分離的腎細胞及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的腎細胞及其用途。本發(fā)明涉及分離的腎細胞，其包括腎小管細胞群和生成促紅細胞生成素(EPO)的腎細胞群，及其分離和培養(yǎng)方法，以及用所述細胞群治療有需要的受試者的方法。
【專利說明】分離的腎細胞及其用途
[0001]本申請是申請日為2009年11月12日、中國申請?zhí)枮?00980153736.X、發(fā)明名稱為“分離的腎細胞及其用途”的發(fā)明申請的分案申請。
[0002]相關申請
[0003]本申請根據35U.S.C.§ 119(e)要求2008年11月12日提交的美國臨時申請N0.61/114，025、2008年11月12日提交的美國臨時申請N0.61/114，030、2008年12月5日提交的美國臨時申請N0.61/201，056、2008年12月8日提交的美國臨時申請N0.61/201，305和2008年12月10日提交的美國臨時申請N0.61/121，311的優(yōu)先權，這些申請的全部內容通過引用并入本文。本申請的主題與2009年11月12日提交的美國臨時申請N0.61/260, 833相關，該申請的公開內容通過引用并入本文。
【技術領域】
[0004]本發(fā)明涉及分離的腎細胞(包括腎小管細胞群和生成促紅細胞生成素(EPO)的腎細胞群)，及其分離和培養(yǎng)方法，以及用所述細胞群治療有需要的受試者的方法。
【背景技術】
[0005]在美國，有超過1900萬的慢性腎病(CKD)患者，該疾病往往是由包括肥胖癥、糖尿病和高血壓在內的代謝障礙所致。數據檢索顯示，慢性腎病發(fā)病率的增加源于由高血壓和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)所繼發(fā)的腎衰竭的發(fā)展(美國腎病數據系統(tǒng)(UnitedStates Renal Data Service(USRDS)):用于CKD和 ESRD 的費用(Costs of CKD and ESRD)第223-238頁(2007)，由美國國立衛(wèi)生研究院國立糖尿病、消化與腎病研究所(NationalInstitute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases) Bethesda, MD 編著)所述兩種疾病在全球范圍內也呈上升趨勢。已證實肥胖癥、高血壓和血糖控制不良是腎損害的獨立危險因素，引起腎小球和腎小管損害并引起蛋白尿和其它全身可檢測到的腎過濾功能的改變(Aboushwareb 等，World J Urol, 26:295-300, 2008 ；Amann, K.等，Nephrol DialTransplant, 13:1958-66，1998)。對于處于1_3進行期的CKD患者，通過改變生活方式和旨在控制一種或多種潛在病情的藥物介入進行控制；而對于處于4-5期的CKD患者，則通過透析和藥物療法進行控制，該藥物療法通常包括抗高血壓藥、紅細胞生成刺激劑(ESA)、補充鐵和維生素D。根據美國腎病數據系統(tǒng)(USRDS)，晚期腎病(ESRD)患者每個月在注射型紅細胞生成刺激劑(ESA)、維生素D補充劑和鐵補充劑上的平均費用超過$600(美國腎病數據系統(tǒng):用于CKD和ESRD的費用第223-238頁(2007)，由美國國立衛(wèi)生研究院國立糖尿病、消化與腎病研究所Bethesda，MD編著)。再加上用于透析的年平均費用($65，405)，用于維持每位患者的醫(yī)療費用上升至每年超過$72，000 (美國腎病數據系統(tǒng):用于CKD和ESRD的費用第223-238頁(2007)，由美國國立衛(wèi)生研究院國立糖尿病、消化與腎病研究所Bethesda，MD編著)-該數值僅反映了標準治療的費用，并不包括其它并發(fā)癥的治療、緊急治療或輔助治療(例如放置用于透析通路的血管移植物)的費用。2005年，用于CKD和ESRD的聯(lián)合醫(yī)療保健費用總計 為$620億-占該年所有醫(yī)療保健支出的19% (美國腎病數據系統(tǒng):用于CKD和ESRD的費用第223-238頁(2007)，由美國國立衛(wèi)生研究院國立糖尿病、消化與腎病研究所Bethesda，MD編著)。雖然對于4_5期患者而言，腎移植作為先行措施以避免透析或當透析已不足以控制病情時是有效的方案，但在美國，可受益于全腎移植的5期CKD患者人數(>400, 000)遠超過任何指定年份可獲得的合適供體腎的數量(~16，000) (Powe, NR等，Am J Kidney Dis，53:S37-45，2009)。因此，需要新的治療模式來延緩或降低對透析的依賴性并填補由供體腎短缺留下的空白。
[0006]進行性腎病是由初期疾病損傷(如，高血壓)和隨后對該損傷適應不良的腎反應聯(lián)合所致。此類反應包括產生促炎性和促纖維化細胞因子和生長因子。因此，延緩CKD惡化的一種策略為改善炎性和纖維化反應以及通過腎組織的修復和/或再生來減輕或逆轉腎潰變。
[0007]慢性腎衰竭常見于人類以及一些馴養(yǎng)的動物中。腎衰竭的患者不僅經受腎功能喪失(尿毒癥)，而且會由于骨髓不能經由紅細胞生成而產生足量的紅細胞(RBC)而發(fā)展成貧血癥。紅細胞穩(wěn)態(tài)取決于由駐留于腎臟中的特化間質成纖維細胞產生的促紅細胞生成素(EPO)和骨髓中的靶紅系祖細胞響應EPO并生成更多RBC的能力。腎衰竭的貧血源于腎臟中的EPO的生成的量的降低和尿毒癥因素對骨髓中EPO作用的負面影響。[0008]迄今為止，治療慢性腎衰竭的臨床方法包括用于恢復腎過濾和尿液生成的透析和腎移植，以及用于恢復紅細胞團塊的重組EPO或EPO類似物的全身性遞送。透析延長了中期至晚期腎衰竭患者的生存期，但卻導致嚴重的生活質量問題。腎移植對于晚期腎衰竭患者而言是非常理想(并且往往是唯一)的方案，但優(yōu)質的供體腎的供應不能滿足腎衰竭群體的需求。用于治療貧血的含重組EPO的丸劑現已與嚴重的下游健康風險相關，致使FDA對該藥物發(fā)出黑框警告(black box warning),并且需要進一步研究用于恢復此群體中紅細胞穩(wěn)態(tài)的替代療法。臨床前研究已檢測了經由基因治療方法所產生的EPO生成細胞的體內功效和安全性。這些研究表明，可通過EPO生成細胞的體內遞送來瞬時刺激紅細胞生成和RBC數量。然而，迄今為止，這些方法均未提供可調的紅細胞穩(wěn)態(tài)或長期的體內功能性。因此，HCT和RBC數量通常增加超過正常值，導致真性紅細胞增多癥和其它并發(fā)癥。與治療相關的并且相比重組EPO遞送提供更多優(yōu)勢的EPO生成細胞的遞送不僅必須增加HCT，而且還應恢復紅細胞穩(wěn)態(tài)，同時保持正調節(jié)機制和負調節(jié)機制未受損。需要指出的是，雖然EPO缺乏性貧血常見于腎病患者中，但是其發(fā)病也可由其它病情引起，包括心力衰竭、多器官系統(tǒng)功能衰竭和其它慢性疾病。
[0009]腎是由許多不同的特化細胞類型(10種以上)構成的獨特器官，這些細胞類型均從間介中胚層起源發(fā)育，但在成熟時卻形成形態(tài)學上和功能上不同的區(qū)室以及解剖單元，這些解剖單元協(xié)同作用以過濾血液、產生尿液、調節(jié)酸堿及電解質平衡和調節(jié)內分泌功能，諸如產生促紅細胞生成素(Epo)、維生素D、腎素和血管緊張素。腎的細胞區(qū)室在穩(wěn)態(tài)功能方面具有很大的相互依賴性，這在下列實例中重點描述。入球小動脈細胞與髓袢升支粗段(the thick ascending limb of the loop of Henle)中的特化腎小管細胞(致密斑)協(xié)同作用，以調節(jié)流經腎小球的血流(Castrop, H.Acta Physiol (Oxf), 189:3-14，2007)。腎小球的有孔內皮細胞、足細胞和基底膜與特化的近端腎小管細胞對來自腎小球濾液的蛋白質所進行的受體介導的內吞和重吸收相配合，以此實現腎對蛋白質的處理(Jarad，G&Miner, JH.Curr Opin Nephrol Hypertens, 18:226-32，2009)。由腎小管細胞生成的活性維生素D通過直接或間接機制調節(jié)間質細胞的穩(wěn)態(tài)，這些機制控制細胞外基質的沉積、間質細胞向肌成纖維細胞的轉化以及上皮-間充質細胞轉化(Tan, X等，J Steroid Biochem MolBiol, 103:491-6, 2007)。無論具體實例如何，腎中細胞間的相互作用至少部分地取決于空間和結構關系。在細胞水平上，CKD的進展可涉及由細胞機能不全或穩(wěn)態(tài)細胞間相互作用的缺失而導致的特定細胞類型的缺失或一種或多種細胞類型的功能喪失。因此，治療CKD的有效再生方法必須通過恢復細胞組織和細胞間通訊來對穩(wěn)態(tài)進行部分重建。
[0010]已設想通過增強特定的腎功能(例如腎小管轉運或Epo生成)來降低與CKD進展相關的發(fā)病率和死亡率。大多數基于細胞的腎病治療方法側重于用干細胞或祖細胞類型對急性腎衰竭(ARF)進行治療干預(Hopkins, C等，JPathol, 217:265-81，2009)。目前存在許多臨床前研究，其涉及在誘發(fā)ARF之前或之后便立即遞送各種細胞類型，包括腎內或全身性遞送 MSC (Humphreys BD&Bonventre JV, Annu Rev Med2008, 59:311-325)、內皮祖細胞(EPC) (Chade AR 等，Circulation2009, 119:547-557 ;Patschan D 等，Curr OpinPharmacol2006, 6:176-183)以及胎兒細胞或組織原基(Hammerman MR, Curr Opin NephrolHypertens2001, 10:13-17 ；Kim SS 等，Stem Cells2007, 25:1393-1401 !Marshall D 等，Exp Physiol2007, 92:263-271 ；Yokoo T 等，J Am Soc N印hrol2006, 17:1026-1034)。將包含腎小管細胞的體外中空纖維過濾裝置進行測試作為治療人類A RF的傳統(tǒng)透析的輔助(Ding,F&Humes, HD.Nephron Exp Nephrol, 109:ell8-22, 2008 ；Humes, HD 等，KidneyInt, 66:1578-88, 2004 ;Humes, HD 等，Nat Biotechnol, 17:451-5，1999)。還對心血管外科手術繼發(fā)性ARF發(fā)作的高危患者群體進行了經腎動脈移植間充質干細胞的臨床試驗(ffestenfelder, C.Experimental Biology.New Orleans, LA, 2009)。針對基于細胞的 CKD治療干預而進行的臨床前研究數量有限(Chade，AR等，Circulation, 119:547-57，2009 ；Eliopoulos, N 等，J Am Soc Nephrol, 17:1576-84，2006 ;Kucic, T 等，Am J Physiol RenalPhysiol, 295:F488-96, 2008)。已在嚙齒動物中對胎兒腎原基+/-間充質干細胞的組合進行了研究(Yokoo, T 等，Transplantation, 85:1654-8，2008 ;Yokoo, T 等，J Am SocNephrol, 17:1026-34, 2006)，其中移植到合適環(huán)境(如網膜)的整個胎兒腎組織顯然可發(fā)展成為功能有限的腎結構。然而，MSC作為胎兒腎組織原基組分的治療作用并不明確，并且用于治療目的之人體胎兒腎組織的來源面臨著許多操作和倫理的挑戰(zhàn)。在其它研究中，將來源于健康供體骨髓的細胞移植到經輻射的C0L4A3(-/_)小鼠體內，該小鼠為患有腎小球性腎炎、蛋白質流失和纖維樣變性的奧爾波特綜合征(Alport Syndrome)模型,其中所述細胞通過用沒有膠原基因突變的健康細胞替換滲漏腎小球足細胞從而部分延緩了模型中綜合征的進展(Prodromidi, EI 等,Stem Cells, 24:2448-55，2006，Sugimoto, H 等，ProcNatl Acad Sci U S A, 103:7321-6，2006)。認為細胞移植有助于使sCREAT、BUN和鈉的水平穩(wěn)定，而在研究24中，未治療的/腎受損對照組沒有給出比較結果。Chade等采用單側腎動脈狹窄的豬模型對損傷6周后于腎內遞送的自體EPC的效果進行檢驗(Chade AR等，Circulation2009, 119:547-557)。EPC在某種程度上改善了腎小管_間質纖維化，顯著改善了腎小球硬化癥并改善了腎血流量，但在治療后未觀察到血壓的變化(Chade AR等，Circulation2009, 119:547-557)。迄今為止，對基于細胞的CKD療法的體內功效進行檢驗的研究已產生即時和 /或局部效應，且很少有研究同時收集到功能的全身性和組織學證據。少數研究提供對進行性CKD模型干預后的臨床相關益處的證據，這些研究提出了有關基于細胞的療法完全恢復腎功能潛力的問題。然而，穩(wěn)定腎功能并延緩進展的再生療法能夠解決此患者群體范圍內未得到滿足的醫(yī)療需求。
[0011]進行性CKD的體內可再生模型對于評價候選療法的治療潛力而言必不可少。雖然ARF模型數目眾多并且包括多種化學物質或局部缺血/再灌流誘發(fā)的腎小管損傷，但未經顯著干預的進行性和晚期CKD模型較少。在大鼠中進行兩步5/6腎切除手術再生地產生了晚期和進行性腎衰竭狀態(tài)，導致全身地和組織學上地可檢出的疾病，這些疾病伴有CKD的若干關鍵特征，包括高血壓、腎小球濾過率(GFR)降低、血清肌酸酐(sCREAT)和BUN升高、腎小球和腎小管_間質纖維化、高脂血癥、高磷酸鹽血癥和貧血(Kaufman, JM等,KidneyInt, 6:10-7, 197422 ;Platt，R 等，Clin Sci(Lond), 11:217—31，1952 ；Ormrod, D&Miller, T.Nephron, 26:249-54，1980 ；Brenner, BM.Am J Physiol, 249:F324_37, 1985)。這些臨床相關特征的存在，連同技術再現性和商業(yè)可用性為本文所述研究模型的選擇提供了基礎。
[0012]因此，需要顯著并持久增強腎功能的新治療模式，以延緩病情發(fā)展和改善此患者群體的生活質量，并減輕醫(yī)療保健體系的年度費用負擔。再生醫(yī)療技術可提供CKD的下一代治療方案。
[0013]發(fā)明概述
[0014]在一個方面，本發(fā)明提供了一種人腎細胞混合物，其包括第一細胞群、B2和第二細胞群，其中B2包括分離的腎小管細胞富集群，并且其中第二細胞群包括促紅細胞生成素(EPO)生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在一些實施方案中，混合物還包括第三細胞群。在一個實施方案中， B2細胞群還包括集合管上皮細胞。在一個實施方案中，B2細胞群具有耐低氧性。在一個實施方案中，B2細胞群能夠通過HAS-2 (透明質酸合酶-2)的表達在體外和體內生成和/或刺激生成高分子量類型的透明質酸(HA)。在另一個實施方案中，B2細胞群具有碘克沙醇耐受性。在某些實施方案中，B2細胞群的密度介于約1.045g/mL和約1.052g/mL之間。在其它實施方案中，第二細胞群為B4細胞群。在一個實施方案中，B4細胞群的密度介于約1.063g/mL和約1.091g/mL之間。在某些其它實施方案中，第二細胞群為B3細胞群。在一個實施方案中，B3細胞群的密度介于約1.052g/mL和約1.063g/mL之間。在其它實施方案中，混合物包括B2細胞群和B3細胞群。
[0015]在其它實施方案中，混合物缺乏惰性或不需要的組分。在一個實施方案中，混合物不包括或缺乏BI細胞群。在一個實施方案中，BI細胞群包括集合管和腎小管系統(tǒng)的大顆粒細胞，其密度小于~1.045g/mL。在某些其它實施方案中，混合物不包括或缺乏B5細胞群。在一個實施方案中，混合物不包括密度大于~1.091g/mL的B5細胞群，B5細胞群包括低顆粒度和低成活力的細胞碎片和小細胞。
[0016]在某些實施方案中，細胞混合物可穩(wěn)定和/或改善和/或恢復腎功能。在一個實施方案中，混合物能夠吸收受體介導的白蛋白。在其它實施方案中，細胞混合物能夠表達氧可調促紅細胞生成素(EPO)。在其它實施方案中，混合物含有能夠在體外和體內生成和/或刺激生成高分子量類型的透明質酸(HA)的HAS-2表達細胞。在一個實施方案中，經由體內遞送，混合物能夠提供再生刺激。在其它實施方案中，經由體內遞送，混合物夠減輕腎小球濾過、腎小管重吸收、尿液生成和/或內分泌功能的衰退，使這些功能穩(wěn)定或改善。
[0017]在所有實施方案中，第一細胞群和第二細胞群可源自腎組織或培養(yǎng)的腎細胞。在一個實施方案中，B2通過選自下列各項的腎小管細胞標記物的表達來表征:巨蛋白(megalin)、cubilin、透明質酸合酶2 (HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、神經鈣黏著蛋白(Ncad)、上皮鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Acipl)、水通道蛋白-2 (Acip2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rab 17)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域離子轉運調節(jié)子4(Fxyd4)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員Bl(Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3(Aldhla3)和鈣蛋白酶_8 (Capn8)。在另一個實施方案中，B2還通過集合管標記物水通道蛋白_4(Aqp4)標記物的表達來表征。
[0018]在所有實施方案中，B4可通過選自PECAM、VEGF, KDR、HIFla的血管標記物的表達來表征。在某些其它實施方案中，B4可通過腎小球標記物Podocin(Podn)或Nephrin(Neph)的表達來表征。在另一個實施方案中，B4可相對于未分化的(UNFX)B2和B3細胞群表征為氧可調EPO富集群。在另一個實施方案中，B4通過選自下列各項的標記物的表達來表征:趨化因子(C-X-C基序)受體4 (Cxcr4)、內皮素B型受體(Ednrb)、V型膠原a 2 (Col5a2)、鈣黏著蛋白5(Cdh5)、組織纖溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受體(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘連蛋白)(Sparc)、絲甘蛋白(Srgn)、TIMP金屬肽酶抑制因子3 (Timp3)、維耳姆斯瘤I (Wtl)、無翅型MMTV整合位點家族成員4 (Wnt4)、G蛋白信號轉導調節(jié)子4(Rgs4)、血小板-內皮細胞粘附分子(Pecam)和促紅細胞生成素(Epo)。
[0019]在所有實施方案中，B3可通過選自下列各項的標記物的表達來表征:水通道蛋白7 (Aqp 7)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子2 (Fxyd2)、溶質載體家族17 (磷酸鈉)成員3 (Slcl7a3)、溶質載體家族 3 成員 I (Slc3al)、緊密連接蛋白(claudin) 2 (Cldn2)、napsinA天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶質載體家族2 (易化葡萄糖轉運蛋白)成員2 (Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27 (Tmem27)、酰基輔酶A合成酶介質鏈家族成員2(Acsm2)、谷胱甘肽過氧化物酶3 (Gpx3)、果糖-1，6- 二磷酸酶I (Fbpl)和丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶2(Agxt2)。在某些其它實施方案中，B3通過血管表達標記物血小板內皮細胞粘附分子(Pecam)和腎小球表達標記物podocin (Podn)來表征。
[0020]在一個方面，本發(fā)明提供了一種人腎細胞混合物，其包括第一細胞群、B2和第二細胞群，其中B2包括分離的腎小管細胞富集群，并且其中第二細胞群包括表達血管表達標記物血小板內皮細胞粘附分子(Pecam)和腎小球表達標記物podocin(Podn)的一個或多個細胞群。
[0021]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的人腎細胞富集群，其包括B2細胞群，其中B2包括分離的腎小管細胞富集群。在一個實施方案中，B2細胞群能夠通過HAS-2 (透明質酸合酶-2)的表達在體外和體內生成和/或刺激生成高分子量類型的透明質酸(HA)。在某些實施方案中，B2細胞群不包括密度小于~1.045g/mL的BI細胞群，BI細胞群包括集合管和腎小管系統(tǒng)的大顆粒細胞。在另一個實施方案中，B2細胞群不包括密度介于約1.052g/mL和約1 .063g/mL之間的B3細胞群，B3細胞群包括促紅細胞生成素(EPO)生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，B2細胞群不包括密度介于約1.063g/mL和約1.091g/mL之間的B4細胞群。在另外一個實施方案中，B2細胞群不包括密度大于~1.091g/mL的B5細胞群，B5細胞群包括低顆粒度和低成活力的細胞碎片和小細胞。
[0022]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備人B2細胞群的方法，其包括:a)將包括非富集異質 性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下；和b)提取包括B2細胞群的第一細胞組分。在一個實施方案中，相比非富集細胞群時，通過本發(fā)明方法得到的B2細胞群包括較大比例的腎小管細胞以及較小比例的EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，該方法還包括步驟a)和步驟b)之間的步驟，該步驟包括:將細胞懸液與密度梯度接觸以分離一種或多種細胞組分，其中第一細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.045g/mL和約1.052g/mL之間的梯度中。
[0023]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備人B4細胞群的方法，其包括:a)將包括非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下；和《提取包括B4細胞群的第一細胞組分。在一個實施方案中，相比非富集細胞群時，通過本發(fā)明方法得到的B4細胞群包括較大比例的EPO生成細胞、血管細胞和腎小球細胞以及較小比例的非EPO生成細胞、非血管細胞和非腎小球細胞。在另一個實施方案中，該方法還包括步驟a)和步驟b)之間的步驟，該步驟包括:將細胞懸液與密度梯度接觸以分離一種或多種細胞組分，其中第一細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.063g/mL和約1.091g/mL之間的梯度中。
[0024]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備人B3細胞群的方法，其包括:a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下；和b)提取包括B3細胞群的第一細胞組分。在另一個實施方案中，該方法還包括步驟a)和步驟b)之間的步驟，該步驟包括:將細胞懸液與密度梯度接觸以分離一種或多種細胞組分，其中第一細胞組分在離心后存在于比密度介于1.052g/mL和約1.063g/mL之間的梯度中。
[0025]在另一個方面，本發(fā)明還提供了一種制備B2細胞制劑的方法，其包括:a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下山)將細胞懸液施加到流式細胞儀中，該流式細胞儀能夠同時測量細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射；c)從細胞群中選出 細胞亞群；d)分選來自細胞群的細胞亞群；和e)將B2細胞亞群與細胞群分離，其中相對于所述細胞群的大部分而言，B2細胞亞群通過高前向散射和高側向散射來表征。
[0026]在另一個方面，本發(fā)明還提供了一種制備B4細胞制劑的方法，其包括:a)將包括非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下山)將細胞懸液施加到流式細胞儀中，該流式細胞儀能夠同時測量細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射；c)從細胞群中選出細胞亞群；d)分選來自細胞群的細胞亞群；和e)將B4細胞亞群與細胞群分離，其中相對于所述細胞群的大部分而言，B4細胞亞群通過低前向散射和低側向散射來表征。在所有實施方案中，前向散射對應于細胞尺寸。在所有實施方案中，側向散射對應于細胞顆粒度。
[0027]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于向有需要的受試者提供穩(wěn)定和/或改善的腎功能的可植入構建體，其包括:a)生物材料，其包括一種或多種生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白質或肽；和b)哺乳動物腎細胞的混合物，其包括用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合的第一細胞群、B2和第二細胞群。在一個實施方案中，用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合的第二細胞群為B4。在另一個實施方案中，用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合的第二細胞群為B3。在另一個實施方案中，用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合的混合物還包括第三細胞群。在某些實施方案中，用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合的混合物包括B3和B4。在所有實施方案中，混合物可源自哺乳動物腎組織或培養(yǎng)的腎細胞。在一個實施方案中，構建體包括被構建為適于截留和/或附著混合物的三維(3-D)多孔生物材料的生物材料。在另一個實施方案中，構建體包括被構建為適于包埋、附著、懸浮或包覆哺乳動物細胞的液體或半液體凝膠的生物材料。在另一個實施方案中，構建體包括被構建為由呈水凝膠形式的主要為高分子量類型的透明質酸(HA)構成的生物材料。在另一個實施方案中，構建體包括由呈多孔泡沫形式的主要為高分子量類型的透明質酸構成的生物材料。在另外一個實施方案中，構建體包括由大小范圍為5.1kDA至2X106kDA以上的HA分子構成的生物材料。在另一個實施方案中，構建體包括由具有介于約50微米至約300微米之間的孔的聚乳酸基泡沫構成的生物材料。在另外一個實施方案中，構建體包括源自自體腎樣本的一個或多個細胞群。在一個實施方案中，腎樣本為腎活組織檢查樣本。在另外一個實施方案中，構建體包括源自非自體腎樣本的一個或多個細胞群。在一個實施方案中，構建體提供紅細胞穩(wěn)態(tài)。[0028]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者的腎病的方法，其包括:a)對受試者施用包含哺乳動物腎細胞混合物的組合物，所述哺乳動物腎細胞混合物包括第一細胞群、B2和第二細胞群；和《確定來自受試者的試樣的腎功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中指標水平的差值指示受試者的一種或多種腎功能衰退的減輕、穩(wěn)定或改善。在某些實施方案中，所述方法包括含有第三細胞群的細胞混合物。在一個實施方案中，第二細胞群為B4或B3。在另一個實施方案中，第三細胞群為B4或B3。在某些實施方案中，待由本發(fā)明方法治療的腎病伴隨有促紅細胞生成素(EPO)缺乏。在某些實施方案中，EPO缺乏為貧血。在一些實施方案中，EPO缺乏或貧血繼發(fā)于受試者的腎衰竭。在一些其它實施方案中，EPO缺乏或貧血繼發(fā)于選自下列的疾病:慢性腎衰竭、原發(fā)性EPO缺乏、化學療法或抗病毒療法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、類風濕性關節(jié)炎或多器官系統(tǒng)衰竭。在某些實施方案中，用于該方法的組合物還包括包含一種或多種生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白質或肽的生物材料，其中混合物用生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合。
[0029]在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的細胞制劑及其混合物或可植入構建體用于制備治療有需要的受試者的腎病、貧血或EPO缺乏的制劑的用途。
[0030]在一個方面，本發(fā)明提供了一種選定的腎細胞群，其在約1%至約5%的氧含量下暴露約12至約24小時后可通過密度梯度離心來分離，所述梯度包括密度為約1.045g/mL至約1.052g/mL的部分，其中細胞群(i)在離心后保留于密度介于1.045g/mL至約1.052g/mL之間的梯度中；(ii)包括腎小管細胞群，其通過至少一種腎小管細胞標記物的表達來表征；(iii)包括腎小管細胞亞群，其能夠轉運受體介導的白蛋白；(iv)能夠在遞送至有患腎病風險或患有腎病的受試者時調節(jié)一種或多種腎功能。
[0031]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種選定的腎細胞群，其在約1%至約5%的氧含量下暴露約12至約24小時后可通過密度梯度離心來分離，所述梯度包括密度為約1.063g/mL至約1.091g/mL的部分,其中細胞群(i)在離心后保留于密度介于約1.063g/mL至約1.091g/mL之間的梯度中；(ii)包括氧可調促紅細胞生成素(EPO)表達細胞、腎小球細胞和血管細胞；(iii)能夠在遞送至有患腎病風險或患有腎病的受試者時調節(jié)一種或多種腎功能；和(iv)能夠在聯(lián)合施用時通過權利要求65所述的腎細胞群增強對一種或多種腎功能的調節(jié)。
[0032]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種腎細胞群，其中將所述細胞進行如下操作:i)置于經組織培養(yǎng)處理的標準塑料盤上進行貼壁培養(yǎng)，其中初始密度為25，000個細胞/厘米2，培養(yǎng)基由高含量葡萄糖DMEM和完全補充KSFM培養(yǎng)基的1:1混合物組成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧氣條件下培養(yǎng)24-72小時；ii)用相同培養(yǎng)基更換50-100%的培養(yǎng)基，并在37°C和2%的氧氣條件下培養(yǎng)18-24小時；iii)經由胰蛋白酶消化來收集，再懸浮，并用不含血清的KSFM培養(yǎng)基或PBS洗滌；iv)加載到制備好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.045g/mL至約1.052g/mL之間的層，并包含密度較大的至少一層和密度較小的至少一層，其中梯度在15mL圓錐管中制備,液體總體積不小于5mL且不大于14mL，并且加載到該梯度中的細胞數目至少為5000萬但不超過I億；v)通過在800x G下連續(xù)離心20-30分鐘來迫使細胞通過梯度；在介于1.045g/mL和1.052g/mL之間的密度處分段；和/或通過選自下列各項的標記物表征:巨蛋白、cubilin、透明質酸合酶2 (HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、N-鈣黏著蛋白(Ncad)、E-鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rab17)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4 (FxycM)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3(Aldhla3)、鈣蛋白酶-8 (CapnS)和水通道蛋白_4 (Aqp4)標記物；和/或能夠使患有腎病的免疫相容受試者的一種或多種腎功能 的衰退減輕，使其穩(wěn)定或改善。
[0033]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種腎細胞群，其中將所述細胞進行如下操作:i)置于經組織培養(yǎng)處理的標準塑料盤上進行貼壁培養(yǎng)，其中初始密度為25，000個細胞/厘米2，培養(yǎng)基由高含量葡萄糖DMEM和完全補充KSFM培養(yǎng)基的1:1混合物組成，其中含5%的胎牛血清，在37°C和21%的氧氣條件下培養(yǎng)24-72小時；ii)用相同培養(yǎng)基更換50-100%的培養(yǎng)基，并在37°C和2%的氧氣條件下培養(yǎng)18-24小時；iii)經由胰蛋白酶消化來收集，再懸浮，并用不含血清的KSFM培養(yǎng)基或PBS洗滌；iv)加載到制備好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.063g/mL至約1.091g/mL之間的層，并包含密度較大的至少一層和密度較小的至少一層，其中梯度在15mL圓錐管中制備,液體總體積不小于5mL且不大于14mL,并且加載到該梯度中的細胞數目至少為5000萬但不超過I億；V)通過在800x G下連續(xù)離心20-30分鐘來迫使細胞通過梯度；在介于1.063g/mL和約1.091g/mL之間的密度處分段；和/或通過選自下列各項的標記物表征:VEGF、KDR、HIFla、Podocin (Podn)或Nephrin (Neph)、趨化因子(C-X-C基序)受體4 (Cxcr4)、內皮素B型受體(Ednrb)、V型膠原a2(Col5a2)、鈣黏著蛋白5(Cdh5)、組織纖溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受體(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘連蛋白)(Sparc)、絲甘蛋白(Srgn)、TIMP金屬肽酶抑制因子3(Timp3)、維耳姆斯瘤I (Wtl)、無翅型MMTV整合位點家族成員4(Wnt4)、G蛋白信號轉導調節(jié)子4(Rgs4)、血小板-內皮細胞粘附分子(Pecam)和促紅細胞生成素(Epo);和/或能夠使患有腎病的免疫相容受試者的一種或多種腎功能的衰退減輕，使其穩(wěn)定或改善。
[0034]在一個方面，本發(fā)明提供了分離的促紅細胞生成素(EPO)生成腎細胞群。在一個實施方案中，該細胞群為分離的EPO生成哺乳動物細胞富集群。在另一個實施方案中，該細胞群為分離的促紅細胞生成素(EPO)生成哺乳動物細胞富集群，其相比包含促紅細胞生成素(EPO)生成哺乳動物細胞群的非富集群而言，其包含較大比例的EPO生成細胞。
[0035]該細胞群可源自腎組織或培養(yǎng)的腎細胞。該細胞群可源自得自受試者的腎樣本。該樣本可為來源于得自受試者的腎樣本的腎組織或培養(yǎng)的腎細胞。在另一個實施方案中，該細胞群相比包含EPO生成哺乳動物細胞的非富集群而言包含較大比例的EPO生成細胞。在另一個實施方案中，該細胞群相比包含促紅細胞生成素(EPO)生成哺乳動物細胞的非富集群而言包含較小比例的腎小管細胞。
[0036]在所有實施方案中，該細胞群可富集EPO生成細胞。在所有實施方案中，該細胞群可富集非EPO生成細胞。在所有實施方案中，該細胞群可富集腎小管細胞。
[0037]在另一個方面，本發(fā)明提供了在某些培養(yǎng)條件下生物應答的促紅細胞生成素(EPO)生成細胞的細胞群。在另一個實施方案中，當相對于在非低氧條件下培養(yǎng)的細胞群而將細胞群在低氧條件下培養(yǎng)時，生物應答為EPO表達的誘導。在另一個實施方案中，當相對于在非低氧條件下培養(yǎng)的細胞群而將細胞群在低氧條件下培養(yǎng)時，生物應答為EPO表達的增加。在一些實施方案中，低氧培養(yǎng)條件包括但不限于相對于在氧含量未降低的條件下培養(yǎng)的細胞群而言，將細胞群的培養(yǎng)體系中的可用氧含量降低。在另一個實施方案中，可用氧含量的降低約小于5%,而氧含量未降低的條件為大氣氧含量(約21%)。在另一個實施方案中，相比在大于或等于21%的氧含量下試驗的培養(yǎng)物而言，可在低于大氣水平(21%)的氧含量下觀察到EPO表達的增加。在另一個實施方案中，當將細胞在約小于5%的氧氣(即低氧培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)時，并且將誘導水平和/或增加的表達與在大氣氧含量(約21%)(即非低氧培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)的細胞進行比較時，可觀察到EPO表達的誘導和/或增加。在一個實施方案中，對低氧條件生物應答的EPO表達通過低氧誘導因子HIF來調節(jié)。在另一個實施方案中，對低氧條件生 物應答的EPO表達通過HIFla來調節(jié)。在另一個實施方案中，對低氧條件生物應答的EPO表達通過低氧誘導因子HIF2 a來調節(jié)。
[0038]在一個實施方案中，當相對于未經灌流培養(yǎng)的細胞群而將細胞群經由灌流培養(yǎng)時，生物應答為EPO表達的誘導。在另一個實施方案中，相對于未經灌流培養(yǎng)的細胞群而言，生物應答為EPO表達的增加。在一些實施方案中，灌流條件包括但不限于對流體進行短暫、間歇或連續(xù)的循環(huán)或攪拌，使得動力經由流體流動傳遞至細胞。在另一個實施方案中，所進行的灌流培養(yǎng)條件應使得細胞群在可提供允許形成三維結構的骨架和/或空間的材料中或其上培養(yǎng)。
[0039]在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文所述細胞群的腎細胞的混合物或組合。在一個實施方案中，細胞混合物包括富集EPO生成細胞的第一細胞群和未富集EPO生成細胞的第二細胞群。在另一個實施方案中，第二細胞群可包含一種或多種類型的腎源細胞，其可包括但不限于下列一種或多種細胞:源自腎小管的細胞、源自腎小球的細胞、源自間質組織的細胞、源自集合管的細胞、源自結締組織的細胞、源自血液的細胞或源自血管的細胞。在另一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞。
[0040]在所有實施方案中，本文所述的腎小管細胞可通過腎小管細胞標記物的表達來表征，所述腎小管細胞標記物可包括但不限于下列各項的一種或多種:透明質酸合酶
2(HAS2)、CYP2D25 (維生素D325-羥化酶)、巨蛋白、cubilin、神經鈣黏著蛋白、上皮鈣黏著蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rab17)、GATA結合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4 (Fxyd4)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員
4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3 (Aldhla3)和鈣蛋白酶-8 (Capn8)。
[0041]在一個方面，本發(fā)明提供了分離的哺乳動物腎小管細胞富集群。在一個實施方案中，分離的細胞群富集腎小管細胞并包含至少一些EPO生成哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，該細胞群相比包含腎小管細胞的非富集群而言具有較大比例的腎小管細胞。在另一個實施方案中，分離的哺乳動物腎小管細胞富集群相比包含腎小管細胞的非富集群而言包含較大比例的腎小管細胞和至少一些EPO生成哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，相比未分化的異質性混合物或相比EPO生成細胞富集群而言，哺乳動物腎小管細胞富集群相對缺乏EPO生成細胞。
[0042]在所有實施方案中，本文所述的腎細胞群或腎細胞群混合物的來源類型可為自體的、同種異體的、同系的(自體的或同基因的)及其任意組合。例如，在一些實施方案中，細胞混合物可包含(i)源自自體源的第一細胞群和源自自體源的第二細胞群；或(ii)源自自體源的第一細胞群和源自同種異體源的第二細胞群。
[0043]在另一個方面，本發(fā)明提供了產生富集EPO生成細胞的細胞群的方法。在一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)由機械分離或酶消化的哺乳動物腎組織制備具有非富集異質性嚙齒動物腎細胞群的細胞懸液；b)將細胞懸液與密度梯度接觸，以基于浮力密度分離一種或多種細胞組分；c)將步驟b)的細胞懸液離心以限定一種或多種細胞組分；和
d)提取包含富集細胞 群的第一細胞組分，其中富集細胞群相比非富集細胞群具有較大比例的EPO生成細胞和較小比例的非EPO生成細胞。在另一個實施方案中，密度梯度包括比密度介于約1.025g/mL和約1.035g/mL之間或小于約1.045g/mL的層。在另一個實施方案中，步驟d)的第一細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.025g/mL和約1.035g/mL之間或小于約1.045g/mL的梯度中。在另一個實施方案中，離心步驟(c)還產生至少一種附加細胞組分，其未富集所述EPO生成富集細胞群。在另一個實施方案中，該方法還包括步驟e)提取至少一種附加細胞組分。在另一個實施方案中，密度梯度包括比密度介于約1.062g/mL和約1.088g/mL之間的層。在另一個實施方案中，附加細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.062g/mL和約1.088g/mL之間的梯度中。
[0044]在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)由培養(yǎng)的包含至少一些表達或能夠表達EPO的細胞的非富集異質性哺乳動物細胞群制備細胞懸液；b)使細胞懸液與密度梯度接觸，以基于浮力密度分離一種或多種細胞組分；c)將步驟b)的細胞懸液離心，以限定一種或多種細胞組分；和d)提取包含富集細胞群的第一細胞組分，其中相比非富集細胞群，富集細胞群具有較大比例的EPO生成細胞和較小比例的非EPO生成細胞。在一個實施方案中，步驟a)的細胞懸液得自培養(yǎng)的非富集異質性嚙齒動物細胞群。在此實施方案中，密度梯度包括比密度介于約1.073g/mL和約1.091g/mL之間的層。在一個實施方案中，步驟d)的第一細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.073g/mL和約1.091g/mL的梯度中。在另一個實施方案中，離心步驟(c)還產生至少一種附加細胞組分，其未富集所述EPO生成富集細胞群。在另一個實施方案中，該方法還包括步驟e)提取至少一種附加細胞組分。在另一個實施方案中，密度梯度包括比密度介于約1.041g/mL和約1.062g/mL之間的層。在另一個實施方案中，附加細胞組分在離心后存在于比密度介于約1.041g/mL和約1.062g/mL之間的梯度中。
[0045]在一些實施方案中，富集細胞群富集EPO生成細胞，而缺乏非EPO生成細胞。在其它實施方案中，富集細胞群富集間質成纖維細胞，而缺乏腎小管細胞和集合管細胞。在另一個實施方案中，富集細胞群富集EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，離心步驟(c)還產生至少一種附加細胞組分，其未富集所述富集細胞群。在一些實施方案中，相比非富集細胞群而言，附加細胞組分包含較大比例的非EPO生成細胞和較小比例的EPO生成細胞。在一個實施方案中，相比第一細胞組分而言，至少一種附加細胞組分具有較小比例的EPO生成細胞。在另一個實施方案中，相比第一細胞組分而言，附加細胞組分包含較大比例的腎小管細胞。
[0046]在一些實施方案中，產生富集EPO生成細胞的細胞群的方法中所使用的密度梯度為碘克沙醇密度梯度。
[0047]在另一個方面，本發(fā)明提供了使用流式細胞術產生促紅細胞生成素EPO生成細胞富集群的方法。在一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)由機械分離或酶消化的哺乳動物腎組織制備包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液山)將細胞懸液施加到流式細胞儀中，該流式細胞儀能夠同時測量細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射；c)從細胞群中選出細胞亞群；d)分選來自細胞群的細胞亞群；和e)將細胞亞群與細胞群分離，其中相對于整個細胞群而言，細胞亞群通過低前向散射和低側向散射來表征。
[0048]在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)由培養(yǎng)的包含至少一些表達或能夠表達EPO的細胞的哺乳動物細胞群制備細胞懸液；b)將細胞懸液施加到流式細胞儀中，該流式細胞儀能夠同時測量細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射；c)從細胞群中選出細胞亞群；d)分選來自細胞群的細胞亞群；和e)將細胞亞群與細胞群分離，其中相對于整個細胞群而言，細胞亞群通過低前向散射和低側向散射來表征。
[0049]在另一個實施方案中，前向散射對應于細胞尺寸。在一個實施方案中,側向散射對應于細胞粒度。本發(fā)明的其它實施方案提供了富集的細胞組分，其:i)富集EPO生成細胞而缺乏非EPO生成細胞；或ii)富集生成EPO的特化間質皮質成纖維細胞而缺乏上皮細胞細胞。在另一個實施方案中，選擇步驟c)包括產生所述未富集細胞群的至少一種附加組分。在另一個實施方案中，相比EPO富集組分而言，一種或多種附加組分包含較小比例的EPO生成細胞。
[0050]在本發(fā)明的另一方面，所述方法包括進一步體外培養(yǎng)的步驟。在一個實施方案中，在分離后將富集細胞群進行體外培養(yǎng)。在另一個實施方案中，該培養(yǎng)步驟包括在適于支持所述細胞群生長和/或維持的培養(yǎng)基中，在適于哺乳動物細胞培養(yǎng)的玻璃或塑料表面上采用二維單層培養(yǎng)。在其它實施方案中，培養(yǎng)步驟包括在適于細胞維持和/或生長的三維(3D)支架上培養(yǎng)細胞。在另一個實施方案中，支架包含一種或多種生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白質或肽。在另一個實施方案中，支架被構建為適于截留或附著哺乳動物細胞的多孔支架。在其它實施方案中，支架被構建為適于包埋、附著或包覆哺乳動物細胞的凝膠。
[0051] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包括在灌流條件下進行培養(yǎng)步驟的方法。在一個實施方案中，灌流條件包括但不限于對流體進行短暫、間歇或連續(xù)的循環(huán)或攪拌，使得動力經由流體流動傳遞至細胞。在另一個實施方案中，所進行的灌流培養(yǎng)條件應使得細胞群在可提供允許形成三維結構的骨架和/或空間的材料中或之上培養(yǎng)。
[0052]在另一個方面，本發(fā)明提供了包括在低氧條件下進行培養(yǎng)的步驟的方法。在一些實施方案中，低氧培養(yǎng)條件包括但不限于相對于在氧含量未降低的條件下培養(yǎng)的細胞群而言，將細胞群的培養(yǎng)體系中的可用氧含量降低。在另一個實施方案中，可用氧含量的降低約小于5%,而氧含量未降低的條件為大氣氧含量(約21%)。在另一個實施方案中,低氧條件以氧含量小于21% (大氣)為代表。
[0053]在另一個方面，本發(fā)明提供了包括對細胞群中的EPO表達進行測量的步驟的方法。在所有實施方案中，EPO表達為EPO mRNA表達。在所有實施方案中，可檢測和/或檢測出EPO表達。在另一個實施方案中，相對于未經灌流培養(yǎng)的細胞群而言，EPO表達在經由灌流培養(yǎng)的細胞群中誘導。在其它實施方案中，相對于在非低氧條件下培養(yǎng)的細胞群而言，EPO表達在低氧條件下培養(yǎng)的細胞群中誘導。在另一個實施方案中，相對于未經灌流培養(yǎng)的細胞群而言，經灌流培養(yǎng)的細胞群中可檢測到的EPO表達較高。在其它實施方案中，相對于在非低氧條件下培養(yǎng)的細胞群而言，低氧條件下培養(yǎng)的細胞群中可檢測到的EPO表達較高。在另一個實施方案中，當將細胞在約小于5%的氧氣(即，低氧培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)，并且將誘導水平和/或增加的表達與在大氣氧含量(約21%)(即，非低氧培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)的細胞進行比較時，可觀察到EPO表達的誘導和/或增加。在另一個實施方案中，在低于21%氧氣(大氣)的條件下培養(yǎng)細胞時可觀察到EPO表達的增加。
[0054]在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文所述的一個或多個細胞群的可植入構建體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于向有需要的受試者提供促紅細胞生成素(EPO)生成細胞群 的可植入構建體，其中該構建體包括:a)支架，其包含一種或多種生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白質或肽；和幻富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群，其沉積在支架表面上或表面中。
[0055]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于向有需要的受試者提供促紅細胞生成素EPO生成細胞群的可植入構建體，其中該構建體包括:a)多孔支架，其包含一種或多種生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白質或肽；和b)細胞混合物，其包含i)富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群，和ii)富集非EPO生成細胞的第二細胞群，其中細胞混合物沉積在支架表面上和/或支架孔內。在一些實施方案中，相對于第二細胞群而言，第一細胞群中的EPO表達較高。在另一個實施方案中，第二細胞群包含一種或多種腎源細胞類型，其可包括但不限于下列一種或多種細胞:源自腎小管的細胞、源自腎小球的細胞、源自間質組織的細胞、源自結締組織的細胞、源自集合管的細胞、源自血液的細胞或源自血管的細胞。在另一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞。本發(fā)明的一些實施方案提供了富集腎小管細胞的細胞群，所述腎小管細胞通過腎小管細胞標記物的表達來表征，所述腎小管細胞標記物包括但不限于下列蛋白的一種或多種:巨蛋白、cubilin、神經鈣黏著蛋白、上皮鈣黏著蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白_2。
[0056]在一個實施方案中，本發(fā)明所提供的腎細胞混合物可包括源自本文所述類型的腎組織源的細胞群。在其它實施方案中，第一細胞群和第二細胞群源自腎組織或培養(yǎng)的腎細胞。在另一個實施方案中，相比包含促紅細胞生成素(EPO)生成哺乳動物細胞的非富集群而言，第一細胞群包含較大比例的EPO生成細胞。在另一個實施方案中，除了 EPO生成細胞外，第一細胞群還包含腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，相比第二細胞群而言，第一細胞群包含較大比例的EPO生成細胞。本發(fā)明的其它實施方案包括第一細胞群，相比促紅細胞生成素(EPO)生成哺乳動物細胞的非富集群而言，該第一細胞群包含較小比例的腎小管細胞。在其它實施方案中，相比第二細胞群而言，第一細胞群包含較小比例的腎小管細胞。在一些實施方案中，用細胞和生物材料配合。在一個實施方案中，將支架或生物材料構建為三維(3-D)多孔支架。在另一個實施方案中，3-D多孔支架適于截留或附著哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，將支架或生物材料構建為適于包埋、附著或包覆哺乳動物細胞的液體或半液體凝膠。在一個實施方案中，適用于本發(fā)明構建體的細胞群源自自體或非自體腎樣本。在另一個實施方案中，樣本為腎活組織檢查樣本。
[0057]在另一個方面，本發(fā)明提供了對需要富集EPO生成細胞的細胞群的受試者進行治療的方法。在一個實施方案中，治療有需要的促紅細胞生成素(EPO)缺乏的受試者的方法包括對受試者施用組合物的步驟，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群。在另一個實施方案中，第一細胞群富集EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在一個實施方案中，EPO缺乏為貧血。在另一個實施方案中，EPO缺乏或貧血繼發(fā)于受試者的腎衰竭。在另一個實施方案中，EPO缺乏或貧血繼發(fā)于選自下列的疾病:慢性腎衰竭、原發(fā)性EPO缺乏、化學療法或抗病毒療法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、類風濕性關節(jié)炎或多器官系統(tǒng)裳竭。[0058]在另一個實施方案中，治療有需要的腎病受試者的方法包括對受試者施用組合物的步驟，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群。在另一個實施方案中，第一細胞群富集EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。
[0059]在一些實施方案中，向有需要的受試者施用的組合物還包含未富集EPO生成細胞的第二腎細胞群。在其它實施方案中，所述組合物還包括多孔支架，該多孔支架包含一種或多種生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白質或肽，其中第一細胞群沉積在支架表面上和/或支架的孔內。在另一個實施方案中，該組合物還包括多孔支架，該多孔支架包含一種或多種生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白質或肽，其中第一細胞群和第二細胞群沉積在支架表面上和/或支架孔內。在另一個實施方案中，第一細胞群和/或第二細胞群源自哺乳動物腎組織或培養(yǎng)的哺乳動物腎細胞。在其它實施方案中，第一細胞群和/或第二細胞群源自自體或非自體腎樣本。在一個實施方案中，樣本為腎活組織檢查樣本。
[0060]在一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞。在另一個實施方案中，腎小管細胞通過腎小管細胞標記物的表達來表征，所述腎小管細胞標記物可包括但不限于下列蛋白的一種或多種:巨蛋白、cubilin、神經鈣黏著蛋白、上皮鈣黏著蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
[0061]在所有的實施方案中，第二細胞群包含選自下列的一種或多種腎源細胞類型:源自腎小管的細胞、源自腎小球的細胞、源自間質組織的細胞、源自集合管的細胞、源自結締組織的細胞、源自血液的細胞或源自血管的細胞。在所有實施方案中，相對于異質性未分化群或第一細胞群而言，第二細胞群相對缺乏腎小球細胞、血管細胞和氧應答EPO生成細胞。
[0062]在另一個方面，本發(fā)明包括為有需要的受試者提供紅細胞穩(wěn)態(tài)的方法。在一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)對受試者施用組合物，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群；和b)確定來自受試者的樣本中紅細胞生成功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中指標水平的差值指示受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)。
[0063]在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)對受試者施用組合物，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群和未富集EPO生成細胞的第二細胞群；和b)確定來自受試者的樣本中紅細胞生成功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中指標水平的差值指示受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)。
[0064]在另一個方面，本發(fā)明包括改善有需要的受試者的腎功能的方法。在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)對受試者施用組合物，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群；和b)確定來自受試者的樣本中腎功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中指標水平的差值指示受試者的腎功能得到改善。在另一個實施方案中，所述組合物還包括多孔支架，該多孔支架包含一種或多種生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白質或肽，其中第一細胞群沉積在支架表面上和/或支架孔內。
[0065]在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:a)對受試者施用組合物，該組合物包含富集EPO生成哺乳動物細胞的第一細胞群和未富集EPO生成細胞的第二細胞群；和b)確定來自受試者的樣本中腎功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中指標水平的差值指示受試者的腎功能得到改善。在另一個實施方案中，所述組合物還包括多孔支架，該多孔支架包含一種或多種生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白質或肽，其中第一細胞群和第二細胞群沉積在支架表面上和/或支架孔內。
[0066]在其它實施方案中，第一細胞群和/或第二細胞群源自哺乳動物腎組織或培養(yǎng)的哺乳動物腎細胞。在另一個實施方案中，第一細胞群和/或第二細胞群源自自體或非自體腎樣本。在另一個實施方案中，樣本為腎活組織檢查樣本。 [0067]在一個實施方案中，第一細胞群富集低氧應答EPO生成細胞。在另一個實施方案中，第一細胞群富集低氧應答EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。
[0068]在一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞。在另一個實施方案中，腎小管細胞通過腎小管細胞標記物的表達來表征，所述腎小管細胞標記物可包括但不限于以下物質的一種或多種:透明質酸合酶2(HAS2)、CYP2D25 (維生素D325-羥化酶)、巨蛋白、cubilin、神經鈣黏著蛋白、上皮鈣黏著蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2和水通道蛋白-4。在另一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞并包含集合管的上皮細胞。在另一個實施方案中，第二細胞群相對富集腎小管細胞，包含集合管上皮細胞，而相對缺乏低氧應答EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。
[0069]附圖簡述
[0070]圖1示出突出患病腎組織相比正常腎組織的纖維化的Gomori Trichrome染色。
[0071]圖2示出患慢性腎病的豬的細胞中促紅細胞生成素基因的氧調節(jié)表達。
[0072]圖3示出增殖培養(yǎng)物中的小管樣結構。
[0073]圖4示出培養(yǎng)的功能性腎小管細胞對受體介導的白蛋白吸收。
[0074]圖5示出EPO表達在分離后比在初始人腎組織中相對更高。
[0075]圖6示出培養(yǎng)的人腎細胞中對EPO基因表達的保留水平。
[0076]圖7示出大氣(21%)氧含量下的3D培養(yǎng)物中動態(tài)培養(yǎng)的(+)ΕΡ0表達的結果。
[0077]圖8示出低(2%)氧含量下的3D培養(yǎng)物中動態(tài)培養(yǎng)的(+)ΕΡ0的表達。
[0078]圖9示出長期培養(yǎng)物中動態(tài)培養(yǎng)的(+)腎小管基因的表達。[0079]圖10示出低氧培養(yǎng)物(相對常氧培養(yǎng)物)中的EPO表達。
[0080]圖11示出體外動態(tài)3D培養(yǎng)物對EPO表達的刺激。
[0081]圖12A-12B示出從2D培養(yǎng)物和3D培養(yǎng)物中收集的細胞裂解物(圖12A)和條件培養(yǎng)基(圖12B)中定量靶蛋白的ELISA結果。
[0082]圖13示出H&E染色的接種OPLA和I型膠原支架(灌流或靜態(tài)培養(yǎng)(7)天后染色)，其通過標準技術固定在10%福爾馬林緩沖液中并經石蠟包埋。進行H&E染色以檢驗細胞的存在和形態(tài)。灌流支架中的細胞含量高于靜態(tài)支架中的細胞含量，相比OPLA支架，I型膠原支架中的細胞含量明顯更高。灌流I型膠原支架中的細胞形成相比靜態(tài)I型膠原支架中更為顯著。
[0083]圖14A-14H示出(灌流或靜態(tài))培養(yǎng)(7)天后OPLA和I型膠原支架的掃描式電子顯微照片(SEM)。注意到灌流(相比靜態(tài))具有更高的細胞含量，并且在I型膠原支架灌流(相比靜態(tài))條件下具有優(yōu)良的細胞形成和互聯(lián)性。
[0084]圖15示出通過添加裂解緩沖液(Qiagen)從支架或2D培養(yǎng)物分離的mRNA的RT-PCR結果。對于3D支架，利用電勻漿化(polytron)來確保RNA的充分裂解與釋放。用對目標靶基因特異的內含子跨越引物對純化的mRNA進行RT-PCR分析(泳道1_7:各3D結構(灌流)/5日培養(yǎng)物；泳道8-10:各2D結構/5日培養(yǎng)物；泳道11-17:各初始細胞群(接種前)；泳道18-19:2D培養(yǎng)物/4日培養(yǎng)物；泳道21:宏觀解剖的新鮮組織)。
[0085]圖16示出三種不同接種的支架中的代謝活性。
[0086]圖17A-17D示出原代腎細胞的灌流和靜態(tài)3D培養(yǎng)物對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗。
[0087]圖18示出治療后的嚙齒動物平均存活率(天)。
[0088]圖19示出整個研究過程中的嚙齒動物體重。
[0089]圖20圖示了治療前至死亡期間的重量增量。
[0090]圖21示出每周平均血清BUN濃度。
[0091]圖22示出每周平均血清肌酸酐濃度。
[0092]圖23示出中期時的相對BUN/個體大鼠數據。
[0093]圖24示出中期時的相對血清肌酸酐/個體大鼠數據。
[0094]圖25示出每周中期時的平均HCT、相對HCT (個體大鼠數據)。
[0095]圖26A示出中期時的相對HCT (個體大鼠數據)。
[0096]圖26B和26C示出腎切除術后的血清肌酸酐(圖26B)和血細胞比容(圖26C)。
[0097]圖27示出每周的平均RBC#。
[0098]圖28示出中期時的相對RBC#/個體大鼠數據。
[0099]圖29A-29E示出最終血清電解質濃度。
[0100]圖30示出相對血清磷(最終)/個體大鼠數據。
[0101]圖31A-31D示出最終血清蛋白濃度。
[0102]圖32A-32B示出相對血清白蛋白&蛋白總量(最終)/個體大鼠數據。
[0103]圖33A-33D示出最終血清肝功能。
[0104]圖34A-34C示出最終血清膽固醇、三酸甘油酯和葡萄糖。
[0105]圖35A-35C示出相對血清膽固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(最終)/個體大鼠數據。
[0106]圖36A-36C 示出最終 Hb、MCH 和 MCHC。[0107]圖37示出最終相對[Hb]/個體大鼠數據。
[0108]圖38示出最終WBC計數。
[0109]圖39示出最終WBC組成。
[0110]圖40A-40B示出最終網織紅細胞。
[0111]圖41A-41B示出最終血小板數據。
[0112]圖42示出游泳試驗結果。
[0113]圖43示出每個試驗組的代表性H&E-染色的骨髓組織切片。上圖顯示，與對照組相t匕，腎切除+細胞注入組的骨髓細胞含量和骨髓與紅細胞的比率看起來相同。相比之下，腎切除+構建體組和未治療動物組中的骨髓分別顯示出中度、顯著降低的骨髓細胞含量(放大率200倍)。下圖示出上圖中被框起的圖的高清視圖(放大率未知)。
[0114]圖44A-44B示出每個試驗組的代表性H&E-染色的脾組織切片。圖顯44A示在對照組和腎切除+細胞注入組之間沒有觀察到顯著的組織學差異或變化。相比之下，在腎切除+構建體組和未治療動物組中的緊鄰囊下的紅髓間隙，顯示成人紅細胞(RBC)和RBC前體分別存在中度和 顯著的降低(放大率200倍)。圖44B示出圖44A中被框起的圖的高清視圖(放大率未知)。
[0115]圖45A-45B示出每個試驗組的代表性H&E-染色的肝組織切片。相比對照組，在腎切除+構建體組或未治療的腎切除動物組中未觀察到顯著的肝實質和/或肝門三聯(lián)征變化。相比之下，未在腎切除+細胞注入組中觀察到竇狀隙血細胞生成焦點區(qū)(圓形)(放大率200倍)。圖45B示出圖45A中示出的肝門三聯(lián)征的高清視圖(放大率未知)。
[0116]圖46A-46B示出每個試驗組的代表性H&E-染色的腎組織切片(放大率I倍)。圖46A顯示，相比對照組，其它三組的腎切片顯示出結構缺失的進行性腎小球和腎小管變性，在所有對照組中，通過不良的血鐵黃素和多灶性腎小管再生來表征(放大率200倍)。箭頭指向構建體治療部位。圖46B示出圖46A中被框起的圖的高清視圖(放大率未知)。
[0117]圖47示出個體大鼠數據/HCT%(相對血清肌酸酐)。第5組=實心圓；第6組=環(huán)繞的“3”；第4組=環(huán)繞的“I”;第I組=環(huán)繞的“4”;第2組=環(huán)繞的“2”。
[0118]圖48A-48B示出采用多層分級梯度技術(圖48A)或單層混合梯度技術使來自新鮮分離腎組織的epo生成細胞組分富集。兩種方法均導致非epo生成細胞組分(主要為腎小管細胞)從epo帶局部缺失,該epo帶介于1.025g/mL和1.035g/mL之間。
[0119]圖49A示出確定上皮鈣黏著蛋白表達的定量實時PCR(QRTPCR)結果。
[0120]圖49B示出采用密度分級梯度確定Epo富集的定量實時PCR(QRTPCR)結果。
[0121]圖50A-50C圖示了分級梯度組分在分離和培養(yǎng)時的相對基因表達。圖50A和50B示出在組織分離后立即進行密度梯度分離的兩批獨立的原代腎細胞。在兩批細胞中，促紅細胞生成素(Epo)mRNA的表達在分級梯度的帶I中可再生地富集。將所有樣本中的Epo表達標準化為新鮮消化的異質性腎細胞群。圖50C清楚地顯示除了富集EPO表達外，帶I還相對缺乏腎小管細胞，這可通過腎小管標記物、神經鈣黏著蛋白、上皮鈣黏著蛋白、水通道蛋白I和水通道蛋白2的低表達來證實。相比之下，腎小管標記物在帶2和帶3中富集，突出分級梯度的附加特征-同時富集腎小管細胞組分。
[0122]圖51示出水通道蛋白-1 (腎小管細胞標記物)的蛋白質印跡分析(Western Blotanalysis)。此蛋白質印跡示出水通道蛋白I在帶2和帶3中有清晰和明確的富集,這進一步支持了組分2和組分3的腎小管細胞富集，如圖2中圖(d)所描述。
[0123]圖52示出治療后16周的血細胞比容水平。
[0124]圖53示出治療后12周的血紅蛋白水平。
[0125]圖54示出用兩種不同劑量的rEPO治療的5/6腎切除大鼠(與對照組和未治療組相比)隨時間變化的血細胞比容水平。
[0126]圖55示出用高和低劑量的EPO富集細胞治療的5/6腎切除大鼠(與腎小管富集細胞和rEPO相比)隨時間變化的血細胞比容水平。
[0127]圖56A和56B示出治療后16周的血清肌酸酐濃度以及治療前至治療后16周期間肌酸酐占對照組的百分比。
[0128]圖57不出治療后12周的游泳耐力結果。
[0129]圖58示出治療后16周的重量增量占初始重量的百分比。
[0130]圖59示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療的尿毒癥大鼠中血清肌酸酐占健康對照組的百分比。
[0131]圖60示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療后12周的尿毒癥大鼠中白蛋白/球蛋白的比率。 [0132]圖61示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療后12周的尿毒癥大鼠中憐丐的比率。
[0133]圖62示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療后12周的尿毒癥大鼠中的血清三酸甘油酯水平。
[0134]圖63示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療后12周的尿毒癥大鼠中的血清膽固醇水平。
[0135]圖64示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)處理后12周的尿毒癥大鼠中的血清血紅蛋白水平。
[0136]圖65示出未治療的尿毒癥大鼠和用高劑量EPO富集細胞(原型#2)或腎小管富集細胞(原型#4)治療后12周的尿毒癥大鼠中的血細胞比容水平。
[0137]圖66示出功能性嚙齒動物腎小管細胞對羅丹明綴合白蛋白的吸收。
[0138]圖67示出與未治療的尿毒癥大鼠相比，新腎細胞(異質性EPO生成細胞)治療的尿毒癥大鼠的血清肌酸酐、腎功能指標維持在接近正常的水平。
[0139]圖68示出對從正常人體腎臟分離和增殖的腎小管和腎小球細胞的表型特征的維持。
[0140]圖69示出與3D動態(tài)培養(yǎng)物中的腎小管缺乏群相比，腎小管富集群中的腎小管標記物、鈣黏著蛋白的表達增加。
[0141]圖70示出通過流式細胞術對EPO生成細胞進行分離。
[0142]圖71示出“常氧”(21%氧)和“低氧”(2%氧)嚙齒動物培養(yǎng)物的分級梯度，這些培養(yǎng)物分別收集并一起施加至相同的分級梯度中。
[0143]圖72示出“常氧”(21%氧)和“低氧”(2%氧)犬科動物培養(yǎng)物的分級梯度，這些培養(yǎng)物分別收集并一起施加至相同的分級梯度中。
[0144]圖73示出低氧培養(yǎng)對B4中基因表達的影響。
[0145]圖74A-74K示出B2和B4亞組分的組成分析結果。使用定量實時PCR(qRTPCR)來評價B2和B4亞組分中腎細胞型特異基因的表達。(圖74A，圖74B)根據維生素D羥化酶(CYP2R1)和Cubilin的相對表達，亞組分B2相對于B4和所有其它亞組分富集近端腎小管細胞。(圖74C)與B4相比，亞組分B2中也富集遠端腎小管標記物上皮鈣黏著蛋白。(圖74E,圖74F)亞組分B4中富集腎小球標記物nephrin和podocin,還富集血管標記物kdr(圖74D)。(圖74G,圖74H)B4中還富集氧調節(jié)間質標記物Hif2 α和Epo0 (圖741)Β2和Β4的結果定量展示。(圖74J)通過對亞分級分離后培養(yǎng)的細胞進行免疫細胞化學分析來確定Β2近端(神經鈣黏著蛋白/綠色)和遠端(上皮鈣黏著蛋白/紅色)腎小管標記物的高效表達。(圖74Κ)相比之下，上皮鈣黏著蛋白-或神經鈣黏著蛋白陽性細胞很少存在于Β4培養(yǎng)物中。
[0146]圖75A-75C示出Β2和Β4亞組分的功能特征。(圖75Α)將Β2和Β4細胞進行繼代培養(yǎng)并評價cubilin表達及受體介導的白蛋白吸收。圖表示:1.用cubilin的同型匹配IgG對照抗體染色的B2細胞；i1.用競爭性抑制劑RAP預處理并用羅丹明綴合的人血清白蛋白(HSA-羅丹明)脈沖處理15分鐘(10 μ g/ml)的B2細胞；ii1.用HSA-羅丹明脈沖處理15分鐘(10 μ g/ml)(紅色)并用抗-cubilin抗體(綠色)標記的B2細胞；iv.(iii)的重疊圖像，其顯示出cubilin+細胞(綠色)與HSA-羅丹明(紅色)吸收的共定位；v.與(iii/iv)相同，但B4細胞顯示出極少的cubilin+細胞(綠色)并且?guī)缀鯚o白蛋白吸收(紅色)。在所有情況中，用煙酸己可堿(Hoechst)(藍色)對細胞核復染。(圖75B)檢驗各組分(B1-B4)中Epo的表達，其在大氣(21%)或低(2%)氧張力下(均在37°C下)暴露24小時后產生。在亞組分B4中，能夠響應氧張力的降低而上調Epo的Epo表達細胞的相對比例最大。注意B2和B4中Epo相對表達的一致性，結果在圖l(i)中示出。
[0147]圖76A-76C示出B2和B4的體內移植對尿毒癥/貧血大鼠的存活率、體重和心臟重量的影響。(圖76A)示出研究期間(腎切除后30周，治療后6個月)各對照組和治療組的存活率。在治療組中，僅B2治療的大鼠具有100%的存活率，等于健康對照組。(圖76B)按下式分別計算每只大鼠隨時間的體重變化百分比:((死亡時的重量)-(開始研究時的重量))/ (開始研究時的重量)。相比腎切除對照動物的5%體重損失，B2治療的動物的14.3%的體重增量視為極其顯著(P值〈0.0001)。B4 (P值=0.0239)和載體(P值=0.0125)也表現出顯著高于腎切除動物的重量增量。(圖76C)計算相對心臟重量占尸體剖檢時體重的百分比。未治療的腎切除大鼠在尸體剖檢時具有顯著增大的心臟(健康對照組的150%)。相比腎切除動物(P值〈0.0001),治療后六個月，B2僅表現出25%的相對心臟重量增量(圖3c)。與腎切除對照組相比，B4 (P值=0.0002)和載體(P值〈0.0001)也具有統(tǒng)計意義上的顯著性。
[0148]圖77A-77F示出對濾過性和紅細胞生成治療效果的時間和統(tǒng)計評價。采用得自SAS Institute Inc (Cary, NC)的7.0版JMP對來自10至20周數據的血清化學結果進行單因素方差分析(ANOVA)。(圖77A，77B, 77C)觀察到治療組中的紅細胞生成存在顯著差異(HCT，p=0.0005 ；RBC, p=0.0029)，其中與未治療的腎切除組、UNFX治療組和rEPO治療組相t匕，B2和B4治療的大鼠顯示最大的改善。(圖77D，77E, 77F)觀察到治療組中的濾過功能存在顯著差異(sCREAT，ρ〈0.0001 ；BUN, ρ〈0.0001)，其中Β2治療的效果最為顯著，其次為Β4。
[0149]圖78A-78C示出研究中期(12-14周)的臨床評價結果。在研究中期(12_14周)采集血液，以進行臨床化學分析，突出健康對照組和腎切除組之間或腎切除組相對于Β2、Β4或UNFX治療組差異的參數在圖(圖78A)中示出。兩種B2治療特有的顯著效果為(圖78B)增強的蛋白質保留性，正如B2組相對于腎切除組在血清白蛋白(sALB)和白蛋白/球蛋白(A/G)比率方面的增加(p〈0.001)所證實，和(圖78C)B2相對于腎切除組在血清甘油酸三酯和膽固醇方面的降低(p〈0.001)。
[0150]圖79A-79B顯示腎臟質量與腎功能相關。在尸體剖檢時采集(右)腎重量。(圖79A)B2治療的腎中的單側腎臟質量等于健康對照組。對在尸體剖檢時收集的血清中的sCREAT的檢驗顯示，腎臟質量和sCREAT之間存在明顯的相反關系(圖79A，副軸)。(圖79B)對所有所研究大鼠的腎臟質量和sCREAT的線性回歸分析確定了腎重量和腎功能存在顯著逆相關性(r2=0.38 巾值〈0.001)。
[0151]圖80示出用SRY探針進行基于PCR的DNA分析。
[0152]圖81A-81D示出對腎和骨髓的組織病理學分析。(圖81A)假手術對照組和殘腎(Masson Trichrome染色和PAS染色)的代表性光顯微圖。假手術組(對照組)的腎具有正常的實質結構，其通過界限清楚的皮質-髓質節(jié)和腎小管或腎小球無損傷來表征。腎切除未治療的動物表現出由中度至顯著的腎小管-間質纖維化和腎小球硬化組成的進行性腎小球腎小管變性(通過Masson Trichrome法染成藍色)、具有管腔管型的腎小管擴張(PAS嗜伊紅染色)和降低的骨髓細胞含量(骨髓細胞與紅細胞比率)。相比腎切除動物，B2治療的大鼠證明了治療效果，其通過腎小管-間質纖維化和腎小球硬化的減輕、近乎正常的骨髓細胞含量和等于健康對照組的骨髓細胞與紅細胞比率來表征。(圖81B)H&E染色的骨髓充分證明了未治療的腎切除大鼠中存在骨重吸收，顯著的破骨細胞并形成骨質糜爛的陷窩。類似于健康對照組，B2治療的大鼠的骨內膜表面平滑，無破骨細胞、陷窩或骨質糜爛的跡象。(圖81C和81D)終末血清磷(mg/dl)和鈣(mg/dl，更正蛋白總量[Ca]-0.4[TP]+3.3)為模型中骨重吸收的組織 學觀察和經B2治療的重吸收改善提供了全身支持。
[0153]圖82A示出治療后12周的存活率。
[0154]圖82B示出治療25周后的存活率。
[0155]圖83A示出初始重量至死亡期間的總體重。
[0156]圖83B示出在用遞送體系中的細胞群治療的嚙齒動物中，初始重量至死亡期間的
重量變化百分比。
[0157]圖84示出所有治療組在12周期間的血清肌酸酐水平。
[0158]圖85示出B2和B4治療組以及腎切除組、健康對照組和假手術腎切除組在12周期間的血清肌酸酐水平。
[0159]圖86示出在所有時間點對血清肌酸酐進行的單因素ANOVA分析。
[0160]圖87示出血液尿素氮(BUN)水平。
[0161]圖88示出所有治療組在12周間的HCT百分比。
[0162]圖89示出B2和B4治療組以及腎切除組、健康對照組和假手術腎切除組在12周期間的HCT百分比。
[0163]圖90示出在所有時間點對HCT百分比進行的單因素ANOVA分析。
[0164]圖91示出心臟重量占總體重的百分比。
[0165]圖92示出研究終點時的總血清蛋白水平。
[0166]圖93示出3個月時間點的組織學評價。[0167]圖94示出治療后12周的存活率數據。
[0168]圖95示出治療前至治療后12周間的重量變化百分比。
[0169]圖96示出12周時的血清肌酸酐水平。
[0170]圖97示出12周時的血清BUN水平。
[0171]圖98示出相對于健康對照組表達的尿蛋白水平。
[0172]圖99示出治療后六周時的血清A/G比率。
[0173]圖100示出12周時的HCT百分比。[0174]圖101示出12周時的RBC個數。
[0175]圖102示出治療后6周和12周時的平均全身血壓。
[0176]圖103示出3-5個月時間點時的組織學評價。
[0177]圖104示出工作原型對血清肌酸酐水平的影響。
[0178]圖105示出非工作原型對血清肌酸酐水平的影響。
[0179]圖106示出B3和B2/B4對血清肌酸酐水平的影響。
[0180]圖107示出B2、B2/B4和B2/B3對尿蛋白水平的影響。
[0181]圖108示出B2/B4、B2/B3和B3/B4對血壓的影響。
[0182]圖109示出研究初期末期肌酸酐水平之間的差值。
[0183]圖110示出研究初期與末期BUN水平之間的差值。
[0184]圖111示出研究初期與末期ALB水平之間的差值。
[0185]圖112示出研究初期與末期TPRO水平之間的差值。
[0186]圖113示出研究初期PHOS水平與研究末期PHOS水平之間的差值。
[0187]圖114示出研究初期末期更正總蛋白修的鈣之間的差值。
[0188]圖115示出犬科動物腎細胞生長。
[0189]圖116示出豬腎細胞生長。
[0190]圖117示出人腎細胞生長。
[0191]圖118示出人活組織檢查的細胞擴增結果。
[0192]圖119示出細胞的免疫細胞化學結果。
[0193]圖120A-120F示出流式細胞術的結果，證明大鼠培養(yǎng)物中所含的EPO表達細胞與近端和遠端腎小管細胞(圖120A、圖120B)截然不同。經由熒光綴合的白蛋白的吸收評估培養(yǎng)物中cubilin陽性近端腎小管細胞的功能性，吸收的特異性通過添加競爭性抑制劑RAP來確定(圖120C-120F)。
[0194]圖121A-121C示出每個月對對濾過功能的監(jiān)測((圖121A)示出sCREAT ;(圖121B)示出HCT ;(圖121C)示出比較臨床化學結果)。
[0195]圖122A-122D示出用于鑒定腎和骨髓中組織水平影響的組織學分析。
[0196]圖123示出來自豬和人的CKD樣本的組織病理學特征和非CKD腎樣本的組織學特征組織比較。
[0197]圖124A-124D示出源自CKD-和非CKD培養(yǎng)物之間的擴增能力(圖124A);通過觀察一部分cubilin陽性細胞中受體介導的白蛋白吸收來確定建系培養(yǎng)物中的腎小管細胞功能(圖 124B-124D)。
[0198]圖125A-125C示出CKD組織樣本(相對于非CKD組織樣本)中的EPO mRNA表達(圖125A);這些樣本的等電聚焦和蛋白質印跡分析確定了將基因表達模式一般在蛋白質水平上重復(圖125B)；由CKD和非CKD腎樣本構建的EPO表達細胞培養(yǎng)物響應低氧刺激，同時在刺激的24小時內對EPO基因轉錄進行可變上調(圖125C)。
[0199]圖126示出成年嚙齒動物分級梯度的細胞帶。
[0200]圖127示出促紅細胞生成素、nephrin、podocin、cubilin和Cyp在成年卩齒齒動物細胞制劑中的基因表達模式。
[0201]圖128示出自患病成年嚙齒動物腎臟分離的細胞制劑(5X)。
[0202]圖129示出分離自患末期腎衰竭的成年大鼠的細胞中B4特異基因的表達。
[0203]圖130示出幼年和成年B2細胞制劑中肌酸酐值的直接比較。
[0204]圖131示出幼年和成年B2細胞制劑中血清BUN值的直接比較。
[0205]圖132示出B2和B4細胞制劑中Has_2的表達。
[0206]圖133示出HAS mRNA (qRTPCR，下圖)和蛋白質(上圖，蛋白質印記)的體內表達。
[0207]發(fā)明詳述
[0208]本發(fā)明涉及分離的腎細胞(包括腎小管細胞群和生成促紅細胞生成素(EPO)的腎細胞群)，及其分離和培養(yǎng)方法，以及用生物活性腎細胞(包括富集的腎小管和EPO生成細胞群)治療有需要的受試者的方法。
[0209]定義
[0210]除非另有定義，本文所用技術和科學術語的與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常的理解具有相同的含義。由R Lanza、R Langer和J Vacanti編著的Principles of TissueEngineering第三版(2007)為本領域技術人員提供了本申請中所用許多術語的一般性指導。本領域的技術人員將認識到許多方法和材料與本文所述的方法和材料類似或等同，這些方法和材料可用于本發(fā)明的實施。實際上，本發(fā)明決不限于所述方法和材料。
[0211 ] 如本文所用，術語“細胞群”是指通過從合適的組織源(通常從哺乳動物)直接分離得到的細胞數量。可隨后對分離的細胞群進行體外培養(yǎng)。本領域的普通技術人員將意識到用于分離和培養(yǎng)與本發(fā)明一起使用的細胞群的各種方法以及適用于本發(fā)明的細胞群中的各種數量的細胞。細胞群可為源自腎的未分化、異質性細胞群。例如，異質性細胞群可從腎活檢組織或全腎組織中分離。作為另外的選擇，異質性細胞群可源自哺乳動物細胞的體外培養(yǎng)物，這些培養(yǎng)物由腎活檢組織或全腎組織構建。也可將未分化的異質性細胞群稱為非富集細胞群。
[0212]如本文所用，術語“混合物”是指兩個或更多個分離的富集細胞群的組合，這些分離的富集細胞群源自未分化的異質性細胞群。根據某些實施方案，本發(fā)明的細胞群為腎細胞群。
[0213]“富集”細胞群或制劑是指源自原始腎細胞群(例如，未分化的異質性細胞群)的細胞群，其相比原始細胞群包含較大比例的特定細胞類型。例如，原始腎細胞群可富集第一、第二、第三、第四、第五等目標細胞群。如本文所用，術語“細胞群”、“細胞制劑”和“細胞原型”可互換使用。
[0214]在一個方面，如本文所用，術語“富集”細胞群是指源自原始腎細胞群(例如，腎活檢或培養(yǎng)的哺乳動物腎細胞的細胞懸液)的細胞群，其相比原始細胞群包含較大比例的能夠生成EPO的細胞。例如，術語“B4”為源自原始腎細胞群的細胞群，其相比原始細胞群包含較大比例的EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。本發(fā)明的細胞群可富集一種或多種細胞類型而缺乏一種或多種其它細胞類型。例如，相對于非富集細胞群(即富集細胞群源于此的原始細胞群)中的間質成纖維細胞和腎小管細胞而言，富集的EPO生成細胞群可富集間質成纖維細胞而缺乏腎小管細胞和集合管上皮細胞。在提及EPO-富集或“B4”細胞群的所有實施方案中，富集細胞群為異質性細胞群，其包含可以氧調節(jié)的方式生成EPO的細胞，正如內源EPO基因的氧可調EPO表達所證實。
[0215]在另一個方面，富集細胞群也可指上述源自原始腎細胞群的細胞群，其相比原始細胞群包含較大比例的表達一種或多種腎小管細胞標記物的細胞。例如，術語“B2”是指源自原始腎細胞群的細胞群，其相比原始細胞群包含較大比例的腎小管細胞。此外，富集表達一種或多種腎小管細胞標記物的細胞的細胞群(或“B2”)可包含一些來自集合管系統(tǒng)的上皮細胞細胞。盡管富集表達一種或多種腎小管細胞標記物的細胞的細胞群(或“B2”)相對缺乏EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞，但與原始細胞群相比，富集群可包含較小比例的這些細胞(ΕΡ0生成細胞、腎小球細胞和血管細胞)。通常，異質性細胞群缺乏一種或多種細胞類型，使得相對于缺乏前異質性細胞群中所含一種或多種細胞類型的比例而言，缺乏的細胞群含有較小比例的一種或多種細胞類型。可能缺乏的細胞類型為任何類型的腎細胞。例如，在某些實施方案中，可能缺乏的細胞類型包括集合管和腎小管系統(tǒng)的大顆粒細胞，其密度小于約1.045g/mL，稱為“BI”。在某些其它實施方案中，可能缺乏的細胞類型包括低顆粒度和低成活力的細胞碎片和小細胞，其密度大于約1.095g/mLj#S“B5”。在一些實施方案中，富集腎小管細胞的細胞群相對缺乏下列所有細胞氧可調EPO表達細胞、腎小球細胞和血管細胞。
[0216]如本文所用，術語“低氧”培養(yǎng)條件是指相對于將細胞在大氣氧含量(約21%)下培養(yǎng)的標準培養(yǎng)條件而言，在培養(yǎng)體系中使細胞經受可用氧含量降低的培養(yǎng)條件。本文將非低氧條件稱為正常或常 氧培養(yǎng)條件。
[0217]如本文所用，術語“氧可調”是指細胞根據其中可用氧量調節(jié)(上調或下調)基因表達的能力。“低氧誘導”是指響應氧張力的降低而上調基因表達(無論是先期誘導還是初始氧張力)。
[0218]如本文所用，術語“生物材料”是指適于導入活組織的天然或合成的生物相容性材料。天然生物材料是由生命體系產生的材料。合成生物材料不是由生命體系產生的材料。本文所公開的生物材料可為天然和合成的生物相容性材料的組合。如本文所用，生物材料包括例如聚合物基質和支架。本領域的普通技術人員將意識到，一種或多種生物材料可被構建為多種形式(例如，構建為液體水凝膠懸浮液、多孔泡沫)，并且可包括一種或多種天然或合成的生物相容性材料。
[0219]如本文所用，術語“貧血”是指紅細胞數量和/或血紅蛋白水平不足，這是由受試者的EPO生成細胞生成的功能性EPO蛋白不足、和/或釋放于體循環(huán)內的EPO蛋白不足、和/或骨髓中的成紅血細胞無法響應EPO蛋白所導致。患有貧血的受試者不能維持紅細胞穩(wěn)態(tài)。通常，貧血可能伴隨腎功能衰退或喪失(例如，慢性腎衰竭)，還包括與相對EPO缺乏相關的貧血、與充血性心力衰竭相關的貧血、與骨髓抑制性療法如化學療法或抗病毒療法(如AZT)相關的貧血、與非骨髓癌相關的貧血、與病毒感染(如HIV)相關的貧血以及與慢性疾病如自身免疫疾病(例如，類風濕性關節(jié)炎)、肝病和多器官系統(tǒng)衰竭相關的貧血。[0220]術語“ΕΡ0缺乏”是指可用促紅細胞生成素受體激動劑(例如，重組EPO或EPO類似物)治療的任何病癥或疾病，包括貧血。
[0221]如本文所用，術語“腎病”是指與任何階段或程度的急性或慢性腎衰竭疾病相關的疾病，所述腎衰竭導致腎喪失執(zhí)行血液濾過功能和從血液中排除多余的體液、電解質和廢物的功能的能力。腎病還包括內分泌功能障礙，諸如貧血(促紅細胞生成素缺乏)和礦物質不平衡(維生素D缺乏)。腎病可發(fā)生于腎臟中或可繼發(fā)于多種病癥，包括(但不限于)心力衰竭、高血壓、糖尿病、自身免疫疾病或肝病。
[0222]術語“治療”是指治針對腎病、貧血、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎小球濾過缺陷的治療劑治療和預防性或防治性措施，其中目的是逆轉、預防或延緩(減輕)目標疾病。需要治療的患者包括已患和易患或需預防腎病、貧血、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎小球濾過缺陷的患者。術語如本文所用，“治療”包括穩(wěn)定和/或改善腎功能。 [0223]術語“構建體”是指沉積在支架或基質表面上或表面中的一個或多個細胞群，該支架或基質由一種或多種合成或天然存在的生物相容性材料制成。所述一個或多個細胞群可用生物材料包覆、沉積在其上、包埋于其中、附著到其上或截留于其中，該生物材料由一種一種或多種合成或天然存在的生物相容性聚合物、蛋白質或肽制成。所述一個或多個細胞群可與生物材料或支架或基質在體外或體內結合。通常，選擇用于形成支架/生物材料的一種或多種生物相容性材料，以引導、促進或允許形成至少一個細胞群沉積在其上的多室三維結構。也可選擇用于形成構建體的一種或多種生物材料，以引導、促進或允許構建體或構建體細胞組分的分散和/或其與內源性宿主組織的整合，或引導、促進或允許構建體或構建體細胞組分的存活、移植、耐受或功能性。
[0224]術語“受試者”應指任何單一的人受試者,包括需要治療的患者,其正在患有或已患有腎病、貧血或EPO缺乏的一種或多種病征、癥狀或其它指征。此類受試者包括但不限于新近確診的或以前已確診且正在經歷復發(fā)或再發(fā)，或具有患腎病、貧血或EPO缺乏風險的受試者(無論何種原因)。此前已針對受試者腎病、貧血或EPO缺乏對受試者進行了治療或未如此進行治療。
[0225]術語“患者”是指需要治療的單個動物，更優(yōu)選哺乳動物(包括非人動物，例如犬、貓、馬、兔、動物園動物、牛、豬、綿羊和非人靈長類)。最優(yōu)選的是，本文中的患者為人。
[0226]術語“樣本”或“患者樣本”或“生物樣本”通常應指從受試者或患者、體液、身體組織、細胞系、組織培養(yǎng)物或其它來源獲得的任何生物樣本。該術語包括組織活檢樣本，諸如腎活檢樣本。該術語包括培養(yǎng)的細胞，諸如培養(yǎng)的哺乳動物腎細胞。從哺乳動物獲取組織活檢及培養(yǎng)細胞的方法是本領域所熟知的。如果術語“樣本”單獨使用，則其仍應意味著該“樣本”是“生物樣本”或“患者樣本”，即，這些術語可互換使用。
[0227]術語“試樣”是指得自經本發(fā)明方法治療的受試者的樣本。試樣可源于哺乳動物受試者的各種來源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘液、組織等。
[0228]術語“對照物”或“對照樣本”是指陰性或陽性對照物，其中預期陰性或陽性結果有助于使試樣的結果相關聯(lián)。適于本發(fā)明的對照物包括但不限于已知表現出正常紅細胞穩(wěn)態(tài)指征的樣本、已知表現出貧血指征的樣本、得自已知未貧血受試者的樣本和得自已知貧血受試者的樣本。適用于本發(fā)明方法的其它對照物包括但不限于源自經已知可調節(jié)紅細胞生成的藥理學藥劑(如重組EPO或EPO類似物)治療的受試者的樣本。此外，對照物可為得自經本發(fā)明方法治療之前的受試者的樣本。另外的合適對照物可為得自已知患有任何類型或階段腎病的受試者的試樣，和得自已知未患有任何類型或階段腎病的受試者的樣本。對照物可為正常健康的對比對照物。本領域的技術人員將意識到適用于本發(fā)明的其它對照物。
[0229]細胞群
[0230]本發(fā)明提供了用于治療腎病，即，使腎功能穩(wěn)定和/或改善和/或再生的分離的異質性腎細胞群及其混合物，所述腎細胞群和混合物富集特定的生物活性組分或細胞類型和/或缺乏特定的無活性或不需要的組分或細胞類型。
[0231]生物活性細胞群
[0232]在一個方面，本發(fā)明基于意外的發(fā)現，即，富集生物活性組分而缺乏無活性或不需要的組分的異質性腎細胞群的某些亞組分提供了優(yōu)于原始細胞群的治療和再生效果。例如，本發(fā)明的缺乏無活性或不需要的組分的生物活性組分(例如B2、B4和B3)，例如BI和B5，可單獨或在混合時使腎功能得到意想不到的穩(wěn)定和/或改善和/或再生。在一個優(yōu)選的實施方案中，生物活性細胞群為B2。在某些實施方案中，將B2細胞群與B4混合。在其它實施方案中，將B2細胞群與B3混合。
[0233]B2細胞群通過選自下列一種或多種的腎小管細胞標記物的表達來表征:巨蛋白(megalin)、cubilin、透明質酸合酶2 (HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、神經鈣黏著蛋白(Ncad)、上皮鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Acipl)、水通道蛋白-2 (Acip2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rabl7)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4(Fxyd4)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3(Aldhla3)和鈣蛋白酶_8 (Capn8)以及集合管標記物水通道蛋白_4(Aqp4)，其中B2細胞群比B3和/或B4具有更大和更多的顆粒細胞，因此其浮力密度介于約1.045g/mL和約1.063g/mL之間(嚙齒動物)、介于約1.045g/mL和1.052g/mL之間(人)和介于約1.045g/mL和約1.058g/mL之間(犬科動物)。
[0234]B3細胞群通過用EPO生成細胞表達血管、腎小球和近端腎小管標記物來表征，與B2和B4相比，所述B3細胞群具有中等大小和中等粒度，因此其浮力密度介于約1.063g/mL和約1.073g/mL之間(嚙齒動物)、介于約1.052g/mL和約1.063g/mL之間(人)和介于約
1.058g/mL和約1.063g/mL之間(犬科動物)。B3可通過選自下列一種或多種的標記物的表達來表征:水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子2 (Fxyd2)、溶質載體家族17 (磷酸鈉)成員3(Slcl7a3)、溶質載體家族3成員I (Slc3al)、緊密連接蛋白2(Cldn2)、napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶質載體家族2 (易化萄糖轉運蛋白)成員2 (Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27 (Tmem27)、酰基輔酶合成酶介質鏈家族成員2 (Acsm2)、谷胱甘肽過氧化物酶3 (Gpx3)、果糖-1，6- 二磷酸酶I (Fbpl)和丙氨酸乙醛酸氨基轉移酶2 (Agxt2)。B3還通過血管表達標記物血小板內皮細胞粘附分子(Pecam)和腎小球表達標記物podocin (Podn)來表征。
[0235] B4細胞群通過選自下列一種或多種的血管標記物的表達來表征:PECAM、VEGF,KDR> HIFla ;包含下列一種或多種的腎小球標記物組:Podocin (Podn)和Nephrin(Neph)；和相對于未分化(UNFX)B2和B3的氧可調EPO富集群。B4還通過選自下列一種或多種的標記物的表達來表征::趨化因子(C-X-C基序)受體4 (Cxcr4)、內皮素B型受體(Ednrb)、V型膠原a2(Col5a2)、鈣黏著蛋白5 (Cdh5)、組織纖溶酶原激活物(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受體(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘連蛋白)(Sparc)、絲甘蛋白(Srgn)、TIMP金屬肽酶抑制因子3 (Timp3)、維耳姆斯瘤l(Wtl)、無翅型MMTV整合位點家族成員4(Wnt4)、G蛋白信號轉導調節(jié)子4(Rgs4)、血小板-內皮細胞粘附分子(Pecam)和促紅細胞生成素(Epo)。B4還通過比B2或B3更少、更小的顆粒細胞來表征，其浮力密度介于約1.073g/mL和約1.091 g/ml之間(嚙齒動物)、介于約1.063g/mL和約1.091g/mL之間(人和犬科動物)。
[0236]B2和B4生成的透明質酸
[0237]透明質素(hyaluronan)(也稱為透明質酸或透明質酸鹽)為糖胺聚糖(GAG)，其由非硫酸化二糖單元(具體為N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸)的規(guī)則重復序列組成。其分子量的范圍可為400道爾頓(二糖)至一百萬道爾頓以上。經發(fā)現，透明質酸以各種量存在于所有組織(諸如皮膚組織、軟骨組織和眼組織)中，并存在于成年動物的大部分(如果不是所有)體液中。其尤其富含于早期胚胎中。由透明質素(實際上通常為GAG)形成的空間使其可在細胞遷移、細胞附著、傷口修復期間、器官形成、免疫細胞粘附、細胞內信號轉導的激活以及腫瘤轉移方面發(fā)揮作用。這些作用由結合至透明質素的特異蛋白和蛋白聚糖介導。細胞運動和免疫細胞粘附由細胞表面受體RHAMM介導(Receptor for Hyaluronan-MediatedMotility ;Hardwick 等，1992)和 CD44 (Jalkenan 等，1987 ;Miyake 等，1990)。透明質素直接在細胞表面的內膜處合成，在其合成過程中，生長的聚合物從膜中伸至細胞外部。合成由單一蛋白酶、透明質素合酶(HAS)介導，其中透明質素合酶的基因家族由至少3個成員組成。[0238]近來已證實透明質酸可與⑶44相互作用，并且此類相互作用(除了其它作用外)可為損傷腎組織補充非居留細胞(諸如間充質干細胞(MSC))并增強腎臟再生性(KidneyInternational(2007)72, 430-441)。
[0239]意外地的是，已發(fā)現B2和B4細胞制劑均能夠通過透明質酸合酶_2 (HAS-2)-更特異地富集在B2細胞群中的標記物的作用在體外和體內表達較高分子量類型的透明質酸
(HA)。經證實，在5/6Nx模型中用B2進行治療可減輕纖維化，同時增強HAS-2的體內表達，并預期可在治療過的組織內產生高分子量HA。值得注意的是，未經治療的5/6Nx模型產生纖維化，同時檢測到有限的HAS-2且產生極少的高分子量HA。不希望受理論束縛，假定主要由B2 (在一定程度上由B4)產生的這種高分子量類型的抗炎HA與細胞制劑協(xié)同作用，以減輕腎臟纖維化并輔助腎臟再生。因此，本發(fā)明包括在包含透明質酸的生物材料中遞送本發(fā)明的細胞原型。本發(fā)明還構思了通過直接生成或經植入細胞刺激生成來提供再生刺激的生物材料組分。
[0240]在一個方面，本發(fā)明提供了分離的異質性EPO生成腎細胞群，其用于治療有需要的受試者的腎病、貧血和/或EPO缺乏。在一個實施方案中，細胞群源自腎活檢。在另一個實施方案中，細胞群源自全腎組織。在另一個實施方案中，細胞群源自哺乳動物細胞的體外培養(yǎng)物，這些培養(yǎng)物由腎活檢組織或全腎組織構建。在所有實施方案中，這些細胞群為未分化的細胞群，在本文中也稱為非富集細胞群。
[0241]在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的促紅細胞生成素(EPO)生成腎細胞群，其進一步富集，使得富集亞群相對于原始或初始細胞群而言包含較大比例的EPO生成細胞。在一個實施方案中，相對于未富集的初始細胞群而言，富集的EPO生成細胞組分包含較大比例的間質成纖維細胞和較小比例的腎小管細胞。在某些實施方案中，相對于未富集的初始細胞群而言，富集的EPO生成細胞組分包含較大比例的腎小球細胞和血管細胞以及較小比例的集合管細胞。在此類實施方案中，這些細胞群在本文中稱為“B4”細胞群。
[0242]在另一個方面，本發(fā)明提供了與一種或多種附加腎細胞群混合的EPO生成腎細胞群。在一個實施方案中，EPO生成細胞群為富集EPO生成細胞的第一細胞群，例如，B4。在另一個實施方案中，EPO生成細胞群為未富集EPO生成細胞的第一細胞群，例如，B2。在另一個實施方案中，第一細胞群與第二腎細胞群混合。在一些實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞，這可通過腎小管細胞表型的存在來證實。在另一個實施方案中，腎小管細胞表型可通過一種腎小管細胞標記物的存在來指示。在另一個實施方案中，腎小管細胞表型可通過一種或多種腎小管細胞標記物的存在來指示。腎小管細胞標記物包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明質酸合酶2 (HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、神經鈣黏著蛋白(Ncad)、上皮鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2 (Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rabl7)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4 (FxycM)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員4 (Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3(Aldhla3)和鈣蛋白酶_8 (Capn8)。在另一個實施方案中，第一細胞群與若干種腎細胞中的至少一種混合，所述腎細胞包括但不限于源自間質的細胞、腎小管細胞、源自集合管的細胞、源自腎小球的細胞和/或源自血液或脈管系統(tǒng)的細胞。
[0243]在一個方面，本發(fā)明的EPO生成腎細胞群通過EPO表達和對氧的生物應答來表征，使得培養(yǎng)體系中氧張力的降低而誘導EPO的表達。在一個實施方案中，EPO生成細胞群富集EPO生成細胞。在一個實施方案中，相對于在正常大氣(~21%)含量的可用氧下培養(yǎng)的細胞群而言，當細胞群在培養(yǎng)體系中使細胞經受可用氧含量降低的條件下進行培養(yǎng)時，EPO表達得以誘導。在一個實施方案中，低氧條件下培養(yǎng)的EPO生成細胞的EPO表達水平比常氧條件培養(yǎng)的EPO生 成細胞相對更高。通常，相比將細胞在正常大氣含量的可用氧(也稱為正常或常氧培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)時，將細胞在低含量的可用氧(也稱為低氧培養(yǎng)條件)下進行培養(yǎng)意味著低氧含量相對降低。在一個實施方案中，低氧細胞培養(yǎng)條件包括在約小于1%的氧、約小于2%的氧、約小于3%的氧、約小于4%的氧或約小于5%的氧下培養(yǎng)細胞。在另一個實施方案中，正常或常氧培養(yǎng)條件包括在約10%的氧、約12%的氧、約13%的氧、約14%的氧、約15%的氧、約16%的氧、約17%的氧、約18%的氧、約19%的氧、約20%的氧或約21%的氧下培養(yǎng)細胞。
[0244]在另一個實施方案中，通過將細胞在約小于5%的可用氧下培養(yǎng)，并且將EPO表達水平與在大氣(約21%)氧下培養(yǎng)的細胞進行比較時，可獲得EPO表達的誘導或增加。在另一個實施方案中，通過下述方法在能夠表達EPO的細胞培養(yǎng)物中獲得EPO的誘導，所述方法包括第一培養(yǎng)階段，其中細胞培養(yǎng)物在大氣氧(約21%)下培養(yǎng)一段時間；和第二培養(yǎng)階段，其中可用氧含量降低并且在約小于5%的可用氧下培養(yǎng)相同的細胞。在另一個實施方案中，響應低氧條件的EPO表達通過HIFl α調節(jié)。本領域的普通技術人員將意識到，本領域中已知的其它氧操縱培養(yǎng)條件也可用于本文所述的細胞。
[0245]在一個方面，EPO生成哺乳動物細胞的富集群通過對灌流條件的生物應答(例如EPO表達)來表征。在一個實施方案中，灌流條件包括短暫、間歇或連續(xù)的流體流(灌流)。在一個實施方案中，當以使得動力經由流動傳遞至細胞的方式對培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基進行間歇或連續(xù)的循環(huán)或攪拌時，可機械誘導EPO表達。在一個實施方案中，將經受短暫、間歇或連續(xù)流體流的細胞以使其在材料中或之上呈三維結構的方式進行培養(yǎng)，所述材料提供用于形成此類三維結構的骨架和/或空間。在一個實施方案中，將細胞在多孔珠上培養(yǎng)，并借助于平臺搖晃式搖床、軌道式平臺或旋轉瓶使其經受間歇或連續(xù)流體流。在另一個實施方案中，將細胞在三維支架上培養(yǎng)并置于裝置中，通過所述裝置使支架固定并且使流體定向地流經或穿過支架。本領域的普通技術人員將意識到，本領域中已知的其它灌流培養(yǎng)條件也可用于本文所述的細胞。
[0246]無活性細胞群
[0247]如本文所描述，本發(fā)明部分基于意外的發(fā)現，即，富集生物活性組分而缺乏無活性或不需要的組分的異質性腎細胞群的某些亞組分提供了優(yōu)于原始細胞群的治療和再生效果。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞群缺乏BI和/或B5細胞群。
[0248]BI細胞群包含集合管和腎小管系統(tǒng)的大顆粒細胞，其中細胞群中細胞的浮力密度小于約1.045g/m。B5細胞群由低顆粒度和低成活力的細胞碎片和小細胞構成，其浮力密度大于約 1.091g/mL。
[0249]分離和培養(yǎng)細胞群的方法
[0250]在一個方面，本發(fā)明提供了用于離析和分離腎細胞組分(例如，富集細胞群)的方法，所述腎細胞組分用于治療用途，包括治療腎病、貧血、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷和腎小球濾過缺陷。在一個實施方案中，將細胞群與新鮮消化的(即，機械或酶消化的)腎組織分離或與哺乳動物腎細胞 的異質性體外培養(yǎng)物分離。
[0251]意外地發(fā)現，將腎細胞的異質性混合物在密度梯度上分離之前在低氧培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)可使得B4和B2組分中的細胞分布和組成得以改善。在從患病或非患病腎分離的腎細胞中，觀察到氧依賴性細胞從B2至B4的富集。不希望受理論束縛，這可歸因于下列現象中的一種或多種:1)特定細胞組分在低氧培養(yǎng)期間的選擇性存活、死亡或增殖；2)細胞顆粒度和/或大小為響應低氧培養(yǎng)而變化，從而導致密度梯度分離過程中浮力密度和隨后的定位發(fā)生變化；和3)細胞基因/蛋白質表達響應低氧培養(yǎng)期而變化，從而導致任何給定的梯度組分中的細胞存在差異特征。因此，在一個實施方案中，富集腎小管細胞的細胞群(例如，B2)具有抗低氧性。
[0252]用于離析和分離本發(fā)明細胞群的示例性技術包括基于目標群中所含不同細胞類型的比重差而進行的密度梯度分離。任何給定細胞類型的比重可受細胞內的顆粒度、細胞內水的體積和其它因素影響。在一個方面，本發(fā)明提供給了用于分離本發(fā)明細胞制劑(如，B2和B4)的最佳梯度條件，這些細胞制劑遍及多個物種，包括但不限于人、犬科動物和嚙齒動物。在一個優(yōu)選的實施方案中，密度梯度用于獲得腎小管細胞組分的新富集群，即，B2細胞群，其源自異質性腎細胞群。在一個實施方案中，密度梯度用于獲得EPO生成細胞組分的新富集群，即，B4細胞群，其源自異質性腎細胞群。在其它實施方案中，密度梯度用于獲得腎小管細胞、腎小球細胞和腎內皮細胞的富集亞群。在一個實施方案中，將EPO生成細胞和腎小管細胞與紅細胞和細胞碎片分離。在一個實施方案中，將EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞與其它細胞類型分離，并且與紅細胞和細胞碎片分離，而將腎小管細胞和集合管細胞亞群同時與其它細胞類型分離，并且與紅細胞和細胞碎片分離。
[0253]基于下述某些關鍵特征，本發(fā)明通過部分采用包含60%非離子碘化化合物碘克沙醇水溶液的OPTIPREP? (Axis-Shield)密度梯度介質來產生新細胞群。然而，本領域的技術人員將認識到，包括用于分離本發(fā)明細胞群的必要特征的任何密度梯度或本領域中已知的其它方式(例如使用細胞表面標記物的免疫分離)均可根據本發(fā)明進行使用。本領域的技術人員也將認識到，可利用有助于經由密度梯度分離細胞亞群的相同細胞特征(大小和顆粒度)來通過流式細胞術分離細胞亞群(前向散射=流式細胞術對大小的反映，并且側向散射=對顆粒度的反映)。重要的是，密度梯度介質應對特定的目標細胞具有低毒性。雖然密度梯度介質應對特定的目標細胞具有低毒性，但本發(fā)明也構思了使用在目標細胞選擇過程中發(fā)揮作用的梯度介質。不希望受理論束縛，通過包含碘克沙醇的梯度回收的本發(fā)明細胞群似乎具有碘克沙醇耐受性，因為在加載和回收步驟之間存在相當的細胞損失，這表明在梯度條件下暴露于碘克沙醇會導致某些細胞的消除。經碘克沙醇梯度后出現在特定條帶中的細胞對碘克沙醇和/或密度梯度暴露的不利影響具有耐受性。因此，本發(fā)明還構思了在本發(fā)明細胞群的分離和/或選擇中使用對中度腎毒素溫和的附加對比介質。此外，密度梯度介質也不應與人血漿中的蛋白質結合或不利地影響目標細胞的關鍵功能。
[0254]在另一個方面，本發(fā)明提供了對腎細胞群進行三維培養(yǎng)的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了經由連續(xù)灌流培養(yǎng)細胞群的方法。在一個實施方案中，相比靜態(tài)培養(yǎng)的細胞群而言，經由三維培養(yǎng)和連續(xù)灌流培養(yǎng)的細胞群顯示出較高的細胞含量和互聯(lián)性。在另一個實施方案中，經由三維培養(yǎng)和連續(xù)灌流培養(yǎng)的細胞群相比此類此類細胞群的靜態(tài)培養(yǎng)物而言，顯示出較多的EPO表達以及增強的腎小管相關基因(如上皮鈣黏著蛋白)表達。
[0255]在另一個實施方案中，相比靜態(tài)培養(yǎng)的細胞群而言，經由連續(xù)灌流培養(yǎng)的細胞群顯示出較高的葡萄糖水平和谷氨酰胺消耗。
[0256]本領域的普通技術人員將意識到，本領域中已知的其它分離和培養(yǎng)方法也可用于本文所述的細胞。 [0257]生物材料(聚合物基質或支架)
[0258]如已公布的Bertram等的美國專利申請20070276507 (其全文以引用方式并入本文)所述，可將聚合物基質或支架成形為任意數量的所需構型，以滿足任意數量的整個系統(tǒng)、幾何形狀或空間限制。在一個實施方案中，本發(fā)明的基質或支架可為三維的，并且可成形為符合器官或組織結構的尺寸和形狀。例如，在使用聚合物支架治療腎病、貧血、EPO缺乏、腎小管轉運缺陷或腎小球濾過缺陷的過程中，可使用三維(3-D)基質。可使用多種不同形狀的3-D支架。當然，聚合物基質可成形為不同的尺寸和形狀，以符合不同體型的患者。聚合物基質也可以其它方式成形以滿足患者的特殊要求。在另一個實施方案中，聚合物基質或支架可為生物相容性的多孔聚合物支架。支架可由多種合成的或天然存在的材料形成，這些材料包括但不限于開孔聚乳酸(OPLAf K纖維素醚、纖維素、纖維素酯、氟化聚乙烯、酚醛、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亞胺、聚丙烯酸酯、聚苯并惡唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚亞胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烴、聚酰亞胺、聚烯烴、聚惡二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、多硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纖維素、硅酮、尿素甲醛、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、絲蛋白、彈性蛋白、藻酸鹽、透明質酸、瓊脂糖或它們的共聚物或物理共混物。支架構型的范圍可為液體水凝膠懸浮液到柔性多孔支架至剛性保形多孔支架。[0259]水凝膠可由多種聚合物材料形成并可用于多種生物醫(yī)學應用中。水凝膠可在外形上描述為親水性聚合物的三維網絡。根據水凝膠的類型，其含有多種百分比的水，但整體不溶于水。雖然其具有高含水量，但由于存在親水殘基，水凝膠能夠另外結合大量液體。水凝膠大范圍溶脹而未改變其凝膠狀結構。可根據所用聚合物的性質和附加的產品專用設備對水凝膠的基本物理特征進行具體的改進。
[0260]優(yōu)選地，水凝膠可由聚合物、生物衍生材料、合成衍生材料或其組合制成，其具有生物惰性并與哺乳動物組織在生理上相容。水凝膠材料優(yōu)選地不包括炎癥應答。可用于形成水凝膠的其它材料的實例包括:(a)改性的藻酸鹽；(b)多糖(例如，結冷膠和角叉菜膠)，其通過接觸一價陽離子而膠凝；(c)多糖(例如透明質酸)，其為極粘滯的液體或通過結構的緩慢演變而隨時間觸變并形成凝膠；和(d)聚合物水凝膠前體(例如，聚氧乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白質)。美國專利N0.6，224，893B1對適于制備根據本發(fā)明的水凝膠的各種聚合物以及此類聚合物的性質做了詳細的描述。
[0261]支架或生物材料特性能夠使細胞附著到支架或生物材料上并與其相互作用，和/或可提供截留細胞的多孔空間。在一個實施方案中，本發(fā)明的多孔支架或生物材料允許將一種或多種細胞群或細胞混合物添加或沉積到被構建為多孔支架的生物材料上(例如，通過附著細胞)和/或支架孔內(例如，通過截留細胞)。在另一個實施方案中，支架或生物材料允許或促進支架內細胞:細胞和/或細胞:生物材料的相互作用，以形成本文所述的構建體。
[0262]在一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的生物材料由呈水凝膠形式的透明質酸(HA)構成，其還包含大小范圍在5.1kDA至大于2X106kDA的HA分子。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的生物材料由呈多孔泡沫形式的透明質酸(HA)構成，其還包含大小范圍在5.1kDA至大于2X106kDA的HA分子。在另一個實施方案中，根據本發(fā)明使用的生物材料由聚乳酸(PLA)基泡沫構成，其具有開孔結構和約50微米至約300微米的孔徑。在另一個實施方案中，特定的細胞群(優(yōu)選B2和B4 )尤其可在腎內植入后通過透明質酸合酶-2 (HAS-2)直接合成和/或刺激合成高分子量透明質酸。
[0263]本領域的普通技術人員將意識到，可使用本領域中已知的其它類型合成或天然存在的材料以形成本文所述的支架。
[0264]在一個方面，本發(fā)明提供了由上述支架或生物材料制成的本文所述的構建體。
[0265]構建體
[0266] 在一個方面，本發(fā)明提供了用于治療有需要的受試者的腎病、貧血或EPO缺乏的可植入構建體，其具有本文所述的一種或多種細胞群。在一個實施方案中，構建體由生物相容性材料或生物材料、一種或多種合成或天然存在的生物相容性材料構成的支架或基質、以及通過附著和/或截留沉積在支架表面上或包埋于其中的一種或多種本文所述的細胞群或細胞混合物構成。在某些實施方案中，構建體由生物材料和本文所述的一種或多種細胞群或細胞混合物構成，所述細胞群或細胞混合物用一種或多種生物材料組分包覆、沉積在其上、與其附著、截留于其中、包埋于其中和/或與其結合。在另一個實施方案中，構建體的沉積細胞群或細胞組分為富集氧可調EPO生成細胞的第一腎細胞群。在另一個實施方案中，除了氧可調EPO生成細胞外，第一細胞群還包含腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，構建體的沉積細胞群或一種或多種細胞組分包括第一富集腎細胞群和第二腎細胞群。在一些實施方案中，第二細胞群未富集氧可調EPO生成細胞。在另一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞。在另一個實施方案中，第二細胞群富集腎小管細胞并包含集合管上皮細胞。在其它實施方案中，腎小管細胞可通過一種或多種腎小管細胞標記物的表達來表征，所述腎小管細胞標記物可包括但不限于:巨蛋白、cubilin、透明質酸合酶2(HAS2)、維生素D325-羥化酶(CYP2D25)、神經鈣黏著蛋白(Ncad)、上皮鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2 (Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rab17) ,GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4 (FxycM)、溶質載體家族9(鈉/氫交換劑)成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3 (Aldhla3)和鈣蛋白酶 _8 (Capn8)。
[0267]在一個實施方案中，沉積在生物材料或支架上或與其結合以形成本發(fā)明構建體的細胞群源自多種來源，諸如自體、同種異體、或同系(自體或同基因)來源。
[0268]本領域的普通技術人員將意識到，存在若干種適用于沉積細胞群或將其以其它方式與生物材料結合以形成構建體的方法。
[0269]在一個方面，本發(fā)明的構建體適用于本文所述的方法。在一個實施方案中，構建體適于對有需要治療任何病源的腎病、貧血或任何病源的EPO缺乏的受試者進行施用。在其它實施方案中，構建體適于對有需要改善或恢復紅細胞穩(wěn)態(tài)的受試者進行施用。在另一個實施方案中，構建體適于對有需要改善腎功能的受試者進行施用。
[0270]使用方法
[0271]在一個方面，本發(fā)明提供了用本文所述的腎細胞群和腎細胞混合物治療有需要的受試者的腎病、貧血或EPO缺乏的方法。在一個實施方案中，該方法包括對受試者施用包括富集EPO生成細胞的第一腎細胞群的組合物。在另一個實施方案中，第一細胞群富集EPO生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。在另一個實施方案中，組合物還可包括一種或多種附加的腎細胞群。在一個實施方案中，附加的細胞群是未富集EPO生成細胞的第二細胞群。在另一個實施方案中，附加的細胞群是未富集EPO生成細胞、腎小球細胞或血管細胞的第二細胞群。在另一個實施方案中，組合物還包括沉積于生物材料中、沉積在其上、包埋于其中、用其包覆或截留于其中以形成本文所描述的可植入構建體的腎細胞群或腎細胞混合物，其用于治療本文所述的疾病或病癥。在一個實施方案中，將細胞群單獨使用或與其它細胞或生物材料(例如水凝膠、多孔支架或天然或合成肽或蛋白質)聯(lián)合使用，以刺激急性或慢性病情恢復。
[0272]在另一個方面，通過本發(fā)明方法對受試者的腎病、貧血或EPO缺乏的有效治療可通過紅細胞生成和/或腎功能各種指標進行觀察。在一個實施方案中，紅細胞穩(wěn)態(tài)的指標包括但不限于血細胞比容(HCT)、血紅蛋白(HB)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細胞計數(RBC)、網織紅細胞數量、網織紅細胞百分比、平均紅細胞容積(MCV)和紅細胞分布寬度(RDW)。在另一個實施方案中，腎功能指標包括但不限于血清白蛋白、白蛋白與球蛋白的比率(A/G比率)、血清磷、血清鈉、腎大小(可通過超聲測量)、血清鈣、磷:鈣比率、血清鉀、尿蛋白、尿液肌酸酐、血清肌酸酐、血液尿素氮(BUN)、膽固醇水平、三酸甘油酯水平和腎小球濾過率(GFR)。此外，一般健康和健康的若干指標包括但不限于重量增量或重量損失、存活率、血壓(平均全身血壓、心臟舒張壓或心臟收縮壓)和體能耐力表現。
[0273]在另一個實施方案中，有效治療通過一個或多個腎功能指標的穩(wěn)定來證實。通過對經本發(fā)明方法治療的同一受試者的相同指標的變化(相對于未經本發(fā)明方法治療的受試者的指標而言)進行觀察來證實腎功能的穩(wěn)定。可選地，可通過對經本發(fā)明方法治療的同一受試者的相同指標的變化(相對于治療前的受試者的指標而言)進行觀察來證實腎功能的穩(wěn)定。第一指標的變化可為值的增加或降低。在一個實施方案中，通過本發(fā)明提供的治療可包括使受試者的血液尿素氮(BUN)水平穩(wěn)定，其中在該受試者體內觀察到的BUN水平與病情相同但未經本發(fā)明方法治療的受試者相比時相對較低。在另一個實施方案中，治療可包括使受試者的血清肌酸酐水平穩(wěn)定，其中在該受試者體內觀察到的血清肌酸酐水平與病情相同但未經本發(fā)明方法治療的受試者相比時相對較低。在另一個實施方案中，治療可包括使受試者的血細胞比容(HCT)水平穩(wěn)定，其中在該受試者體內觀察到的HCT水平與病情相同但未經本發(fā)明方法治療的受試者相比時相對較高。在另一個實施方案中，治療可包括使受試者的紅細胞(RBC)水平穩(wěn)定，其中在該受試者體內觀察到的RBC水平與病情相同但未經本發(fā)明方法治療的受試者相比時相對較高。本領域的普通技術人員將意識到，可測量本文所述或本領域中已知的一個或多個附加指標來確定對受試者腎病的有效治療。
[0274]在另一個方面，本發(fā)明涉及為有需要的受試者提供紅細胞穩(wěn)態(tài)的方法。在一個實施方案中，該方法包括下列步驟:(a)對受試者施用腎細胞群，例如B2或B4或腎細胞混合物，如B2/B4和/或B2/B3，如本文所述；和(b)確定來自受試者的生物樣本的紅細胞生成指標水平與對照的指標水平不同，其中指標水平的差值(i)指示受試者響應施用步驟(a)，或(ii)指示受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)。在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:(a)對受試者施用組合物，其包括本文所述的腎細胞群或腎細胞混合物；和(b)確定來自受試者的生物樣本的紅細胞生成指標水平與對照的指標水平不同，其中指標水平的差值(i)指示受試者響應施用步驟(s)，或(ii)指示受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)。在另一個實施方案中，該方法包括下列步驟:(a)提供生物材料或生物相容性聚合物支架；(b)以本文所述的方式將本發(fā)明的腎細胞群或腎細胞混合物沉積在生物材料或支架上或沉積在其中，以形成可植入構建體；(C)向受試者植入構建體 ；和(d)確定來自受試者的生物樣本的紅細胞生成指標水平與對照的指標水平不同，其中指標水平的差值(i)指示受試者響應施用步驟(a)，或(ii)指示受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)。
[0275]在另一個方面，本發(fā)明涉及使有需要的受試者的腎功能穩(wěn)定并使紅細胞穩(wěn)態(tài)恢復的方法，所述受試者患有腎功能缺陷和貧血和/或EPO缺乏。在一個實施方案中，該方法包括施用本文所述的腎細胞群或腎細胞混合物的步驟，所述腎細胞群或腎細胞混合物包含下列細胞類型中的至少一種:源自腎小管的細胞、源自腎小球的細胞、源自間質的細胞、源自集合管的細胞、源自間質組織的細胞或源自脈管系統(tǒng)的細胞。在另一個實施方案中，細胞群或混合物包含EPO生成細胞和腎小管上皮細胞，所述腎小管細胞通過下列標記物中的至少一種來鑒定:巨蛋白、cubilin、透明質酸合酶2 (HAS2)、維生素D325-輕化酶(CYP2D25)、神經鈣黏著蛋白(Ncad)、上皮鈣黏著蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白_2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成員(Rabl7)、GATA結合蛋白3 (Gata3)、含FXYD域的離子轉運調節(jié)子4 (FxycM)、溶質載體家族9 (鈉/氫交換劑)成員4(Slc9a4)、醛脫氫酶3家族成員BI (Aldh3bl)、醛脫氫酶I家族成員A3(Aldhla3)和鈣蛋白酶-8 (Capn8)。在此實施方案中，相對于未經治療或治療前的受試者的指標水平而言，對受試者的治療可通過至少一個腎功能指標的改善以及伴隨的至少一個紅細胞生成指標的改善來證實。[0276]在一個方面，本發(fā)明提供了通過施用本文所述的富集EPO生成細胞的腎細胞群或包含富集EPO生成細胞的細胞群的腎細胞混合物來(i)治療腎病、貧血或EPO缺乏；(ii)穩(wěn)定腎功能；(iii)恢復紅細胞穩(wěn)態(tài)或(iv)其中任何組合的方法，其中施用的有益效果優(yōu)于施用未富集EPO生成細胞的細胞群的效果。在另一個實施方案中，富集細胞群使血清血液尿素氮(BUN)水平得以改善。在另一個實施方案中，富集細胞群使血清中蛋白質的保留得以改善。在另一個實施方案中，富集細胞群提供了血清膽固醇和/或三酸甘油酯水平。在另一個實施方案中，富集細胞群使維生素D水平得以改善。在一個實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使磷:鈣比率得以改善。在另一個實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使血紅蛋白水平得以改善。在另一實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使血清肌酸酐水平得以改善。在另一個實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使血細胞比容水平得以改善。在另一實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使紅細胞數量(RBC#)水平得以改善。在一個實施方案中，改善的血細胞比容恢復至正常健康水平的95%。在另一實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使網織紅細胞數量得以改善。在其它實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使網織紅細胞比例得以改善。在其它實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使紅細胞容積分布寬度(RDW)水平得以改善。在另一個實施方案中，相對于非富集細胞群而言，富集細胞群使血紅蛋白水平得以改善。在另一個實施方案中，富集細胞群使骨髓中具有紅細胞生成應答，使得骨髓細胞含量接近正常并且使得骨髓細胞與紅細胞比率接近正常。[0277]在另一個方面，本發(fā)明提供了通過施用富集細胞群來(i)治療腎病、貧血或EPO缺乏；(ii)穩(wěn)定腎功能；(iii)恢復紅細胞穩(wěn)態(tài)或(iv)其任何組合的方法，其中相對于施用重組EPO(rEPO)所提供的有益效果而言，施用本文所述的腎細胞群或腎細胞群混合物的有益效果通過改善的紅細胞穩(wěn)態(tài)來表征。在一個實施方案中，相比施用重組EPO蛋白質而言，細胞群或混合物在施用至有需要的受試者時使紅細胞穩(wěn)態(tài)得以改善(通過血細胞比容、血紅蛋白或RBC#確定)。在一個實施方案中，相比重組EPO而言，細胞群或混合物在施用時使血細胞比容、RBC或血紅蛋白的水平得以改善，其不大于對照組中血細胞比容的約10%左右。在另一實施方案中，單次劑量或單次遞送的細胞群或混合物在施用時使經治療的受試者的紅細胞穩(wěn)態(tài)在一段時間內得以改善(通過血細胞比容、血紅蛋白或RBC#的增加來確定)，其中改善時間顯著超過單次劑量或單次遞送的重組EPO蛋白質使紅細胞穩(wěn)態(tài)得以改善的時間。在另一個實施方案中，細胞群或混合物在以本文所述的劑量施用時未導致血細胞比容、血紅蛋白或RBC#大于對比的健康對照組中正常水平的約110%。在另一實施方案中，相比以本文所述的劑量遞送的重組EPO蛋白質而言，細胞群或混合物在以本文所述的劑量施用時提供了較好的紅細胞穩(wěn)態(tài)(通過血細胞比容、血紅蛋白或RBC#來確定)。在另一個實施方案中，以約100IU/kg、約200IU/kg、約300IU/kg、約400IU/kg或約500IU/kg的劑量遞送重組ΕΡ0。本領域的普通技術人員將意識到，本領域中已知的其它劑量的重組EPO也是適用的。
[0278]本發(fā)明的另一個實施方案涉及本文所述的至少一種細胞群或本文所述的可植入構建體在制備藥物方面的用途，所述藥物可用于治療有需要的受試者的腎病、貧血或EPO缺乏，為有需要的受試者提供紅細胞穩(wěn)態(tài)，或使有需要的受試者的腎功能得以改善。
[0279]本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種或多種特定富集細胞群(本文所述)治療特定病源的腎病的用途，這基于根據已證實的特定治療特性對一種或多種特定細胞亞群進行的選擇。
[0280]施用方法和途徑
[0281]本發(fā)明的細胞制劑可單獨施用或可與其它生物活性組分組合施用。
[0282]本文所述的腎細胞群或腎細胞群混合物的治療有效量的范圍可為從受試者可安全接受的最大細胞數量到治療腎病(例如，使一種或多種腎功能穩(wěn)定、降低其衰退率或使其改善)所必需的最小的細胞數量。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法提供了以下列劑量對本文所述的腎細胞群或腎細胞群混合物進行施用:約10，000個細胞/千克、約20，000個細胞/千克、約30，000個細胞/千克、約40，000個細胞/千克、約50，000個細胞/千克、約100，000個細胞/千克、約200，000個細胞/千克、約300，000個細胞/千克、約400，000個細胞/千克、約500，000個細胞/千克、約600，000個細胞/千克、約700，000個細胞/千克、約800，000個細胞/千克、約900，000個細胞/千克、約1.1 X 106個細胞/千克、約
1.2X 106個細胞/千克、約1.3X 106個細胞/千克、約1.4X 106個細胞/千克、約1.5X106個細胞/千克、約1.6X106個細胞/千克、約1.7X106個細胞/千克、約1.8X106個細胞/千克、約1.9X106個細胞/千克、約2.1X106個細胞/千克、約2.1X106個細胞/千克、約1.2X106個細胞/千克、約2.3X106個細胞/千克、約2.4X106個細胞/千克、約
2.5 X 106個細胞/千克、約2.6 X 106個細胞/千克、約2.7 X 106個細胞/千克、約2.8 X 106個細胞/千克、約2.9X106個細胞/千克、約3X106個細胞/千克、約3.1X106個細胞/千克、約3.2X106個細胞/千克、約3.3X106個細胞/千克、約3.4X106個細胞/千克、約3.5X106個細胞/千克、約3.6X106個細胞/千克、約3.7X106個細胞/千克、約
3.8X106個細胞/千克、約3.9X 106個細胞/千克、約4X 106個細胞/千克、約4.1X106個細胞/千克、約4.2X106個細胞/千克、約4.3X106個細胞/千克、約4.4X106個細胞/千克、約4.5X106個細胞/千克、約4.6X 106個細胞/千克、約4.7X106個細胞/千克、約4.8X 106個細胞/千克、約4.9X 106個細胞/千克或約5X 106個細胞/千克。在另一個實施方案中，對受試者施用的細胞劑量可為單劑量或單劑量加附加劑量。在其它實施方案中，劑量可經由本文所述的構建體提供。在其它實施方案中，對受試者施用的細胞劑量可根據估計的腎臟質量或功能性腎臟質量來計算。
[0283]治療有效量的本文所述的腎細胞群或其混合物可懸浮于藥學上可接受的載體或賦形劑。此類載體包括但不限于基礎培養(yǎng)基加1%血清白蛋白、鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、膠原、藻酸鹽、透明質酸、纖維蛋白膠、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纖維素以及它們的組合。制劑應適合施用方式。因此，本發(fā)明提供了腎細胞群或其混合物(例如，單獨的B2細胞群或其與B3和/或B4細胞群的混合物)在制備治療受試者腎病的藥物方面的用途。在一些實施方案中，藥物還包含重組多肽，諸如生長因子、趨化因子或細胞因子。在其它實施方案中，藥物包含源自人腎的細胞群。可采用提供給本文所述方法的任何變型形式來分離、衍生或富集用于制備所述藥物的細胞。
[0284] 按照常規(guī)步驟將一種或多種腎細胞制劑或其混合物或組合物配制為適于對人類施用的藥物組合物。通常，用于靜脈內施用、動脈內施用或腎包膜內施用的組合物例如為在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物還可包括局部麻醉劑以緩解注射部位的任何疼痛。一般而言，將成分單獨或混合在一起以單位劑型提供，例如提供為密閉容器(如指示活性劑量的安瓿瓶)中的冷藏保存濃縮物。當組合物通過輸注施用時，其可用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶進行分配。當組合物通過注射施用時，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，以使得所述成分可在施用前混合。
[0285]藥學上可接受的載體部分由要施用的具體組合物以及用于施用組合物的具體方法決定。因此，存在多種合適的藥物組合物制劑(參見例如Alfonso R Gennaro(編著)，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,以前為 Remington’sPharmaceutical Sciences,第 20 版，Lippincott, ffilliams&ffilkins, 2003,其全文以引用方式并入本文)。一般將藥物組合物配制為無菌的、基本上等滲的，且與美國食品與藥物管理局的所有藥品生產質量管理規(guī)范(GMP)的規(guī)定完全相符。
[0286]本發(fā)明的一個方面還提供了一種藥物制劑，其包含本發(fā)明的腎細胞制劑，，例如單獨的B2細胞制劑或其與B3和/或B4細胞制劑的組合，以及藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，該制劑包含104至109個哺乳動物腎源細胞。
[0287]在一個方面，本發(fā)明提供了對有需要的受試者提供本文所述的一種或多種細胞群，包括混合物。在一個實施方案中，一種或多種細胞群的來源可為自體的或同種異體的、同系的(自體的或同基因的)及其任何組合。在來源并非自體來源的情況下，所述方法可包括施用免疫抑制劑。合適的免疫抑制藥物包括但不限于硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、咪唑立賓(mizoribine)、環(huán)孢素、他克莫司(tacrolimus)水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二鈉、金諾芬(auranofin)、前列地爾(alprostadil)、鹽酸狐立莫司(gusperimus hydrochloride)、biosynsorb、莫羅莫那(muromonab)、阿法賽特(alefacept)、噴司他丁、達利珠單抗(daclizumab)、西 羅莫司(sirolimus)、霉酹酸酯、來氟米特(Ieflonomide)、巴利昔單抗(basiliximab)、鏈道酶 a、bindarid、克拉屈濱(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(i1decakin)、西利珠單抗(cedelizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、依維莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加維莫單抗(gavilimomab)、法拉莫單抗(faralimomab)、氯法拉濱(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、希普利珠單抗(siplizumab)、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114, IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349,IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CN1-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4_lg、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710, PTR-262-MG 和 AG1-1096 (參見美國專利N0.7，563，822)。本領域的普通技術人員將意識到其它合適的免疫抑制藥物。
[0288]本發(fā)明的治療方法涉及向個體遞送分離的腎細胞群或其混合物。在一個實施方案中，優(yōu)選將細胞直接遞送至目標受益部位。在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞制劑或其混合物經由遞送載體遞送至個體。
[0289]依據本說明書，對患者施用細胞的多種方法對本領域的技術人員是顯而易見的。此類方法包括將細胞注射到受試者的靶部位內。可將細胞插入遞送裝置或載體中，該遞送裝置或載體有利于通過向受試者體內注射或植入來導入。在某些實施方案中，遞送載體可包括天然材料。在某些其它實施方案中，遞送載體可包括合成材料。在一個實施方案中，遞送載體提供一定的結構來模擬或適當地符合器官結構。在其它實施方案中，遞送載體具有類似流體的性質。此類遞送裝置可包括用于將細胞或流體注射到受體受試者體內的管，例如導管。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述管另外具有針頭，例如注射器，通過其可將本發(fā)明的細胞導入到患者的預期位置。在一些實施方案中，配制哺乳動物腎源細胞群用于經由導管施用到血管中(其中術語“導管”意在包括多種用于將物質遞送至血管的管樣系統(tǒng)中的任一種)。作為另外的選擇，可將細胞插入生物材料或支架中或插在其上，所述生物材料或支架包括但不限于紡織物，如梭織、針織、編織、篩，和非紡織物、有孔膜、海綿和泡沫，以及珠，例如實體或多孔珠、微粒、納米顆粒等。可將細胞制備為以多種不同形式遞送。例如，細胞可懸浮在溶液或凝膠中。可將細胞與藥學上可接受的載體或稀釋劑混合，其中本發(fā)明的細胞在所述載體或稀釋劑中保持存活。藥學上可接受的載體和稀釋劑包括鹽水、水性緩沖溶液、溶劑和/或分散介質。此類載體和稀釋劑的用途是本領域中所熟知的。溶液優(yōu)選是無菌的且為液體，并且通常是等滲的。優(yōu)選地，溶液在生產和儲存條件下是穩(wěn)定的，并通過使用例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等防腐，以對抗微生物(如細菌和真菌)的污染作用。本領域的技術人員將意識到，用于遞送本發(fā)明的細胞群及其混合物的遞送載體可包括上述特性的組合。
[0290]一種或多種分離的腎細胞群(例如，單獨的B2細胞群或其與B4和/或B3的混合物)的施用方式包括但不限于全身性、腎臟內(例如實質)、靜脈內或動脈內注射和直接注射到組織中的預期作用部位。可根據本發(fā)明使用的另外的施用方式包括通過直接剖腹手術、直接腹腔鏡檢查、經腹或經皮進行的一次或多次注射。可根據本發(fā)明使用的另外的施用方式包括例如逆行輸注和輸尿管腎盂輸注。施用的外殼手術方法包括一步手術，例如但不限于部分腎切除術和構建體移植、部分腎切除術、部分腎盂切除術、帶網膜土腹膜的血管化、多灶性活檢針跡、圓錐或錐體、至圓柱體和腎極狀替換，以及兩步手術，包括例如用于移植的類器官內部生物反應器。在一個實施方案中，將細胞混合物在同一時間經由相同途徑進行遞送。在另一個實施方案中，通過本文所述的一種或多種方法，將包含控釋混合物的每種細胞組合物分別遞 送至特定位置，或經由特定方法將其同時或以時序可控的方式進行遞送。
[0291]人的適宜細胞植入劑量可由涉及細胞活性(例如EPO生成)的現有信息來確定，或根據臨床前研究所進行的劑量研究來推測。由體外培養(yǎng)和體內動物實驗可對細胞量進行定量，并用該量計算植入材料的適宜劑量。此外，可監(jiān)測患者以確定是否可進行額外的植入，或相應減少植入材料。
[0292]可向本發(fā)明的細胞群及其混合物中添加一種或多種其它組分，包括選定的細胞外基質組分，諸如本領域中已知的一種或多種類型的膠原或透明質酸和/或生長因子、富含小板塊的血漿和藥物。
[0293]本說明書所引用的所有專利、專利申請和參考文獻的全文均在此以引用的方式并入。
[0294]以下提供的實施例僅為示例性目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例
[0295]實施例1-來自患腎衰竭成年豬的生物應答腎細胞的分離和特征
[0296]患有伴隨貧血的特發(fā)進行性慢性腎病(CKD)的成年公豬(野豬)提供了新鮮的患病腎組織，以通過與年齡相一致的正常豬腎組織的直接比較來評價細胞組成和特征。[0297]收集時的腎組織的組織學檢查證實，由重度彌漫性慢性間質纖維化和伴隨多灶性纖維化的新月體性腎小球腎炎表征的腎病。臨床化學證實了氮血癥(血液尿素氮和血清肌酸酐升高)和輕度貧血(血細胞比容輕度降低且血紅蛋白水平降低)。將細胞從患病和正常腎組織中分離、擴增并表征。
[0298]圖1示出突出患病腎組織相比正常腎組織的纖維化的Gomori Trichrome染色(箭頭指示的藍染色)。表達cubulin:巨蛋白并且能夠轉運受體介導的白蛋白的功能性腎小管細胞從患病和正常腎組織中增殖。促紅細胞生成素(EPO)表達細胞存在于培養(yǎng)物中并經多次傳代和凍-融循環(huán)保留。此外，分子分析證實來自患病和正常腎組織的EPO表達細胞通過EPO和低氧調芐基因靶位(包括vEGF)的HIFl驅動誘導響應體外低氧條件。
[0299]經由膠原酶+分散酶的酶消化從豬腎組織分離細胞，或通過進行簡單的機械消化和外植體培養(yǎng)，在獨立的實驗中分離細胞。傳代時，使兩種源自外植體的包含epo表達細胞的細胞培養(yǎng)物經受大氣(21%)和變化的低氧(〈5%)的培養(yǎng)條件，以確定低氧下的暴露是否最終使EPO基因表達上調。正如通過嚙齒動物培養(yǎng)物(見實施例3)可注意到，正常豬表現出EPO基因的氧依賴性表達和調節(jié)。意外的是，盡管CKD豬存在尿毒癥/貧血狀態(tài)(血細胞比容〈34，肌酸酐>9.0),EPO表達細胞仍易于從組織中分離并增殖，并且EPO基因的表達仍保持低氧調節(jié)，如圖2所示。
[0300]如圖3所示，增殖培養(yǎng)物中的細胞顯示出自組織成小管樣結構的能力。
[0301]如所示圖4，通過觀察經培養(yǎng)的細胞對FITC綴合白蛋白的受體介導吸收來證實培養(yǎng)物(第3代)中存在功能性腎小管細胞。(由白色細箭頭指示的)綠色圓點代表內吞的熒光素綴合白蛋白，其由腎小管細胞特異受體、巨蛋白和Cubilin介導，指示功能性腎小管細胞的蛋白質重吸收作用。(由白色粗箭頭指示的)藍染色為Hoescht染色的細胞核。
[0302]合在一起，這些數據表明可從豬腎組織，甚至已嚴重受CKD損害的腎組織中分離并增殖功能性腎小管細胞和內分泌細胞。此外，這些發(fā)現支持了基于自體細胞的治療產品在治療CKD方面的進展。
[0303]實施例2-從人腎分離生物應答EPO細胞
[0304] 通過酶解從正常成人腎中分離EPO生成細胞(如上文實施例1所述)。如圖5所示，分離程序導致相對EPO表達在分離后比在初始組織中更多。如圖6所示，可在培養(yǎng)物中維持保留EPO基因表達的人EPO生成細胞。在經組織培養(yǎng)處理的平塑料板或用一些細胞外基質(諸如纖連蛋白或膠原)包覆的塑料板上培養(yǎng)/增殖人細胞，并且發(fā)現所有細胞均支持隨時間的EPO表達。
[0305]實施例3-來自嚙齒動物腎的生物應答EPO表達細胞和腎小管細胞的培養(yǎng)
[0306]本研究利用分離自Lewis大鼠(Lewis rat)的原代腎細胞對響應低氧和剪切力的EPO表達和腎小管標記物表達進行了體外分析。
[0307]使用適于小鼠的標準方法從Lewis大鼠中分離原代腎細胞(Aboushwareb等，2008.World J.Urol.Aug; 26 (4): 295-300)，并使其在低氧和高氧或靜態(tài)和動態(tài)3D培養(yǎng)物中增殖。
[0308]通過將細胞在大氣“常氧”培養(yǎng)條件(平衡至21%02、5%C02的37°C培養(yǎng)箱)下進行培養(yǎng)，然后將氧張力減至低氧培養(yǎng)(平衡至2%02、5%C02的37 °C培養(yǎng)箱)以活化Epo的低氧依賴性基因轉錄，從而確定Epo生成細胞的氧依賴性。最終轉回常氧條件會抑制在低氧條件下發(fā)生的基因轉錄。將原代腎細胞在常氧條件下于2維(2D)板和3D(見下文Cultisphere實施例)構建體上進行培養(yǎng)，以使細胞附著(通常48小時)。然后將附著的細胞移至低氧培養(yǎng)箱中，并將其培養(yǎng)48小時。48小時的低氧培養(yǎng)時間點結束后，將細胞移回至常氧培養(yǎng)。在初始常氧培養(yǎng)、然后低氧培養(yǎng)并且最終轉回常氧培養(yǎng)下的每個規(guī)定時間點處，收集來自三個板上的樣本的細胞。分析前，將收集的樣本在液氮中急凍、儲存在_80°C下。通過從每個樣本中分離總mRNA，再由總mRNA進行cDNA合成來進行基因表達分析，并且用實時定量per (qrtpcr)來確定相對基因表達。除了 3個板上的樣本外,還通過qrtpcr分析了 2個技術性樣本，從而在每種培養(yǎng)條件下于每個時間點處獲得總共6個樣本。
[0309]Cultisphere-S 明膠微載體珠
[0310]采用標準方法從幼鼠分離原代腎細胞。將大約200，000個細胞置于培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物中包含無菌Cultisphere-S(Sigma-Aldrich cat#M9043)大孔明膠微載體珠(130-380 μ m)的200 μ 150%(v/v)的漿料，所述大孔明膠微載體珠位于低附著6孔板上。靜態(tài)(包含細胞的板在整個實驗過程中不作任何移動)條件或動態(tài)(持續(xù)移動)條件下將細胞置于含2%或21%氧的室中。隨研究的時間時程(7天)定期收集每種條件下的樣本。每天收集每種條件下的三個樣本。將所有樣本的基因表達均標準化為起始物料、來自初始分離的原代細胞的未分化細胞懸液。進行QRTPCR以分別檢驗腎小管細胞和內分泌細胞標記物、上皮鈣黏著蛋白和EPO的表達。
[0311]結果:培養(yǎng)的內分泌細胞中的EPO表達經由動態(tài)培養(yǎng)而上調，這與靜態(tài)和/或低氧培養(yǎng)相反。圖7示出大氣(21%)氧含量下的3D培養(yǎng)物中動態(tài)培養(yǎng)的(+)ΕΡ0表達的結果。圖8示出低(2%)氧含量下的3D培養(yǎng)物中動態(tài)培養(yǎng)的(+)ΕΡ0的表達。圖9同樣示出長期培養(yǎng)時動態(tài)培養(yǎng)的(+)腎小管基因的表達。相對于高氧和靜態(tài)培養(yǎng)而言，低氧和動態(tài)3D培養(yǎng)分別顯著增加了 E PO表達(ρ〈0.05)。圖10示出低氧培養(yǎng)物(相對常氧培養(yǎng)物)中的EPO表達。圖11示出圖11示出體外動態(tài)3D培養(yǎng)物對EPO表達的刺激。EPO表達的增加往往伴隨著其調節(jié)子、HIFla和其它HIFl a靶基因(如VEGF)表達的增加。因此，清楚的是培養(yǎng)的新腎細胞中的EPO表達經由HIFl a、通過氧含量來調節(jié)。以上結果表明保持氧和對EPO表達的機械轉導調節(jié)的生物應答性原代嚙齒動物腎細胞可分離并在體外增殖。
[0312]實施例4 - 3D構律體和對比培養(yǎng)物
[0313]為了確定包含細胞、支架和培養(yǎng)基的新組織/新器官結構的體內功能性(如治療潛力)的最佳體外指征，設計了許多三維培養(yǎng)結構。新組織/新器官結構設計如下:將原代腎細胞培養(yǎng)物(包含EPO生成細胞和腎小管細胞)接種到直徑為5mm、高度為5mm的多孔圓柱形支架上。將細胞以500K至1，000，000個細胞/支架的密度接種，并在原型多孔灌流系統(tǒng)(MPS，BD Technologies)上進行培養(yǎng)，該系統(tǒng)在整個實驗過程中提供連續(xù)的單向流體流。培養(yǎng)基由DMEM+10%FBS (培養(yǎng)基A)或DMEM+10%FBS與KSFM培養(yǎng)基的1:1混合物(培養(yǎng)基B)構成。這些實驗中評估的支架包括采用標準方法制成的開孔聚乳酸(OPLA)和膠原I支架(均得自BD)和聚乙醇酸基支架(PGA)。
[0314]特征包括:足以使流體流經細胞-支架復合物的孔徑和結構；可為細胞-支架和細胞-細胞相互作用提供微環(huán)境的支架結構和組成；存在表達和/或生成和/或轉運腎再生和/或穩(wěn)態(tài)中所涉及的蛋白質和/或分子或具有表達和/或生成和/或轉運腎再生和/或穩(wěn)態(tài)中所涉及的蛋白質和/或分子的潛力的細胞。[0315]例如，在由開孔聚乳酸(OPLA)構成的優(yōu)選3D支架中接種哺乳動物腎細胞，并使其在生物反應器裝置中進行體外培養(yǎng)，該裝置在整個支架中提供連續(xù)的培養(yǎng)基灌流。體外條件支架+細胞復合物通過下列表征:存在存活的、代謝活性細胞；細胞-細胞以及細胞-材料的相互作用；包括但不限于巨蛋白、Y-谷氨酰轉肽酶(GGT)、上皮鈣黏著蛋白和神經鈣黏著蛋白的腎小管標記物的表達；以及包括但不限于促紅細胞生成素的腎內分泌標記物的表達。
[0316]益里:從所示2D和3D培養(yǎng)物中收集到條件培養(yǎng)基和總蛋白裂解物。進行ELISA分析以定量細胞裂解物(圖12A)和條件培養(yǎng)基(圖12B)中的靶蛋白。 [0317]經數天灌流或靜態(tài)培養(yǎng)后，采用標準技術將接種的OPLA和I型膠原支架固定在10%福爾馬林緩沖液中并經石蠟包埋。進行蘇木精和伊紅(H&E)染色以檢驗細胞的存在和形態(tài)。灌流支架中的細胞含量高于靜態(tài)支架中的細胞含量，相比I型膠原支架，整個OPLA支架中的細胞分布更為顯著(見圖13)。
[0318]圖14A-14H示出(靜態(tài)和灌流)培養(yǎng)七天后OPLA和I型膠原支架的掃描式電子顯微鏡(SEM)照片的結果。相比靜態(tài)培養(yǎng)物，灌流培養(yǎng)物顯示出較大的細胞含量和細胞組織。
[0319]通過添加裂解緩沖液(Qiagen)使mRNA從支架或2D培養(yǎng)物中分離，并通過在裂解緩沖液中進行電均化(polytixm)使其從3D支架中分離。通過用對目標靶基因特異的內含子跨越引物對純化的mRNA進行RT-PCR分析顯示，所檢驗的3/73D結構經5天培養(yǎng)后表現出靶基因(即ΕΡ0)的表達。
[0320]相反，2D結構(圖15中泳道8-10)在5天中沒有可檢測的靶基因mRNA。圖15的泳道I表示3D結構，其在5天中的表達水平接近已知表達靶基因的顯微解剖的新鮮組織(泳道21)中所觀察到的水平。
[0321]圖16示出CellTiter Blue? (刃天青代謝)的結果，其用于評價支架中的代謝活性。支架結構C在灌流和靜態(tài)條件下均得到了最佳的代謝反應，接著分別為支架B和支架A。在所有支架結構中，就刃天青代謝而言，灌流培養(yǎng)優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)。
[0322]為檢驗原代腎細胞的灌流和靜態(tài)3D培養(yǎng)物對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，收集條件培養(yǎng)基并在Nova BioProflle? 400對其進行分析。葡萄糖的消耗在灌流(相比靜態(tài))條件下顯著加快。谷氨酰胺在所有3D條件下均消耗至一定的程度，其中在灌流(相比靜態(tài))條件下消耗略多。在所有測試的支架結構中，谷氨酸鹽(谷氨酰胺代謝的副產物)的生成在灌流(相比靜態(tài))條件下較多，乳酸鹽(葡萄糖代謝的副產物)的生成同樣如此(見圖17A-17D)。
[0323]實施例5 -未分化的腎細胞混合物異質性群(供試品#1)的分離
[0324]將主要由腎小管細胞構成但也包含集合管、腎小球、內分泌、血管和其它細胞類型的較小亞群的未分化的腎細胞混合物(UNFX)富集群按以下方式從全腎中分離:
[0325]細胞供體:將二十只(20)2周大的雄性Lewis大鼠處死并獲取其腎臟。將新切離的腎置于含 5OmL 冷(4°C ) Hypothermasol (Biolife Solutions, Inc.Bothell, WA)的 5OmL圓錐管中(每個管中10個腎)并保存在冰塊上。第二天，用70%的乙醇沖洗裝有腎的管，然后置于生物學安全柜(BSC)中，以供處理。
[0326]腎細胞分離方法:用包含50 μ g/ml慶大霉素(Sigma, St.Louis, MO)的IXPBS (Gibco1Grand Island，NY)沖洗腎，并用鑷子和解剖刀手動移除結締組織和腎盞。用無菌鑷子和解剖刀將腎手動切碎成細胞/組織漿液。[0327]在平臺搖晃式搖床上，將細胞/組織制劑在包含分散酶(4U/mL) (#07193StemCell Technologies, Vancouver, BC) + 5mM CaC12 + IV 型膠原酶(300U/mL)(Worthington, Newark, NJ)的Kreb緩沖液中在37O下用酶消化30分鐘。然后將所得細胞懸液通過帶70 μ m孔的細胞過濾網(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)過濾到包含50:50腎細胞生長培養(yǎng)基(1:1的高糖DMEM:KSFM)的50mL無菌聚丙烯圓錐管中。然后將懸浮液在300 Xg下離心5分鐘，并再懸浮于IOml的50:50腎細胞生長培養(yǎng)基中。
[0328]將IOmL細胞懸液分裝在兩個15mL的圓錐管中(每個管中5ml)。將5ml30%w/vOptiprep (Sigma, St.Louis, MO)添加到每個管中并翻轉6次。混合后,將I毫升IX PBS小心鋪在各懸浮液的頂部。將管在SOOxg下連續(xù)離心15分鐘(室溫)。經IOmL無菌移液管移除細胞帶(包含存活的新腎細胞原型#1 )，用50:50腎細胞生長培養(yǎng)基(用低糖DMEM制備)稀釋5倍，并且在300xg下離心5分鐘。離心后，小心移除上清液，并將細胞沉淀在10ml50:50(低糖)腎細胞生長培養(yǎng)基中再懸浮并計數。對500K細胞進行抽樣用于基因表達測試。存活細胞的總收率為230X106 (94%存活率)。[0329]將總共46.8 X 106個細胞接種在50:50(低糖)培養(yǎng)基中的(40) p100組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯板(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)上(每塊板1.17X 106個細胞),然后放置在標準C02培養(yǎng)箱(21%02)中。48小時后，用50:50 (低糖)培養(yǎng)基對培養(yǎng)物進行100%的培養(yǎng)基更換，并將其置于37°C的2%02環(huán)境中。24小時后，將細胞在2%02下收集以供移植。將每塊板在無菌PBS中洗滌I次，然后添加5.0mL0.25%的溫胰蛋白酶w/EDTA (Sigma)，并回放在37°C下并保持5-7分鐘。將生長培養(yǎng)基(5.0mL)添加至每塊板中，并移除細胞懸液，然后倒入50mL無菌聚丙烯圓錐管中。通過在300xg下離心5分鐘使細胞沉淀,在無菌PBS中洗滌2次，再懸浮于冷(4°C) PBS中，然后經由血細胞計數器計數。在無菌冷PBS中制備10X 106個細胞/100 μ L的等分試樣。存活細胞的培養(yǎng)后總收率為91X106 (90%存活率)。擴增倍數(接種一收集)為3.91倍。
[0330]實施例6-未分化的腎細胞混合物異質性群的分離和支架接種(供試品#2)
[0331]細胞供體:將十只(10)2周大的雄性Lewis大鼠處死并獲取其腎臟。將新切離的腎置于含 50mL 冷(4°C ) Hypothermasol (Biolife Solutions, Inc.Bothell, WA)的 5OmL 圓錐管中(每個管中10個腎)并保存在冰塊上。第二天，將裝有腎的管用70%的乙醇沖洗，然后置于生物學安全柜(BSC)中以供處理。
[0332]腎細胞分離方法:將腎用包含50 μ g/ml慶大霉素(Sigma, St.Louis, MO)的IXPBS (Gibco1Grand Island，NY)沖洗，并用鑷子和解剖刀手動移除結締組織。用無菌鑷子和解剖刀將腎手動切碎成細胞/組織漿液。
[0333]在平臺搖晃式搖床上，將細胞/組織制劑在包含分散酶(4U/mL) (#07193StemCell Technologies, Vancouver, BC) + 5mM CaC12 + IV 型膠原酶(300U/mL)(Worthington, Newark, NJ)的Kreb緩沖液中在37O下用酶消化30分鐘。然后將所得細胞懸液通過帶70 μ m孔的細胞過濾網(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)過濾到包含50:50腎細胞生長培養(yǎng)基(1:1的高糖DMEM:KSFM)的50mL無菌聚丙烯圓錐管中。然后將細胞懸浮液在300xg下離心5分鐘，并再懸浮于IOml的50:50腎細胞生長培養(yǎng)基中。
[0334]將IOmL細胞懸液分裝在兩個15mL的圓錐管中(每個管中5ml)。將5ml30%w/vOptiprep (Sigma, St.Louis, MO)添加到每個管中并翻轉6次。混合后,將I毫升IX PBS小心鋪在各懸浮液的頂部。將管在SOOxg下連續(xù)離心15分鐘(室溫)。經IOmL無菌移液管移除細胞帶(包含存活的新腎細胞原型#1 )，用50:50腎細胞生長培養(yǎng)基(用低糖DMEM制備)稀釋5倍，并且在300xg下離心5分鐘。離心后，小心移除上清液，并將細胞沉淀在10ml50:50(低糖)腎細胞生長培養(yǎng)基中再懸浮并計數。存活細胞的總收率為71X106 (97%存活率)。
[0335]將24個無菌封裝的開孔聚乳酸(OPLA?)支架(BD Biosciences, FranklinLakes NJ)用50:50 (低糖)培養(yǎng)基預潤濕，并且在50 μ L50:50 (低糖)培養(yǎng)基中，在支架上接種1父106個1?42新腎細胞原型#1。使支架在37°C /21%02下適應2小時，然后轉移至裝有MPS (多孔灌流系統(tǒng))的裝置(BD Technologies, RTP NC)中，并在2%02下連續(xù)流動的50:50 (低糖)培養(yǎng)基中保持5天。每隔兩天更換(50%體積變化)培養(yǎng)基。第五天，將支架從MPS中小心移除，在無菌PBS中沖洗，并將其在運送以備移植時于環(huán)境溫度下保持大約2小時。
[0336]實施例7 -將未分化的腎細胞混合物植入腎衰竭和貧血.的大鼠模型中
[0337]要評價新腎細胞原型#1 (UNFX)的治療潛力和安全性，應評價新腎細胞原型#1在腎切除手術嚙齒動物中延緩或逆轉腎衰竭和/或貧血的能力，其中新腎細胞原型#1包含異質性細胞混合物，其包括分離自大鼠腎臟的EPO生成間質成纖維細胞、近端和遠端腎小管上皮細胞、腎小球細胞和內皮細胞，如上文所述。下表1中示出了研究設計。非限制性成功因素包括下列各項:
[0338]I)對HCT和/或RBC數量的顯著積極效果
[0339]2)血清BUN和/或肌酸酐的顯著降低 [0340]3)紅細胞刺激的組織學證據
[0341]4)腎再生的組織學證據
[0342]5)生物體水平改善(體重增量、存活率)
[0343]根據研究設計，從Charles River Laboratories (Wilmington, MA)獲取二十四
(24)只成年雌Lewis大鼠(8-10周大)，并指定為下表1中所示的研究受體。通過每天的健康評估以及每周的血液學和血清學分析來監(jiān)測每組個體的病情發(fā)作情況。所有受體動物在用新腎原型進行治療前均已患有貧血/尿毒癥。在研究開始前，要求腎切除大鼠在連續(xù)兩周中的血清肌酸酐升高(2倍于對照水平)。將腎切除大鼠分配到四組之一中(見下表1)。第I組大鼠接受10，000, 000個新腎細胞原型#1 (供試品I)，該新腎細胞原型#1懸浮在無菌PBS中并經由直接注射到腎的皮髓區(qū)域進行遞送。通過使新腎構建體原型#1 (接種有
IX 106個新腎原型#1細胞并培養(yǎng)4天的OPLA支架)附著到殘腎遠極上來對第2組大鼠進行治療。通過使空OPLA支架附著到殘腎遠極上來對第3組大鼠進行治療。第4組大鼠未接受治療。將未處理的、年齡相一致的對照大鼠指定為第5組；將經受腎切除假手術但未做進一步處理的年齡相一致的對照大鼠指定為第6組。
[0344]每周經由尾靜脈從所有動物抽取血液(500 μ L)，以評價腎功能(肌酸酐和BUN)和紅細胞生成(HCT、RBC和有核RBC(nRBC))。在研究過程中，每周進行健康觀察并收集體重。研究結束(84天)時，使存活的大鼠經受游泳耐力試驗。在尸體剖檢時采集股骨、腎、肝、脾、心臟和肺，稱重并通過福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)以用于組織學分析。將腎的一部分包埋到OCT培養(yǎng)基中，冷凍并經由冰凍切割處理。將FFPE組織進行處理并進行H&E染色。
[0345]表1.研究設計
【權利要求】
1.一種人腎細胞混合物，其包括第一細胞群、B2和第二細胞群，其中B2包括分離的腎小管細胞富集群，并且其中所述第二細胞群包括促紅細胞生成素(EPO)生成細胞、腎小球細胞和血管細胞。
2.一種分離的人腎細胞富集群，其包括B2細胞群，其中B2包括分離的腎小管細胞富集群。
3.一種制備人B2細胞群的方法，包括: a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下；和 b)提取包含所述B2細胞群的第一細胞組分。
4.一種制備人B4細胞群的方法，包括: a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下；和 b)提取包含所述B4細胞群的第一細胞組分。
5.—種產生B2細胞群的方法，包括: a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下； b)將所述細胞懸液施加到流式細胞儀中，所述流式細胞儀能夠同時測量所述細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射； c)從所述細胞群中選出細胞亞群； d)分選來自所述細胞群的細胞亞群；和 e)將所述B2細胞亞群與所述細胞群分離， 其中相對于所述細胞群的大部分而言，所述B2細胞亞群通過高前向散射和高側向散射來表征。
6.—種產生B4細胞群的方法，包括: a)將包含非富集異質性腎細胞群的細胞懸液暴露在低氧培養(yǎng)條件下； b)將所述細胞懸液施加到流式細胞儀中，所述流式細胞儀能夠同時測量所述細胞群內一個或多個單個細胞的前向散射和側向散射； c)從所述細胞群中選出細胞亞群； d)分選來自所述細胞群的細胞亞群；和 e)將所述B4細胞亞群與所述細胞群分離， 其中相對于所述細胞群的大部分而言，所述B4細胞亞群通過低前向散射和低側向散射來表征。
7.一種用于向有需要的受試者提供改善的腎功能的可植入構建體，包括: a)生物材料，其包含一種或多種生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白質或肽；和 b)哺乳動物腎細胞混合物，其包括第一細胞群、B2和第二細胞群， 所述混合物用所述生物材料包覆、沉積在其上或其中、截留于其中、懸浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式與其結合。
8.一種治療有需要的受試者的腎病的方法，包括: a)對所述受試者施用包含哺乳動物腎細胞混合物的組合物，所述哺乳動物腎細胞混合物包括第一細胞群、B2和第二細胞群；以及 b)確定來所述自受試者的試樣的腎功能指標水平與對照組的指標水平不同，其中所述指標水平的差值指示所述受試者的一種或多種腎功能衰退的減輕、穩(wěn)定或改善。
9.一種選定的腎細胞群，其在約1%至約5%的氧含量下暴露約12至約24小時后可通過密度梯度離心來分離，所述梯度包括密度為約1.045g/mL至約1.052g/mL的部分，其中所述細胞群Q)在離心后保留于密度介于1.045g/mL至約1.052g/mL之間的梯度中；(ii)包括腎小管細胞群，其通過至少一種腎小管細胞標記物的表達來表征；(iii)包括腎小管細胞亞群，其能夠轉運受體介導的白蛋白；(iv)能夠在遞送至有患腎病風險或患有腎病的受試者時調節(jié)一種或多種腎功能。
10.一種選定的腎細胞群，其在約1%至約5%的氧含量下暴露約12至約24小時后可通過密度梯度離心來分離，所述梯度包括密度為約1.063g/mL至約1.091g/mL的部分，其中所述細胞群⑴在離心后保留于密度介于約1.063g/mL至約1.091g/mL之間的梯度中；(ii)包括氧可調促紅細胞生成素(EPO)表達細胞、腎小球細胞和血管細胞；(iii)能夠在遞送至有患腎病風險或患有腎病的受試者時調節(jié)一種或多種腎功能；和(iv)能夠在聯(lián)合施用時通過權利要求9所述的腎細胞群增強對一種或多種腎功能的調節(jié)。
【文檔編號】A61L27/38GK103937737SQ201410138382
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2009年11月12日 優(yōu)先權日:2008年11月12日
【發(fā)明者】沙倫.普里斯內爾, 安德魯.布魯斯, 謝伊.M.華萊士, 蘇瑪納.喬德赫里, 拉塞爾.W.凱利, 曼紐爾.J.杰奧, 埃里克.S.沃丁, 帕特里夏.D.塔特蘇米, 杰西卡.J.萊因施, 蒂莫西.A.伯特拉姆, 奧魯瓦托英.A.奈特, H.S.拉波波特, 羅杰.M.伊拉甘 申請人:坦吉恩股份有限公司