一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因AhLPAAT1及其用途，屬于分子生物學和生物【技術領域】。本發明的AhLPAAT1具有SEQIDNO：1所示的基因cDNA核苷酸序列，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本發明的花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因具有改變植物組織尤其是種子中脂肪酸含量，并提高多聚不飽和脂肪酸比例的作用，在植物品種選育和農業生產領域具有廣泛的應用前景。本發明還涉及轉化有AhLPAAT1基因的轉基因植物。本發明還涉及所述AhLPAAT1基因用于改變植物種子脂肪酸含量及成分比例的方法。
【專利說明】一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和生物【技術領域】，更具體地，涉及一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因及其用途。
【背景技術】
[0002]油脂是油料作物籽粒的主要貯藏物質之一，種子油分含量的高低及其組成決定了油料作物的經濟價值。植物脂肪酸是植物油脂的主要成分，同時也是生物膜的重要組成部分，脂肪酸的組成對植物油的營養價值、食品加工用途及工業用途有重要影響，生物膜的脂肪酸組成還影響到植物膜系統有關的抗逆特性(黃冰艷等，河南農業科學，2009，9:75-78)。在植物種子中,脂肪酸主要以三酰甘油酯的形式存在(Somerville C and BrowseJj Science, 1991，252:80 - 87; Voelker T and Kinney AJj Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol, 2001, 52:335-361 )，其品質及用途也大多取決于其脂肪酸成分及含量。現在大多植物油用于人類食用，但是脂肪酸在工業生產上也具有重要用途，如潤滑劑、表面活性劑、包埋劑、聚烯類產品、醫療及理療產品和生物能源原料等。
[0003]通過鑒定已知植物產生的脂肪酸種類有200多種，這些脂肪酸在碳鏈的長度、雙鍵的位置及數目、生理功能作用等方面存在著差異。根據烴鏈的飽和程度，可將脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸。其中單不飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸又統稱為不飽和脂肪酸。根據烴鏈的長短，可將脂肪酸分為鏈長為4-7個碳的短鏈脂肪酸、鏈長為8-18個碳的中長鏈脂肪酸，以及鏈長為含有20或20個碳以上的超長鏈脂肪酸(盧善發，植物學通報，2000，17?):481-491)。不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸在植物界中，特別是高等植物中含量豐富，植物脂肪酸除含烯鍵外，可含炔鍵、羥基、酮基、環氧基和環戊基等。大部分用于食用的油料作物主要含有油酸(oleic acid，C18:l，A9)、亞油酸(linoleic acid, C18: 2，Λ 9，12)、亞麻酸(a-1inolenic acid, C18: 3，Λ 9，12，15)、硬月旨酸(stearic acid, C18:0)和棕櫚酸(palmitic acid, C16:0)等5種脂肪酸,而其他植物則含有在種類及含量上變化各異的脂肪酸。亞油酸和亞麻酸等多聚不飽和脂肪酸的營養價值和保健作用日益受到人們的關注。
[0004]高等植物中脂肪酸的生物合成是一個相當復雜的生化過程，其合成途徑首先發生在質體中，蔗糖一般作為種子中脂肪酸合成的主要碳源，經過糖酵解途徑轉變成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復合體的催化下被氧化成肪酸合成的前體乙酰CoA，在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA。然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA為底物進行連續的聚合反應，以每個循環增加兩個碳的方式合成碳鏈，進一步合成16至18碳的飽和脂肪酸。這些不斷增長的酰基碳鏈與酰基載體蛋白ACP結合，經過數次循環聚合，酰基-ACP硫脂酶或酰基轉移酶終止脂肪酸的合成。不同碳鏈長度的酰基-ACP于終止反應后在酰基CoA合成酶作用下合成酰基CoA，并從質體轉運到內質網或胞質中，再經多種酶的作用下進一步合成和修飾，其中有脂肪酸的去飽和超長鏈脂肪酸的合成及環氧化、羥化等。
[0005] 在油料作物種子中，從脂肪酸到甘油三酯TAG的合成是通過Kennedy途徑(Stymne S，et al., Biochim Biophys Acta, 752:198-208)進行，主要包括四大酶促反應。首先3-磷酸甘油(G-3-P)經3-磷酸甘油酰基轉移酶(G3PAT)作用合成溶血性磷脂酸(LAP)，隨后在溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)作用下形成磷脂酸(PA)，磷脂酸磷酸化酶(PAP)將磷脂酸(PA)脫磷酸化形成甘油二酯(DAG)，再被二酰甘油酰基轉移酶(DAGAT)催化合成甘油三酯(TAG)。甘油三酯的Sn-1和Sn-3的位置上通常被飽和脂肪酸占據，而不飽和脂肪酸通常占據Sn-2的位置。
[0006]大量的研究表明不同來源的G3PAT和DAGAT對酰基CoA的選擇性較小，而LPAAT則具有很強的底物選擇性，TAG的Sn-2位受LPAAT對酰基CoA的選擇特異性高度限制。例如從油菜和擬南芥中分離出來的質體LPAAT對16:0-CoA的偏好性遠遠高過18:1-CoA(Bourgis F，et al., Plant Physiol, 1999, 120: 913 - 921; Kim HU and Huang AHC,Plant Physiol, 2004，134:1206-1216; Yu B, et al., Plant Cell Physiol, 2004，45:503-510),而對從幾類不同植物中分離出來的胞質LPAAT進行研究表明對18:1-CoA的偏好性超過 16:0-CoA (Ohlrogge J and Browse J, Plant Cell, 1995; 7:957-970)。在油脂型種子的植物類型中Sn-2位置上有一些比較特殊的酰基CoA，表明這些植物當中含有另外一些對特殊的酰基CoA有活性的種子特異性的LPAAT (Cao YZ, et al.，PlantPhysiol, 1990, 94: 1199-1206; Laurant P and Huang AHC, Plant Physiol.1992,99:1711-1715; Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994, 26:211-223; FrentzenM, Fett Lipid.1998; 100:161-166)。一些植物成熟種子或其他組織來源的LPAAT基因也已經被分離克隆出來，包括椰子(Knutzon D S，et al., Plant Physiol, 1995,109:999-1006)、玉米(Brown A P, et al., Plant Mol Biol, 1994，26:211-223)、池花屬{Limnanthes) (Brown A P, et al., Plant Mol.Biol.29 (1995), 267 - 278)等。
[0007]不同來源的植物LPAAT由于其底物偏好性和功能的差別，使植物脂肪酸的合成呈多樣化，因此可通過生物工程途徑利用不同來源的基因有目地對植物進行有針對性的改良，從而改變植物脂肪酸的含量和成分，獲得穩定高產、滿足人類需求的優良新品種。鑒于植物油的提取工藝非常成熟，許多研究者已經將目光轉向油料作物的代謝工程，研究如何利用轉基因植物作“綠色細胞工廠”生產各種有用脂肪酸產品，具有重要的經濟價值和應用前景。

【發明內容】

[0008]發明人在已構建花生種子發育中期cDNA文庫的基礎上，通過設計簡并引物克隆得到花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因，該cDNA含有一個大小為1131bp的開放閱讀框(0RF)。開放閱讀框編碼376個氨基酸殘基的蛋白，AhLPAATl基因編碼的蛋白與GenBank中蓖麻、葡萄、擬南芥、玉米、水稻、北美云杉等物種的LPAAT相似性分別高達90 %、90%、85%、88%、83%、80%。
[0009]通過轉基因驗證花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因功能，與對照組比較，發現轉化了 基因的轉基因植株所產生的種子脂肪酸總含量下降，同時多聚不飽和脂肪酸的比例有不同程度的增加。由此驗證了基因可改變種子中脂肪酸的含量與成分比例。
[0010]本發明首先提供一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。所述基因的序列如下:
【權利要求】
1.一種花生溶血磷脂酸酰基轉移酶基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。
2.一種蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種含根據權利要求3所述的載體的重組細胞。
5.一種轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物轉化有根據權利要求1所述的核苷酸序列，或根據權利要求2所述的氨基酸序列，或根據權利要求3所述的載體，或感染有根據權利要求4所述的重組細胞。
6.一種根據權利要求1所述的核苷酸序列、根據權利要求2所述的氨基酸序列、根據權利要求3所述的載體或根據權利要求4的重組細胞在改變植物組織中的應用。
7.一種根據權利要求1所述的核苷酸序列、根據權利要求2所述的氨基酸序列、根據權利要求3所述的載體或根據權利要求4的重組細胞在制備轉基因植物或用于植物育種中的應用。
8.一種改變植物種子脂肪酸含量及成分，并提高種子多聚不飽和脂肪酸比例的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求1的核苷酸序列或權利要求3的載體轉化入植物，或包括用權利要求4的重組細胞感染植物。
9.一種改變植物組織或培養細胞的脂肪酸含量及成分，產生具有較高多聚不飽和脂肪酸比例的轉基因植物，或轉基因愈傷組織組織，或轉基因細胞的方法，所述方法包括以下步驟: S1.將權利要求1的核苷酸序列和/或權利要求3的載體轉化入植物組織或細胞，或用感染有權利要求4的重組細胞感染植物組織或細胞； S2.利用所述植物組織或細胞再生轉基因植物； 所述植物包括雙子葉植物、單子葉植物及藻類植物，特別是擬南芥、花生、大豆、油菜、油茶、麻瘋樹、芝麻、向日葵、橄欖、玉米、水稻、小麥、油藻。
【文檔編號】C12N9/10GK103725700SQ201310725260
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】黎茵, 黃上志, 劉琛, 顏瑞卿 申請人:中山大學