利用索氏提取器，在75°C下分別用丙酮、無水乙醚和無水乙醇回流6h，沉淀物105°C烘干， 獲得脫蛋白靈芝子實體多糖；所述Sevage試劑，即氯仿與乙醇體積比為5:1的混合液；所述將靈芝子實體多糖濃縮物進行脫蛋白處理，即往靈芝子實體多糖濃縮物中加入2倍重量的Sevage試劑，潤旋振蕩儀上3000r/min震蕩IOmin后，10000r/min離心IOmin,取上清液；加入重量為上清液2倍的Sevage試劑，渦旋振蕩儀上3000r/min震蕩IOmin后，1000Or/ min離心lOmin，取上清液，如此反復處理8次，得脫蛋白處理后的上清液；(2)純化:A、DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫:取步驟(1)制備的脫蛋白靈芝子實體多糖， 加入重量比為19~20:1的去離子水溶解，并用DEAE-52纖維素柱層析純化；層析柱的規格是2.6 X 60cm，裝柱高為35cm，先用去離子水洗柱，而后用濃度為0.lmol/L的NaCl溶液洗脫，最后用濃度為0.5mol/L的NaCl溶液進行洗脫，洗脫流速為1.3mL/min，每300s收集一管，每管6.5mL,計滴自動部份收集器自動收集洗脫液，取對應管號為28~44管的洗脫液，合并為DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫液；B、靈芝子實體多糖純品的制備取步驟A的DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫液用去離子水透析48h后，在旋轉蒸發儀中100r/min, 75°C濃縮至IOmL~20 mL,并加入4~5倍體積無水乙醇,醇沉,取沉淀物并105°C干燥，獲得靈芝子實體多糖純品；(3)靈芝子實體多糖注射液的制備取注射生理鹽水復溶靈芝子實體多糖純品，使溶液中靈芝子實體多糖濃度為2.1mg/ mL,按活性炭與生理鹽水的重量體積比(mg/mL)為0.04%,加入活性炭，沸水煮浴20min, 45 iim過濾后裝瓶滅菌。
2.根據權利要求1所述的一種靈芝子實體多糖注射劑制備方法，其特征在于所述靈芝子實體多糖注射液的制備，稱取脫蛋白的靈芝子實體多糖純品1.2g，溶在600mL的注射生理鹽水中，調節靈芝子實體多糖濃度為2.lmg/mL,加入0.24mg活性炭沸水煮浴20min, 45iim過濾后分裝于3mL安瓶，每瓶裝2mL，12rC濕熱高壓蒸汽滅菌30min，得靈芝子實體多糖注射劑。
3.由權利要求1或2的方法制備的靈芝子實體多糖注射劑。
【文檔編號】A61P35/00GK103550147SQ201310564347
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】謝寶貴, 江玉姬, 何安樂, 肖淑霞, 李曄, 劉新銳, 鄧優錦 申請人:福建農林大學