一種載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法,包括以下步驟:步驟1,制備改性煅燒骨材料;步驟2,用三蒸水配制10～30mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液,并調節其pH在5.8～6.5的范圍;步驟3,取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料、骨形態發生蛋白并混合，均勻混合后塑型，然后在50℃～60℃干燥即制得載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料。利用本發明方法制備的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的過程，其降解性能適合作為人工骨替代材料。該材料與兩種組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞共培養無細胞毒性，能促進細胞的增殖與分化。
【專利說明】一種載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物活性復合陶瓷領域，特別是涉及一種載生物活性因子BMP-2類骨陶瓷復合材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]雖然骨缺損修復重建的方法很多，但骨缺損后修復重建尤其是大塊骨缺損后的修復重建一直是骨科面臨的難題。尋求理想的骨修復替代材料一直是骨科及相關學科亟待解決的關鍵問題。
[0003]多年的研究成果表明，在磷灰石陶瓷家族成員中，納米羥基磷灰石(HA)的晶體結構與骨組織中的礦物質微粒結構基本相同，磷酸鈣(TCP)在骨組織中也占有一定比例，其降解速率遠大于HA，在體內易于降解。降解速率除與化學組分有關外，還與其與體液間的接觸面積相關。多孔磷灰石陶瓷的最佳設計原則在于兼顧降解速率及有利于新生骨組織的長入，即既要300 μ m-500 μ m的大孔、又要微米級的微孔結構。盡管鈣磷陶瓷的成型制作技術有了大的發展，如計算機控制的三維陶瓷打印技術。然而在讀取天然骨組織的結構信息時，仍受到測量表征技術及加工技術的限制，縮短與天然骨組織的差距仍是一個長期的努力目標。
[0004]煅燒骨是現有骨修復材料之一，既保留了無機鈣磷礦物質，又基本保留了骨組織的多孔結構，在臨床應用中得到了較好的評價。但強度較差，由于經高溫燒成，完全失去了膠原蛋白，納米晶體發生了改變，不易降解。
[0005]在骨誘導理論提出以及成功地提取出具有高效誘導成骨能力的骨形態發生蛋白(BMP)以后，為骨修復替代材料的研制與開發開拓了一個新的領域。骨形成是一個復雜而連續的過程，許多骨生長因子參與了骨形成的局部調節。從胚胎發育到老年，骨組織始終在進行新陳代謝，即骨的改建過程。參與骨形成的細胞主要有成骨細胞(osteoblast)和軟骨細胞(chrondrocyte)。正常情況下，局部發生的骨形成和骨吸收是交替循環的，即新骨取代舊骨。細胞因子的生物學活性是由受體介導的。骨和軟骨中存在著與各種細胞因子相對應的特異性受體。與其它組織一樣，骨和軟骨內細胞因子的受體也多為分子量較大的糖蛋白。BMP是一種酸性多肽，在酸性條件下較為穩定，pH大于8.5則易失活，BMP可耐受55°C_75°C的溫度，但對放射線較為敏感，0.002mGy的放射線可使其失活。BMP的主要生物學作用是誘導未分化的間充質細胞不可逆的分化形成軟骨和骨，從而導致新骨的形成。
[0006]近年來的研究已經闡明這些細胞因子主要作用的生化和分子基礎，同時也提供了有關它們之間相互作用的機理。隨著對細胞因子在骨代謝中作用機制的認識，預示著這些細胞因子在骨折愈合及骨缺損修復以及某些骨吸收性疾病的診斷和治療中有著樂觀的應用前景。
[0007] 殼聚糖(chitosan，CS)是由甲殼素經脫乙酰化反應而得到，是目前已知的天然多糖中唯一的堿性多糖，它具有良好的生物相容性、生物降解性、無毒及抗菌性等特點，受到醫學界廣泛的關注。羧甲基殼聚糖(CMCS)是新型的殼聚糖衍生物，由甲殼質在堿性條件下與氯乙酸反應而得到。與甲殼質相比，其物理、化學性質均得到優化，具有完全水溶性、成膜性及極強的與鈣離子的螯合作用，大大拓展了其在醫學領域的應用。
[0008]在骨缺損的修復治療中，磷灰石陶瓷具有與骨組織無機成分相同的組分，生物相容性好，但性脆強度不高，臨床應用受到大的限制。隨著研究的不斷深入，特別是理想的骨組織工程支架材料的提出，盡力模仿骨組織的天然結構成為了當今骨修復材料設計與制作的重要原則。支架材料的研究是骨組織工程研究的關鍵問題，骨組織工程支架材料不僅要有良好的生物相容性、一定的機械強度及三維多孔的立體結構，有力于新生骨組織的長入，還要有合適的降解速率維持新生組織的生長。殼聚糖具有無毒性，良好的生物相容性，可被體內多種生物酶降解，降解產物無毒且能被生物體吸收，殼聚糖已經被證明了是適宜的緩釋控載體。羧甲基殼聚糖與殼聚糖相比具有更強的水溶性、成膜性和與鈣離子的鰲合作用，拓寬了其作為緩控釋載體的應用范圍，當其與生物陶瓷復合制作支架材料時，顯示了優越的修飾能力。
[0009]此外，通過體外試驗證明羧甲基殼聚糖能明顯縮短組織創面出血時間，具有良好的凝血性，分析原因為CMCS是一種兩性聚電解質，在溶液中，氨基能質子化生成陽離子，羧基能電離生成陰離子，兩種離子共同作用加速凝血過程縮短了凝血時間。感染也是誘導術后粘連的因素之一，細菌有不同的致粘連能力，如大腸桿菌能引發纖維蛋白分子及白細胞滲出，產生較廣泛的粘連。臨床上常使用抗生素來控制術區感染，
[0010]僅靠單一材料，很難滿足以上各項性能的要求，因此人們通常模仿天然骨的成分和結構特征進行仿生制備無機復合或有機雜化支架，殼聚糖的膜結構在模仿天然骨的應用中常常受到重視。

【發明內容】

[0011]本發明所要解決的技術問題是提供一種載生物活性因子類骨陶瓷復合材料的制備方法。本發明將針對現有骨粉強度較差，難于降解，生物活性較差等不足，選用改性煅燒骨粉或顆粒為基體，以羧甲基殼聚糖溶液進行交聯，加入骨形態發生蛋白BMP-2，制作成強度較高，易于降解同時具有骨誘導特性的新型骨修復材料。
[0012]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:一種載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，包括以下步驟:
[0013]步驟1，制備改性煅燒骨材料；
[0014]步驟2，選用分子量在5000~50000的羧甲基殼聚糖，用三蒸水配制10~30mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液，并調節其pH在5.8~6.5的范圍；
[0015]步驟3，取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料、骨形態發生蛋白混合，使羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:100~300:0.1~0.4，這樣可以使復合材料具有最低有效濃度和最高釋放濃度。所述原料均勻混合后塑型，在50°C~60°C干燥即制得載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料。優選的，羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:100~300:0.15~0.3，使生長因子有效釋放。
[0016]如上所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，優選的，步驟1，選用新生小牛關節頭或脛骨的骨骺端作為骨原料，經去離子水充分蕩洗后利用改性劑對骨原料行改性，使骨基質的Ca/P原子比降至1.66~1.5 ;然后在800°C~1100°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。采用該優選步驟的的有益效果是:有效提高β磷酸三鈣的含量，獲得的改性煅燒骨材料中羥基磷灰石(HA): β磷酸三鈣(β TCP) =1:3，提高最終產品的親水性。
[0017]如上所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，優選的，所述改性劑選自磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸中的一種或幾種。
[0018]如上所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，優選的，步驟2中，用鹽酸或乙酸調節羧甲基殼聚糖水溶液PH至5.8~6.5范圍。
[0019]如上所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，優選的，所述骨形態發生蛋白為BMP-2。
[0020]本發明的有益效果是:
[0021]1、載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的抗壓強度高于煅燒骨材料，更適合用作人工骨替代材料。
[0022]2、本發明方法制備材料的凝膠在掃描電鏡下成三維多孔結構，殼聚糖大分子交聯形成中空的支架，孔隙均勻，結構穩定。
[0023]3、在 添加改性煅燒骨材料后，最終制品材料的親水性得到較大提高，是未添加改性煅燒骨材料前空載CS/BMP材料的5倍。
[0024]4、載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的過程，其降解性能適合作為人工骨替代材料。
[0025]5、本發明方法制備的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料與兩種組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞(BMSC)共培養無細胞毒性，能促進細胞的增殖與分化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例1制備的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料表面掃描形貌；
[0027]圖2為本發明實施例1制備的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料斷面掃描形貌；
[0028]圖3為本發明實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料浸泡液吸光度變化圖；
[0029]圖4為發明實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料生物相容性檢測結果圖；
[0030]圖5為本發明骨塊煅燒前后的X射線衍射圖譜；
[0031]圖6為發明實施例1的骨缺損區有新生骨樣組織生成圖。
【具體實施方式】
[0032]以下結合【具體實施方式】對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。
[0033]實施例1
[0034]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用新生小牛關節頭作為骨原料，經去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸氫二銨按照化學反應平衡方程配比對骨的基質(骨鹽)進行改性，使骨基質的Ca/P原子比降至1.66 ;然后在1000°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
[0035]由骨塊煅燒前后的XRD圖譜(X射線衍射圖譜，圖5)可見骨基質晶相由HA改變為 HA/ β -TCP (Hydroxyapatite/ β -tricalcium phosphate,羥基憐灰石:β -憐酸三鈣)的雙相結構，骨基質晶相羥基磷灰石:β -磷酸三鈣=1:3。SEM觀察表明，煅燒骨粉既含有300 μ m-500 μ m的大孔、又含有微米級的微孔結構。
[0036]步驟2，選用分子量在25000的羧甲基殼聚糖，用三蒸水配制20mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液，并用鹽酸調節其PH為6.2;
[0037]步驟3，取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料、骨形態發生蛋白并混合，使羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:200:0.25 ;均勻混合后塑型，然后在50°C~60°C干燥即制得實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料，其抗壓強度為0.3Mpa。
[0038]如圖1所示，實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的凝膠在掃描電鏡下成三維多孔結構，殼聚糖大分子交聯形成中空的支架，孔隙均勻，結構穩定。
[0039]由于材料的親水性對于材料的生物相容性影響極大。殼聚糖類材料存在的缺點即其表面為疏水性表面，將阻礙細胞的貼附和增殖。在添加改性骨粉后，人工骨的親水性得到較大提高，是未添加改性骨粉前空載CS/BMP材料的5倍。
[0040]如圖3所示，實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料浸泡液在最初的2周內吸光度變化較小，吸光度值低，從第14天開始材料的吸光度增加加快。表明材料在最初2周內較為穩定，而隨著時間增加，材料中殼聚糖形成的網狀交聯結構解鏈，松散，材料發生逐漸降解。隨后降解度增加，到第6周時可觀察到浸泡材料的生理緩沖液中出現明顯的絮狀凝膠降解產物，到第8周時材料完全松散降解，此后吸光度基本維持不變。
[0041]如圖4所示，生物相容性檢測證明實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料與兩種組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞(BMSC)共培養無細胞毒性，能促進細胞的增殖與分化。
[0042]按照人工骨植入材料的生物相容性評價方法進行體內試驗，證實實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料有良好的生物相容性，骨誘導性及好的強度。如圖6所示，體內試驗表明，其植入體內后，在第2周骨缺損區開始有顯微血管長入，三周即可形成新生的骨樣組織，骨小梁間富于血管，骨髓腔形成，并出現大量的編織骨，新生骨樣組織的鈣含量明顯增高。因此，實施例1的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的過程，其降解性能適合作為人工骨替代材料。
[0043]實施例2
[0044]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用新生小牛關節頭作為骨原料，經去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸二氫銨按照化學反應平衡方程配比對骨的基質(骨鹽)進行改性，使骨基質的Ca/P原子比降至1.55 ;然后在1000°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。 [0045]步驟2，選用分子量在10000的羧甲基殼聚糖,用三蒸水配制10mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液，并用乙酸調節其PH為6.5;[0046]步驟3，取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料、骨形態發生蛋白并混合，使羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:100:0.1 ;均勻混合后塑型，然后在50°C~60°C干燥即制得實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料，其抗壓強度為0.3Mpa。
[0047]實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的凝膠在掃描電鏡下成三維多孔結構，殼聚糖大分子交聯形成中空的支架，孔隙均勻，結構穩定。
[0048]生物相容性檢測證明實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料與兩種組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞(BMSC)共培養無細胞毒性，能促進細胞的增殖與分化。
[0049]按照人工骨植入材料的生物相容性評價方法進行體內試驗，證實實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料有良好的生物相容性，骨誘導性及好的強度。因此，實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的過程，其降解性能適合作為人工骨替代材料。
[0050]實施例3
[0051]步驟1，制備改性煅燒骨材料；選用新生小牛關節頭作為骨原料，經去離子水充分蕩洗并以物理或生物化學的方法基本去除膠原蛋白；然后利用磷酸按照化學反應平衡方程配比對骨的基質(骨鹽)進行改性，使骨基質的Ca/P原子比降至1.5 ;然后在1000°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
[0052]步驟2，選用分子量在40000的羧甲基殼聚糖,用三蒸水配制30mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液，并用乙酸調節其PH為6;
[0053]步驟3，取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料、骨形態發生蛋白并混合，使羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:300:0.4 ;均勻混合后塑型，然后在50°C~60°C干燥即制得實施例3的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料，其抗壓強度為0.3Mpa。
[0054]實施例3的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的凝膠在掃描電鏡下成三維多孔結構，殼聚糖大分子交聯形成中空的支架，孔隙均勻，結構穩定。
[0055]生物相容性檢測證明實施例2的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料與兩種組織工程種子細胞骨髓間充質干細胞(BMSC)共培養無細胞毒性，能促進細胞的增殖與分化。
[0056]按照人工骨植入材料的生物相容性評價方法進行體內試驗，證實實施例3的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料有良好的生物相容性，骨誘導性及好的強度。因此，實施例3的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的降解周期符合骨形成和骨改建的過程，其降解性能適合作為人工骨替代材料。
[0057]以上所述僅 為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟1，制備改性煅燒骨材料； 步驟2，選用分子量在5000~50000的羧甲基殼聚糖，用三蒸水配制10~30mg/ml的羧甲基殼聚糖水溶液，并調節其PH在5.8~6.5的范圍； 步驟3，取調pH后的羧甲基殼聚糖水溶液、改性煅燒骨材料及骨形態發生蛋白并混合，使羧甲基殼聚糖:改性煅燒骨材料:骨形態發生蛋白的重量配比在1000:100~300:0.1~0.4 ;均勻混合后塑型，然后在50°C~60°C干燥即制得載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料。
2.根據權利要求1所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，步驟1，選用新生小牛關節頭或脛骨的骨骺端作為骨原料，經去離子水充分蕩洗后利用改性劑對骨原料行改性，使骨基質的Ca/P原子比降至1.66~1.5 ;然后在800°C~1100°C溫度條件下煅燒改性后的骨原料以徹底去除骨材料的免疫抗原性，獲得改性煅燒骨材料。
3.根據 權利要求2所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，所述改性劑選自磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸中的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，步驟2中，用鹽酸或乙酸調節羧甲基殼聚糖水溶液pH至5.8~6.5范圍。
5.根據權利要求1所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，所述羧甲基殼聚糖:所述改性煅燒骨材料:所述骨形態發生蛋白的重量配比在1000:100 ~300:0.15 ~0.3。
6.根據權利要求1至5任一項所述的載生物活性因子的類骨陶瓷復合材料的制備方法，其特征在于，所述骨形態發生蛋白為BMP-2。
【文檔編號】A61L27/20GK103920193SQ201410136735
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】唐志輝, 李箐, 廖運茂 申請人:北京大學口腔醫院