專利名稱：一種含連翹提取液的納米銀抑菌組合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥領域，尤其涉及一種中藥抑菌劑。
背景技術：
連翹又稱黃花條、連殼、青翹、落翹、黃奇丹，是中國臨床常用傳統中藥之一，主要生長于山西、河南、山東等地，具有清熱解毒、消腫散結之功效。連翹苷類是連翹所含的主要有效的化學成分，經研究表明，連翹具有抗病原微生物、抗炎、解熱、護肝等作用，其中對傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白喉桿菌及霍亂弧菌、葡萄球菌、鏈球菌都有抑制作用。由于連翹具有多種藥理作用，且在我國資源豐富，廣受人們的關注。中藥制劑濃縮液制成口服液或抑菌劑、涂覆劑等一次用劑量大，且長期使用影響人體健康。

發明內容
針對連翹抑菌劑一次性使用量大和長期使用影響人體健康問題，本發明人經過大量實驗，發現納米銀能有效增強連翹提取液抑菌性能，減少連翹抑菌劑的用量，且采用兩種低劑量的抑菌組合物，更加的安全。本發明的目的在于提供一種連翹納米銀抑菌劑，減少連翹抑菌劑一次的用劑量和降低藥品對人體的毒性。本發明提供如下技術方案
一種抑菌劑，含有連翹提取液、水溶性納米銀；
連翹提取液的制備包括如下步驟取干藥材連翹，加水量為連翹重量的9倍，經95 V水浴提取4 h，再經過減壓濃縮得到提取液；所得的提取液經過O. 22 μ m濾膜過濾。最后提取液經高壓液相色譜法對提取液中的連翹苷進行標準定量。水溶性納米銀顆粒粒徑為3 10 nm,納米銀外表包覆兩性聚合物。水溶性納米銀粒徑為3 10 nm,外表為羧基，依照下列方法制備取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。依照本方法制備的水溶性納米銀顆粒與連翹提取液具有良好的協同抗菌作用。抑制大腸桿菌0157:H7時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為75 100: I。為了達到更好的效果，連翹提取液與水溶性納米銀體積比為75-100:1，優選為100:1。抑制藤黃微球菌時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為I 25: I。在算體積比時所用的連翹提取液中連翹苷的濃度為9. 3mg/g，所用的水溶性納米銀濃度為10mg/mL。本發明還涉及上述的抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157:H7中的應用。
本發明還涉及上述的抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應用。本發明的有益效果是水溶性納米銀的應用能有效增強連翹抑菌性能，降低連翹抑菌劑的用量，更令人意向不到的是兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌0157:H7和藤黃微球菌起到協同作用，同時本抑菌劑采用兩種低劑量的抑菌物質，相對于使用高劑量的連翹或者水溶性納米銀，更加的安全，可以作為安全可靠地外用涂覆劑等。


圖I連翹提取液與納米銀之比為100:1對大腸桿菌0157 :H7協同抑菌作用
圖Ia 200 μ L連翹提取液對大腸桿菌0157 :Η7的抑制作用，圖Ib 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157: Η7的抑制作用，圖Ic 100 μ L連翹提取液與I μ L納米銀對大腸桿菌0157 :Η7的協同抑菌作用。
圖2連翹提取液與納米銀之比為75:1對大腸桿菌0157 :Η7協同抑菌作用
圖2a 150 μL連翹提取液對大腸桿菌0157:H7的抑制作用，圖2b 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157:Η7的抑制作用，圖2c 75 μ L連翹提取液和I μ L納米銀對大腸桿菌0157:Η7的協同抑菌作用。圖3連翹提取液與納米銀之比為25:1對藤黃微球菌協同抑菌作用
圖3a 400 μ L連翹提取液對藤黃微球菌的抑制作用，圖3b 16 μ L的納米銀對藤黃微球菌的抑制作用，圖3c 200 μ L連翹提取液和8 μ L納米銀對藤黃微球菌的協同抑菌作用。圖4連翹提取液與納米銀之比為20:1對藤黃微球菌協同抑菌作用
圖4a 320 μ L連翹提取液對藤黃微球菌的抑制作用，圖4b 16 μ L的納米銀對藤黃微球菌的抑制作用，圖4c 160 μ L連翹提取液與8 μ L納米銀對藤黃微球菌的協同抑菌作用。實施例中所用試劑均為常規試劑，依照常規方式配制即可。
具體實施例方式實施例I
I、連翹提取液的制備過程稱取干藥材連翹50 g，加水量為450 mL，在95 °C下提取4h，經過真空旋轉濃縮儀后，用O. 22 μ m濾膜除去提取液中的雜質和細菌，最后用高效液相色譜法測得提取液中連翹苷含量為9. 3 mg/g。2、水溶性銀納米顆粒制備
a、取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀。13、稱取6.7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。3、連翹提取液與水溶性納米銀協同抑菌作用。
a細菌的培養
挑取LB瓊脂培養基上的大腸桿菌0157:H7的單菌落于10 mL LB肉湯培養基中，置于37 °C培養箱中培養16 h，再按I %的接種量接種于5 mL的LB肉湯培養基中，37 °C培養4h后。取I mL上述菌液用O. 1%的蛋白胨水連續稀釋三個梯度，最終的菌液大約為IO6 CFU/mL。b水溶性納米銀與連翹提取液在抑菌性能上的協同作用
分別取I mL上述已稀釋好的菌液于I. 5 mL滅菌的離心管中，向I號離心管中分別加入200 μ L連翹提取液，向2號離心管中加入2 μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，向3號離心管中加入100 μ L連翹提取液(連翹苷濃度為9. 3 mg/g)和I μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，不加入任何上述抑菌劑。為保證每管液體最終體積相等，差量用O. 1%的蛋白胨水補齊。置于37 °C培養2 h。每組實驗平行三次。c平板計數
將實驗組待測液用PBS連續稀釋兩個梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分別均勻涂布在LB固體平板上；空白組連續稀釋四個梯度，從10_2、10_3、10_4三個梯度分別均涂布在LB固體平板上。平板吹干后，37°C倒置培養12 h，長出菌落后計數，以30-300個菌落形成單位(CFU)為有效的計數范圍。每毫升原菌液活菌數=平板計數*稀釋倍數*5
抑菌物質I加入抑菌劑后能數出來的菌落數
空白組_6. 5X IO7CFUZmL_
200 μ L 的連翹提取液1.5 X IO6CFUZmL—
含2 μ L濃度為lOmg/mL的納米銀H X IO2CFUZmL
含100 μ L的連翹提取液和I μ L濃度為IOmgZmL的納米銀溶液 |oCFU/mL
如圖I所示，圖Ia 150 μ L連翹提取液對大腸桿菌0157 :Η7的抑制作用，圖Ib 2 μ L的納米銀對大腸桿菌0157: Η7的抑制作用，圖Ic 100 μ L連翹提取液與I μ L納米銀對大腸桿菌0157:Η7的協同抑菌作用。實驗表明本發明提供的抑菌組合物具有減少連翹抑菌劑一次用量的作用，且兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌0157:Η7起到協同的作用
具體實施方式
2
I、連翹提取液的制備過程稱取干藥材連翹50 g，加水量為450 mL，在95 °C下提取4h，經過真空旋轉濃縮儀后，用O. 22 μ m濾膜除去提取液中的雜質和細菌，調整濃度，用高效液相色譜法測得提取液中連翹苷含量為9. 3 mg/g。2、水溶性銀納米顆粒制備
同實施例I。3、連翹提取液與水溶性納米銀協同抑菌作用。a細菌的培養
挑取LB瓊脂培養基上的大腸桿菌0157:H7的單菌落于10 mL LB肉湯培養基中，置于37 °C培養箱中培養16 h，再按I %的接種量接種于5 mL的LB肉湯培養基中，37 °C培養4h后。取I mL上述菌液用O. 1%的蛋白胨水連續稀釋三個梯度，最終的菌液大約為IO6 CFU/mL。b水溶性納米銀與連翹提取液在抑菌性能上的協同作用分別取I mL上述已稀釋好的菌液于I. 5 mL滅菌的離心管中，向I號離心管中分別加Λ 150 μ L連翹提取液，向2號離心管中加入2 μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，向3號離心管中加入75 μ L連翹提取液(連翹苷濃度為9. 3mg/g)和I μ L濃度為10 mg/mL水溶性納米銀，不加入任何上述抑菌劑。為保證每管液體最終體積相等，差量用O. 1%的蛋白胨水補齊。置于37 °C培養2 h。每組實驗平行三次。c平板計數
將實驗組待測液用PBS連續稀釋兩個梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分別均勻涂 布在LB固體平板上；空白組連續稀釋四個梯度，從10_2、10_3、10_4三個梯度分別均涂布
在
LB固體平板上。平板吹干后，37°C倒置培養12 h，長出菌落后計數，以30-300個菌落形成單位(CFU)為有效的計數范圍。每毫升原菌液活菌數=平板計數*稀釋倍數*5
權利要求
1.一種含連翹提取液的納米銀抑菌劑，其特征在于含有連翹提取液、水溶性納米銀；所述的連翹提取液的制備包括如下步驟取干藥材連翹，加水量為連翹重量的9倍，經95°〇水浴提取4 h，再經過減壓濃縮得到提取液；所述水溶性納米銀依照下列方法制備取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四烷酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。
2.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制大腸桿菌0157:H7時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為75 100: I。
3.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制藤黃微球菌時連翹提取液、水溶性納米銀的體積比為I 25: I。
4.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得的提取液經過O.22 ym濾膜過濾。
5.如權利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得的提取液經高壓液相色譜法對提取液中的連翹苷進行標準定量。
6.如權利I 5任一所述的抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157:H7中的應用。
7.如權利I 5任一所述的抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑菌組合物，屬于中藥領域。抑菌組合物中連翹提取液與水溶性納米銀以比例混合，兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌O157:H7、藤黃微球菌起到協同的作用。本發明的一種連翹提取物與納米銀抑菌劑與現有的技術相比，解決了常規抑菌方法中連翹抑菌劑用量較大的問題，同時采用兩種低劑量的抑菌物質減少了微生物耐藥的發生機率、降低了其對人體的毒性，更加的安全。
文檔編號A61P31/04GK102895315SQ20121036651
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者魏華, 熊勇華, 許恒毅, 王力均, 郭亮, 徐鋒, 萬翠香, 賴衛華 申請人:南昌大學