一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，所述天然多種形態砷的提取液組合物包括天然多種形態砷的提取液和以下至少一種的抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括：喜樹堿、長春堿、長春新堿、紫杉醇、腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素、轉化生長因子-β、脂多糖、即佛波酯、腺苷酸環化酶激活劑和骨形態發生蛋白4，其中天然多種形態砷的提取液重量占所制成的藥物總重量的0.001～99.9%，所述天然多種形態砷的提取液組合物可用來制備抗腫瘤干細胞、抗乙肝和抗艾滋病病毒的藥物。本發明能夠抑制乙肝和抗艾滋病等病毒，為天然砷劑的開發利用擴展了應用范圍。
【專利說明】—種天然多種形態砷的提取液組合物的應用
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用。
【【背景技術】】 [0002]腫瘤是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤，盡管放化療和手術方法不斷進展，但是病死率仍然較高。例如，作為常見類型非小細胞肺癌(non-small cell lungcancer, NSCLC)總的5年生存率仍不足15%。基于腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)學說認為，具有自我更新和無限增殖能力的腫癌干細胞是腫癌發生和復發的“根源”(公開文獻為:楊明.納米雄黃對肺癌和肝癌細胞及其腫瘤干細胞的凋亡誘導作用.[D].蘭州大學博士學位論文:蘭州.2010，PlO~15)。為此，針對抑制腫癌干細胞的藥物篩選策略，將是目前腫癌治療的一條新途徑。
[0003]隨著研究的深入，砷劑(包括As2O3和雄黃)又重新受到關注，一度因為毒性較大而不被重用As2O3，被發現可以通過降低癌蛋白PML水平來消除白血病干細胞LICs，其可能通過消除LICs治愈包括粒系統、淋巴系統的惡性腫瘤(公開文獻為:Zhang Xff, Yan XJ, ZhouZR, et al.Arsenic Trioxide Controls the Fate of the PML-RAR Oncoprotein byDirectly Binding PML.Science[J], 2010, 328:240-243)，最近也發現，納米雄黃可以有效誘導肺癌和肝癌干細胞發生凋亡。與As2O3相比，天然砷劑具有資源豐富、價格低廉、可以口服使用等特點，但是在多靶點、抑制腫瘤干細胞的效應、范圍以及作用廣度上，As2O3都表現出了更強的藥物效應。這一差距，也引發國內有關學者，針對天然砷劑的藥效物質是粗糙的原粉還是體內代謝砷的爭論。現代分析證明:砷在動物體內的代謝產物，可能存在多種砷代謝物種，包括:148111、1々8￥、—￥、0麻￥等(公開文獻如下:許琚輝，王洪瑋，崔蓉等.雄黃及含雄黃中成藥中砷的形態分析[J].藥物分析雜志，2007，27 (3):395~396 ;張景紅，李紅玉.高效毛細管電泳法測定雄黃微生物炮制液中砷形態成分[J].時珍國醫國藥，2011.22
(2):409~410)，為此，利用現代生物技術，體外仿生代謝天然砷礦粉，產生多種與體內代謝相同或不同的形態的天然可溶解砷，組成組合物，代替價格昂貴，臨床使用肝腎毒性加大，難以普及的三氧化二砷注射液，作為現有一線抗癌砷劑三氧化二砷的補充或替代品，將是天然砷劑研究的一個重要方向。
[0004]本發明人課題組的研究發現，海洋微生物代謝并溶解的各種形態砷，其在動物組織中砷蓄積毒性大幅度降低，在動物體內幾乎沒有分布(公開文獻如下:張景紅，樊秦，李紅玉.雄黃及微生物炮制液砷形態和毒性分析[J].中藥材，2010，11(5):283-285)。與此同時，體內外藥理活性試驗表明，海洋微生物多形態代砷化合物，不僅可以誘導多藥耐藥白血病細胞凋亡，而且可以下調MDRl/P-gp耐藥基因，達到其逆轉多藥耐藥的作用(公開文獻如下:張景紅，李紅玉.雄黃微生物提取液對K562/ADM細胞P-pg蛋白和MDRI基因表達的影響[J].中國臨床藥理學與治療學，2009，14(8):855~861)。而且更重要的是，其誘導效應強于同類砷劑亞砷酸。所以，亞砷酸(As2O3在水中溶解的主要形式)并非是逆轉腫瘤多藥耐藥作用的唯一活性物質，從天然礦物資源中開發多種形態的代謝砷作為As2O3的重要補充，將是極有應用前景的藥物開發方向。
[0005]在我國雖有天然砷例如，雄黃礦(As2S3)、雌黃(As2S3)和雄黃礦(As2O3、雞冠石)等含量豐富，而且已經作為臨床藥物在治療腫瘤、寄生蟲、皰疹病毒等方面取得顯著的療效。但是現代報道的制劑工藝包括水飛+醋制、納米化和微粉化等方法，得到僅僅是混懸液，無法滿足現在藥物制劑的要求，本發明課題組公開中國發明200610200067.5專利，也成功利用多種冶金用嗜酸性硫桿菌，提取雄黃產生含有包含砷酸(III，V)、甲基MMA (V)和大量的輔助元素(鐵和鐵的化和物)的混合提取液(公開文獻如下:李紅玉，張景紅，支德娟.礦物藥中的重金屬去除方法.中國專利[P]:200610200067.5,2006-1-02.)，這些方法雖然可以得到含有部分形態砷的混合液，但是由于混合有部分其他成分，目前無法確定其確切的活性成分，無法和其他藥物或者輔料組成復合物，加之其體外抑制肺癌和肝癌等腫瘤細胞的作用，明顯低于As2O3，而且更重要的是，目前尚未見到其可以同時抑制腫瘤干細胞、乙肝和艾滋病病毒的類似作用。
[0006]為了得到多種天然多種形態、可溶解砷的組合物， 申請人:在申請號為201010580193.4的中國發明專利公開了一種海洋微生物提取天然、多形態、抑制腫瘤的含砷化合物提取液的制備方法及其應用，其中利用 申請人:自主分離的多種海洋微生物，代謝雄黃礦(As203、As4S4)和或者雌黃礦(As2S3)得到含砷酸(AsII1、AsV)、亞砷酸(V)、一甲基砷酸MMA (II1、V)、二甲基砷酸DMA (II1、V) (DMA)、一甲基一硫代砷酸MMTA、二甲基二硫代砷酸DMDTA、三甲基胂氧(TMAO)、砷硼燒(AsB, arsenobetaine)和砷膽堿(AsC)等的多種天然多形態砷的提取液。 【
【發明內容】
】
[0007]本發明要解決的技術問題，在于提供一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，能夠抑制乙肝和抗艾滋病等病毒，為天然砷劑的開發利用擴展了應用范圍。
[0008]本發明是這樣實現的:
[0009]一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，所述天然多種形態砷的提取液組合物包括天然多種形態砷的提取液和以下至少一種的抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括:喜樹堿、長春堿、長春新堿、紫杉醇、腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素、轉化生長因子、月旨多糖、即佛波酯、腺苷酸環化酶激活劑和骨形態發生蛋白4，其中天然多種形態砷的提取液重量占所制成的藥物總重量的0.001~99.9%，所述天然多種形態砷的提取液組合物可用來制備抗腫瘤干細胞、抗乙肝和抗艾滋病病毒的藥物。
[0010]進一步地，所述天然多種形態砷的提取液組合物中含有砷酸(AsIII)、砷酸(AsV)和或一甲基砷酸MMA (III)—甲基砷酸MMA (V)和或二甲基砷酸DMA (III)、二甲基砷酸DMA (V)和或一甲基一硫代砷酸MMTA和或二甲基二硫代砷酸DMDTA和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷膽堿(AsC);且上述化合物的重量之和占藥物總重量的0.001~99.9%。
[0011]進一步地，所述天然多種形態砷的提取液組合物可以添加藥學上可以接受的輔料制備成軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、顆粒劑、注射劑或者粉針劑、口服液、微囊劑、滴丸劑、氣霧劑和栓劑制劑，經口服、注射或直腸方式給藥。
[0012]本發明具有如下優點:[0013](I)本發明利用具有仿生代謝能力的特殊海洋微生物對天然藥物含砷礦物進行微生物提取，從而得到多種與體內代謝相同或者不同的，具有減毒、增效的多種天然形態砷組合的提取液，再加上喜樹堿(camptothecin)、長春堿(VLB)、長春新堿(VCR)、紫杉醇(Taxol )、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(interleukin, IL-6)、干擾素(IFN)、轉化生長因子-β (TGF-β)、脂多糖(LPS)、即佛波酯(TPA)、腺苷酸環化酶激活劑(Forskolin)和骨形態發生蛋白4 (ΒΜΡ-4)等配伍組成組合物，該組合物顯示了強效的抑制肺癌干細胞、乙肝和艾滋病病毒的藥物作用，其藥物效應明顯高于陽性藥物As2O3溶液，這一優勢，為篩選新型的、可以替代As2O3的高效、低毒的砷劑提供了很好的基礎。
[0014](2)本發明提取液組合物可以同時含有含砷酸(AsII1、AsV)、亞砷酸(V)和或一甲基砷酸MMA (II1、V)和或二甲基砷酸DMA (III, V) (DMA)和或一甲基一硫代砷酸MMTA和或二甲基二硫代砷酸DMDTA和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB，arsenobetaine)和或砷膽堿(AsC)等多種可溶性砷形態成分，與納米雄黃和采用多種冶金用嗜酸性硫桿菌制得雄黃微生物混合浸出液相比，其具有獨特的抑制腫癌干細胞效應，而且本發明提取液在抑制腫瘤干細胞的同時，又具有良好的抑制乙肝和艾滋病的作用，顯示了良好的藥物開發前景。
【【具體實施方式】】
[0015]本發明涉及一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，所述天然多種形態砷的提取液組合物包括天然多種形態砷的提取液和以下至少一種的抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括:喜樹堿、長春堿、長春新堿、紫杉醇、腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素、轉化生長因子_β、脂多糖、即佛波酯、腺苷酸環化酶激活劑和骨形態發生蛋白4，其中天然多種形態砷的提取液重量占所制成的藥物總重量的0.001~99.9%，所述天然多種形態砷的提取液組合物可用來制備抗腫瘤干細胞、抗乙肝和抗艾滋病病毒的藥物。
[0016]所述天然多種形態砷的提取液組合物中含有砷酸(AsIII)、砷酸(AsV)和或一甲基砷酸MMA (III)—甲基砷酸MMA (V)和或二甲基砷酸DMA (III)、二甲基砷酸DMA (V)和或一甲基一硫代砷酸MMTA和或二甲基二硫代砷酸DMDTA和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷膽堿(AsC);且上述化`合物的重量之和占藥物總重量的0.001~99.9%。
[0017]所述天然多種形態砷的提取液組合物可以添加藥學上可以接受的輔料制備成軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、顆粒劑、注射劑或者粉針劑、口服液、微囊劑、滴丸劑、氣霧劑和栓劑制劑，經口服、注射或直腸方式給藥。
[0018]以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0019]實施例一、制備天然多種形態砷的提取液
[0020]按照申請號為201010580193.4，
【公開日】為2011-04-20的發明專利公開的一種海洋微生物提取天然、多形態、抑制腫瘤的含砷化合物提取液的制備方法及其應用中所述的制備方法處理雄黃礦(As2O3，含量36%、As4S4，含量62%)和或者雌黃礦(As2S3, 72%，AsC，25%)礦粉，實施方案具體包括如下步驟:
[0021]步驟1:將砷化礦粉20g，粉碎至200目后，按照1:100(重量和混合液體積比)加入lmol/L的硫酸和15%三氯化鐵的組成的混合液(體積比8:2)中，然后在轉速為180r/min、溫度為30°C的恒溫搖床中培養15d，得到提取液；將提取液用孔徑為0.45 μ m的濾膜過濾，得到濾液；所述濾液在溫度為20°C、磁力攪拌轉速為800~lOOOr/min的條件下進行反應沉淀，2min后過濾，得到沉淀物；然后沉淀物用去離子水洗滌后，在60°C溫度下干燥，即得用微生物代謝超微粉體細粉。
[0022]步驟2:稱取步驟I所得超細粉0.1g,于滅菌后的250mL錐形瓶中，加入LA液體培養基90mL，接種體積分數為20%的組合優選海洋微生物菌種，然后在30°C、pH為5.0振蕩速度為180r/min時搖瓶浸出15d ;定時進行處理液中含砷酸(AsII1、AsV)、亞砷酸(V)、一甲基砷酸MMA (II1、V)、二甲基砷酸DMA (II1、V) (DMA)、一甲基一硫代砷酸麗TA、二甲基二硫代砷酸DMDTA、三甲基胂氧(ΤΜΑ0)、砷硼燒(AsB, arsenobetaine)和砷膽堿(AsC)等檢測，當上述多種成分的總含量達到要求后停止震蕩培養，13000r/min離心后取上清液，再過濾除菌后，所得上清液就是含有天然多種形態砷的提取液。
[0023]所述的含量檢測方法為:毛細管電泳分離法:條件為:BGE:PDC/1Ommo1.L—1和CTAOH/Immo1.L-1、電壓25KV、溫度25°C、pHll.0、紫外檢測波長設定在216nm。
[0024]所述的天然多種形態砷的提取液A:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V) 15%;亞砷酸(III) 3.5%;甲基砷酸(III) 1.5%,甲基砷酸(V) 12.5%;二甲基砷酸(DMA) 3 %;三甲基胂氧(TMAO) 7.5 %;砷硼烷砷硼烷(AsB ) 2 %;砷膽堿(AsC) 5 %。其制備方法按照實施例1制備，采用的砷化礦粉為雄黃礦(As2O3，含量36%、As4S4，含量62%)，優選海洋微生物組合為:A (海水產堿菌):0 (黃色短桿菌):B(糞產堿桿菌)為5:2:3 (體積比)。
[0025]所述的天然多種形態砷的提取液B:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V) 7.5% ;亞砷酸(III) 3.5% ;甲基砷酸(III) 1.5%,甲基砷酸(V) 12.5% ;一甲基一硫代砷酸MMTA3.5% ;二甲基二硫代砷酸DMDTA4% ;二甲基砷酸(DMA) 3% ;三甲基胂氧(TMAO) 7.5% ;砷硼烷砷硼烷(AsB) 2% ;砷膽堿(AsC) 5%。其制備方法按照實施例1制備，采用的砷化礦粉為雄黃礦(As2O3,含量36%、As4S4,含量62%)，優選海洋微生物組合為:A(海水產堿菌):0 (黃色短桿菌):B(小克銀漢霉)為8:3:5 (體積比)。
[0026]所述的天然多種形態砷的提取液C:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V) 25% ；;亞砷酸(III) 12.5% ;甲基砷酸(III) 12.5%,甲基砷酸(V) 20% ；二甲基砷酸(DMA) 10% ;三甲基胂氧(TMAO) 5% ;砷硼烷砷硼烷(AsB) 5 % ;砷膽堿(AsC)
9.99%。其制備方法按照實施例1制備，采用的砷化礦粉為雄黃礦(As2O3,含量36%、As4S4,含量62%)，優選海洋微生物組合為:A (海水產堿菌):0 (黃色短桿菌):B (新月柄桿菌)為7:1:6 (體積比)。
[0027]實施例二:制備天然多種形態砷的提取液組合物
[0028]取藥物包括:喜樹堿(camptothecin,3umol/L)、長春堿(VLB,0.2ug/mL)、長春新 M (VCR, 0.16ug/mL)、紫杉 II (TaxoI, lumol/L)、腫瘤壞死因子(TNF, 25ng/ml)、白細胞介素(interleukin, IL-6, 10ng/ml)、干擾素(IFN, 10ng/ml)、轉化生長因子-β (TGF-β，2.5ng/ml)、脂多糖(LPS，lug/mL)、即佛波酯(TPA, 20ng/ml)、腺苷酸環化酶激活劑(Forskolin, 20ng/ml)和骨形態發生蛋白4 (BMP-4,10ng/ml)等中的任意一種藥物溶液lOOul，加入0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(Tris-HCL)至lmL，80°C水浴煮I個小時后，離心過濾后，按照藥物提取液:天然多種形態砷的提取液(1:2，體積比)，加入實施例1中所制的天然多種形態砷的提取液A或者B或者C，濾液加入裂解酶50ul (濃度為0.0167u/mL)，37°C，酶促反應2小時，收集濾液用0.45um的濾膜濾過，即得含有天然多種形態砷的提取液的組合物。
[0029]其中所述裂解酶為:B-葡萄糖苷酶、P450酶(CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4 和 CYP3A5)、谷胱甘肽 S —轉移酶(GST)、N —乙酰化轉移酶(NAT)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)、環氧化物水解酶(EH)、硫酸轉移酶、乙酰轉移酶和甲基轉移酶、兒茶酚氧位甲基轉移酶、酯酶、羥化酶黃素單加氧酶(FMO)、單胺氧化酶(MAO)和酮還原酶的任意一種。
[0030]其中，當天然多種形態砷的提取液組合物含有提取液A時，采用的裂解酶為B-葡萄糖苷酶，組合物中砷酸(V) 15%;亞砷酸(111)3.5%;甲基砷酸(III) 1.5%,甲基砷酸(V)12.5% ;二甲基砷酸(DMA) 3% ;三甲基胂氧(TMAO) 7.5% ;砷硼烷砷硼烷(AsB) 2% ;砷膽堿(AsC) 5%。其含砷化合物總量占提取液組合物中藥物總量的50% (重量百分比)。其中，當天然多種形態砷的提取液組合物含有提取液B時，采用的裂解酶為B-葡萄糖苷酶和〇￥?3六4，組合物中含有砷酸(￥)7.5%;亞砷酸(III) 3.5%;甲基砷酸(III) 1.5%,甲基砷酸(V) 12.5%;—甲基一硫代砷酸MMTA3.5% ;二甲基二硫代砷酸DMDTA4% ;二甲基砷酸(DMA)3% ;三甲基胂氧(TMAO) 7.5% ;砷硼烷砷硼烷(AsB) 2% ;砷膽堿(AsC) 5%。其含砷化合物總量占提取液組合物中藥物總量的的50% (重量百分比)。 (重量百分比)。
[0031]其中，當天然多種形態砷的提取液組合物含有提取液C時，采用的裂解酶為B-葡萄糖苷酶和CYP3A4，組合物中含有砷酸(V) 25% ;亞砷酸(III) 12.5% ;甲基砷酸(III)
12.5%,甲基砷酸(V) 20% ; 二甲基砷酸(DMA) 10% ;三甲基胂氧(TMAO) 5 % ;砷硼烷砷硼烷(AsB) 5% ;砷膽堿(AsC) 9.99%。其含砷化合物總量占提取液組合物中藥物總量的的99.99% (重量百分比)。(重量百分比)。
[0032]實施例三、天然多形態砷的提取液組合物藥效學評價實驗例
[0033]1、以下實驗例中，受試樣品:含有提取液B的天然多種形態砷的提取液組合物:
[0034]組合物1:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V，1.5nM)；亞砷酸(ΙΙΙ，0.7nM);甲基砷酸(ΙΙΙ，0.3nM)，甲基砷酸(V，2.5nM); 一甲基一硫代砷酸(0.7nM) ;二甲基二硫代砷酸DMDTA (0.8nM) ;二甲基砷酸(DMA，(λ 6M);三甲基胂氧(ΤΜΑ0，1.5nM);砷硼烷(AsB，0.4nM);砷膽堿(AsC，InM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:腫瘤壞死因子(TNF，25ng/ml)，其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0035]組合物2:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V，1.5nM)；亞砷酸(ΙΙΙ，0.7nM);甲基砷酸(ΙΙΙ，0.3nM)，甲基砷酸(V，2.5nM); 一甲基一硫代砷酸(0.7nM) ;二甲基二硫代砷酸DMDTA (0.8nM) ;二甲基砷酸(DMA，(λ 6M);三甲基胂氧(ΤΜΑ0，1.5nM);砷硼烷(AsB，0.4nM);砷膽堿(AsC，InM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:白細胞介素(interleukin, IL-6, 10ng/ml),其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0036]組合物3:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V，1.5nM)；亞砷酸(ΙΙΙ，0.7nM);甲基砷酸(ΙΙΙ，0.3nM)，甲基砷酸(V，2.5nM);—甲基一硫代砷酸(0.7nM) ;二甲基二硫代砷酸DMDTA (0.8nM) ;二甲基砷酸(DMA，(λ 6M);三甲基胂氧(ΤΜΑ0，
1.5nM);砷硼烷(AsB，0.4nM);砷膽堿(AsC，InM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:喜樹堿(camptothecin, 3umol/L),其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0037]陽性對照組合物I’:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為=As2O3(砷酸V, 5nM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:腫瘤壞死因子(TNF，25ng/ml),其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0038]陽性對照組合物2’:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為=As2O3 (砷酸V, 5nM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:白細胞介素(interleukin,IL-6, 10ng/ml)，其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0039]陽性對照組合物3’ =As2O3 (砷酸V，5nM);每單位制劑中其他藥物的含量組成經檢測得到為:喜樹堿(camptothecin, 3umol/L),其他藥物和含砷化合物組合比為1:1;
[0040]單獨的提取液B組:每單位制劑中含砷化合物含量組成經檢測得到為:砷酸(V, 1.5nM);亞砷酸(ΙΙΙ，0.7nM);甲基砷酸(ΙΙΙ，0.3nM),甲基砷酸(V，2.5nM);一甲基一硫代砷酸(0.7nM) ;二甲基二硫代砷酸DMDTA (0.8nM) ;二甲基砷酸(DMA，0.6M);三甲基胂氧(ΤΜΑ0,1.5nM);砷硼烷(AsB，0.4nM);砷膽堿(AsC，InM)；
[0041]1.1、含有提取液B的天然多形態砷的提取液組合物對體外培養的人肺癌細胞A549細胞的生長抑制作用
[0042]a.普通A549細胞培養:將普通A549細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37°C，5%C02培養箱內飽和濕度條件下培養至對數生長期。
[0043]b.A549細胞球的腫瘤干細胞培養:將普通對數生長期的A549細胞消化細胞后，轉化成含有201/ml B27,20ng/ml EGF, 20ng/ml bFGF的DMEM/F12培養基繼續培養至對數生長期后再消化細胞，并將其制成單細胞懸液以20000個/孔的密度種植6孔板中，每孔2ml培養液，每隔2~3d半量換液，在37°C，5%C02條件下培養4_5天后，顯微鏡下觀察細胞成球情況和形態，連續傳代3次，取第3代細胞球，運用RT-PCR檢測A549細胞球的腫瘤干細胞中干細胞轉錄因子Sox2和0ct4表達情況，篩選Sox2和0ct4表達較高的A549細胞球的腫瘤干細胞進入細胞增殖實驗。
`[0044]c.本發明天然多形態砷的提取液組合物抑制A549細胞球的腫瘤干細胞增殖作用評價:
[0045]不同提取液抑制A549細胞及細胞球增殖能力檢測:將A549細胞和A549細胞球制成單細胞懸液按I X IO4/孔的密度分別加入96孔板，每孔IOOul，分別加入提取液B、含有提取液B組合物1、2和3以及含有As2O3溶液的陽性組合物I’、2’和3’，對照組只加培養基在37°C，5%C02條件下培養72h后，加90uL基礎培養基和MTTIOuL (5mg/ml)，37°C，4h，除去培養液，每孔加入150ul DMS0，搖晃IOmin酶標儀測定光密度值[D (490)]，采用1git法計算組合物半數抑制濃度IC50，結果判定標準:有效IC50〈10nM，有效，IC50>10nM，無效，IC50結果見表1所示:
[0046]結果:本發明含有提取液B的天然多形態砷的提取液組合物中，組合物1、2和3都能夠對體外培養的人肺癌細胞A549和A549細胞球的腫瘤干細胞的生長，具有良好的抑制增殖作用，而且在含砷總量相同的條件下，與陽性As2O3對照組合物1’、2’和3’組相比，組合物1、2和3其抑制作用強于陽性對照組合物組。而在另一方面，與單獨的提取液B組相t匕，雖然組合物1、2和3組，其含砷總量降低了 50%，但是其藥物效應卻高于單獨的提取液B組，據此說明，提取液B和其他藥物組合后，形成的本發明組合物，含砷量降低，而其抑制腫瘤干細胞的藥物效應則更佳，明顯高于單一的天然多形態砷的提取液，具體結果表1:
[0047]表1含有提取液B的天然多形態砷的提取液組合物對人肺癌[0048]A549細胞和A549細胞球的腫瘤干細胞的生長抑制作用
【權利要求】
1.一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，其特征在于:所述天然多種形態砷的提取液組合物包括天然多種形態砷的提取液和以下至少一種的抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括:喜樹堿、長春堿、長春新堿、紫杉醇、腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素、轉化生長因子-β、脂多糖、即佛波酯、腺苷酸環化酶激活劑和骨形態發生蛋白4，其中天然多種形態砷的提取液重量占所制成的藥物總重量的0.0Ol~99.9%，所述天然多種形態砷的提取液組合物可用來制備抗腫瘤干細胞、抗乙肝和抗艾滋病病毒的藥物。
2.如權利要求1所述的一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，其特征在于:所述天然多種形態砷的提取液組合物中含有砷酸(AsIII)、砷酸(AsV)和或一甲基砷酸MMA(III) 一甲基砷酸MMA (V)和或二甲基砷酸DMA (III)、二甲基砷酸DMA (V)和或一甲基一硫代砷酸MMTA和或二甲基二硫代砷酸DMDTA和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷膽堿(AsC);且上述化合物的重量之和占藥物總重量的0.001~99.9%。
3.如權利要求1所述的一種天然多種形態砷的提取液組合物的應用，其特征在于:所述天然多種形態砷的提取液組合物可以添加藥學上可以接受的輔料制備成軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、顆粒劑、注射劑或者粉針劑、口服液、微囊劑、滴丸劑、氣霧劑和栓劑制劑，經口服、注射或直腸方式給藥。`
【文檔編號】A61P31/20GK103768583SQ201410003136
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】張景紅, 楊禮 申請人:華僑大學