專利名稱：用于改善皮膚外觀的活細胞的用途的制作方法
技術領域：
本發明關于一種用于改善皮膚老化外觀的醫藥組合物及其應用，尤其關于改善人類臉部皮膚老化外觀的醫藥組合物及其應用。
背景技術：
皮膚老化的途徑區分為自然性老化與光老化兩種途徑(Fisher et al.，2002)， 皮膚的自然性老化主要由染色體來控制，目前醫學科技尚無法從改變染色體來阻止其進行，只能由避免已知的惡化因素(如暴露某些有害物質)著手。兩種老化途徑可由穿衣覆蓋部位與陽光經常暴曬部位區別，表現的皮膚老化程度也有所不同。自然性老化可觀察到角質干細胞(keratinocyte stem cells)減少的趨勢(Bosset et al. , 2003;Kwon etal. , 2008; Webb et al.，2004),而且在顯微結構的老化表現例如表皮中天然保濕因子流失，角質層增厚堆積，基底層細胞紊亂，黑色素增加呈現老人斑、色素斑、暗沉；真皮中乳頭層平坦、玻尿酸減少(Oh et al.，2011),彈力纖維變性(Braverman et al.，1982),彈力蛋白質排列紊亂，膠原蛋白降低(Scharffetter-Kochanek et al.，2000),皮膚日漸不平坦，張力及彈性喪失，于是皺紋、松弛接踵而至，皮下脂肪變薄，皮脂腺分泌下降，皮脂膜功能趨低，皮膚保護功能以及保水的能力變差(Montagna et al.，1990)。近年來各先進國家推陳出新各種醫學美容方式來改善皮膚老化現象，改善皮膚光老化的方法有很多，包括藥物治療、化妝品、外科治療、剝脫性治療、注射性治療、非剝脫性嫩膚治療等。但藥物及部份保養品所含膠原蛋白、彈力素、水解蛋白質、黏多醣、玻尿酸、維他命E等因為分子結構太大，無法經皮吸收進入真皮，只能停留在表皮上扮演保濕的角色；外科治療、剝脫性治療及注射性治療(如果酸換膚、微晶磨皮、激光除斑、激光磨皮、除皺)可以更新老化膚質，達到再生新皮的目的，但會產生創傷，皮膚恢復緩慢、術后并發癥多，而膠原蛋白注射只能暫時性填充真皮組織消除皺紋，維持時間不超過九個月；非剝脫性嫩膚治療的激光及射頻容易造成炎癥后色素沉著、瘢痕等并發癥，并且波長單一適用范圍小。細胞治療是使用干細胞改善受損的器官，于醫學領域作為最新的治療方式。造血干細胞(hematopoiesis stem cell, HSC)是存在骨髓內的多能性干細胞,可分化成單核球、顆粒球、淋巴球、紅血球及血小板(Gao et al.，2007)。周邊血液干細胞(peripheralbloodstem cells, PBSC)在造血干細胞來源中相對容易取得，對捐贈者物理性傷害較小(Johnson et al.，1999)，并且在醫學上有更多論文左證，因此周邊血液干細胞的應用科技比其它成人干細胞有更多研究。迄今，此等干細胞未曾被使用作為達成改善皮膚老化的目的用的組合物的活性成分。希望獲得一種使用新穎干細胞醫藥的組合物，該組合物能對皮膚提供改善的美觀，特別是提供有效程度的淡化皺紋、更新膚質。更進一步希望獲得能有效淡化皺紋、更新膚質，并且其所需之生物性材料濃度最少的組合物
發明內容
本發明之一目的是提供一種用于改善皮膚外觀，包含挽救老化的效果的美容用組合物。本發明之另一目的是提供一種用于淡化皮膚皺紋的組合物，該組合物具有活性細胞物，較佳具有活性生物性細胞物。本發明之又一目的是提供一種用于改善外觀，特別是藉由淡化皮膚皺紋而改善其外觀之組合物，該組合物具有有效量的活性細胞物。本發明之再一目的是提供一種用于改善外觀，特別是藉由淡化皮膚皺紋而改善其外觀的組合物，該組合物適于局部施用于皮膚上。本發明之尚一步目的是提供一種淡化皮膚皺紋之方法，該方法包含將此等組合物施用于皮膚上。
整體而言，本發明亦提供含有有效量的一種本發明活性成分的局部施用組合物，該組合物用以施用于皮膚，而改善皮膚美觀。此等有益效果以下述事項的任一個證明減少毛孔大小；改善皮膚色調、光彩、透明度及/或緊繃度；促進抗氧化劑活性；改良皮膚堅實度、豐滿度、柔韌度、及/或柔軟度；改善前膠原蛋白及/或膠原蛋白產量；改善皮膚構造及/或促進再組構作用；改善皮膚障蔽修護及/或機能；改善皮膚輪廓外觀；恢復皮膚光澤及/或明亮度；補充因老化及/或更年期而衰減之皮膚基本營養素及/或成分；改善皮膚細胞間之傳訊作用；增加細胞增殖及/或復制作用；增加因老化及/或更年期而衰減之皮膚代謝作用；改善皮膚濕度；促進及/或加速細胞更新；增強皮膚厚度；降低皮膚敏感度；增加皮膚彈性及/或恢復力。本發明的詳細技術及較佳實施態樣，將描述于以下內容中，以供本領域技術人員據以明了本發明的特征。


第IA圖所示為；蘭嶼公豬全血細胞抹片。第IB圖所示為；蘭嶼公豬施打GCSF之后全血細胞抹片。第IC圖所示為；蘭嶼公豬全血液之白血球含量。第ID圖所示為；蘭嶼公豬施打GCSF后全血液的白血球含量。第IE圖所示為；蘭嶼公豬施打GCSF后，血液中之中間型細胞(MXD)較施打前增加6. 9 倍。第2A圖所示為；蘭嶼公豬全血細胞進行細胞特性(⑶34)分析，圈選區域(Pl)為中間型細胞。第2B圖所示為；蘭嶼公豬施打GCSF后全血細胞進行細胞特性(⑶34)分析，圈選區域(PD為中間型細胞。第2C圖所示為；為圖2A的分析結果，表示CD34干細胞占所有中間型細胞的20%。第2D圖所示為；為圖2B的分析結果，表示⑶34干細胞占所有中間型細胞的37%，顯示施打GCSF后能增加17%⑶34干細胞比例。第3圖所示為；干細胞施行方式示意圖。進針角度與表皮呈15度，進針深度為0. 3公分，施打部位為真皮層組織。第4A圖所示為；蘭嶼公豬施打GCSF后，中間型細胞以熒光染劑進行標定。左圖為可見光視野下的細胞型態，右圖為熒光顯微鏡下的細胞型態。弟4B圖所不為；圖4A之標定細胞以圖3的方式打入90月齡的蘭ill與母豬，一周后取下組織以熒光顯微鏡觀察(右圖)并比較組織型態(左圖)，顯示施打后一周，細胞聚集在毛囊并散布于真皮層。弟4C圖所不為；圖4A之標定細胞以圖3之方式打入90月齡的蘭ill與母豬，_■周后取下組織以熒光顯微鏡觀察(右圖)并比較組織型態(左圖)，顯示施打后二周，細胞聚集在毛囊及表皮層并散布于真皮層。第5A圖所示為；比較施打前后90月齡的蘭嶼母豬皮膚結構變化。施打前的皮膚(圖中)，表皮層皺折明顯，皮膚結構松散排列不均。施打后(圖右)，表皮層細致，皮膚堅實度與豐滿度獲得改善。5月齡的小豬皮膚(圖左)，作為年輕膚質對照組。第5B圖所示為；圖5A各皮層量化的結果。*#:p〈0. 001第6A圖所示為；免疫組織化學染色分析施打前后90月齡的蘭嶼母豬皮膚。利用特定抗原分析膠原蛋白(Collagen)、皮膚彈性(Elastin)、皮膚保水性(Polysaccharides)、消除疤痕(HA，⑶44)等能力。第6B圖所示為；圖6A的量化結果。顯示施打干細胞后的90月齡蘭嶼母豬皮膚，顯著改善a)膠原蛋白耗損；b)改善皮膚堅實度/豐滿度；c)改善皮膚保水性；d)減少/預防線紋及皺紋。
具體實施例方式現以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之范疇。[實施例I]如下文般進行實驗設計以拉丁方格設計(Latin square design)實驗法(Kirk, 1995),規劃實驗群組。以對抗平衡(counterbalancing)原理來進行處理實驗順序的問題(表一)。[實施例2]如下文般進行豬種圈養總共購置一只蘭嶼公豬(五個月齡)、三只蘭嶼母豬(年齡分別為六年、七年、九年)。每只豬皆附有血統登錄證明書與生產履歷，圈養的豬皆為個別飼養提供豬足夠的活動空間，區分飼料、休息、糞便三區，豬舍水泥地面上有高架式條狀地板，墻邊富有自動給水裝置。圈養棚內沒有尖銳的突出物，屬于非密閉式飼養空間，讓豬可看、聞、聽和接觸外界。全采用最少病原等級之試驗動物管理方式飼養，每日提供兩次限量飼料，每月廣2次輪替藥 品給予清潔消毒。[實施例3]如下文般進行周邊血液干細胞收集周邊血液干細胞是經由血液分離機取得。在分離前五天起，于耳靜脈注射一劑白血球生長激素(GCSF) 300 ii g/0. 7ml (Filgrastim M300)，直到最后收集日的前一天為止，將骨髓中的造血干細胞快速釋放于周邊血液中以便收集。采用頸靜脈抽血，緩慢搖晃與抗凝劑混勻，以1800g離心15分鐘后，以700g離心5分鐘，分離出富含白血球的白血球層細胞(buffy coat)。[實施例4]如下文般進行流式細胞儀分析采用頸靜脈抽血,取一管血液(BD Vacuta iner CPTTM Tube)緩慢搖晃與抗凝劑混合均勻，以1800g離心15分鐘后，以700g離心5分鐘后，以IOOg離心10分鐘三次，分離出富含白血球的白血球層細胞，以4°C IX PBS稀釋成I X 106個細胞后，取100 ill細胞液；加入2 u I anti-CD34Ab，放置4°C冰箱30分鐘；以4°C IX PBS清洗三次，每次以400g離心5分鐘;加入I ii I突光標記的二級抗體(AlexaFllior 546nm donkey anti-rabbitIgG, invitrogen)溶于 200 u I 3%BSA/PBS,存放于 4°C冰箱 30 分鐘；以 4°C IX PBS 清洗三次，每次以400g離心5分鐘；取出離心后的細胞存放于4°C冰箱并且要避光；上機(BDLSRTM II flow cytometer)分析血液內 CD 34 表現量。[實施例5]如下文般進行皮膚組織處理及切片取樣部位先用電動剃毛刀將皮膚毛發剃除，再以75%酒精消毒手術部位，輕輕用 解剖刀割取約I公分大小正方的皮膚組織，深度約8mm，可見脂肪層為主。將取樣后之樣品以10%福馬林(neutral buffered formal in; Surgipath)作為固定液浸泡組織，使組織的蛋白質凝固保持原始狀態，移至組織脫水機(Leica TP1020)進行脫水。首先將含有組織的包埋盒(casette)，放入組織脫水機中依序將組織作固定、脫水、清洗及浸潤(灌蠟)之處理，處理后組織中的水份將會被石蠟(paraffin)所取代。其處理之過程為10%福馬林I小時(固定)，二次水30分中(浸洗)，80%酒精I小時(脫水)，95%酒精I小時(脫水)，95%酒精I小時(脫水)，100%酒精I小時(脫水)，100%酒精I小時(脫水)，100%酒精2小時(脫水)，二甲苯(Xylene)I小時(清洗)，二甲苯2小時(清洗)，石蠟I小時(浸潤)，石蠟2小時(浸潤)。將脫水完成的組織進行石臘包埋(tissue block system TBS 88;Medite)成石臘塊(paraffin block)后，以手搖式石臘切片機(Shandon AS325; Leica, Germany)進行組織切片，每片厚度為3飛ym。[實施例6]如下文般進行皮膚組織染色 5. I 蘇木紫及伊紅染色(Hema toxylin-eosin Stain)核酸帶負電，與帶正電堿性染料(蘇木紫染液)的親和力較強，而細胞漿則相反，含有堿性物質因而與帶正電酸性染料(伊紅染液)的親和力較大。因此，細胞核被染成紫藍色，細胞漿、肌纖維、膠原纖維等染成不同程度的紅色，紅細胞則呈橙紅色。染色步驟如下將皮膚組織切片(5 y m/section)，放置55°C烤30分鐘，二甲苯脫蠟后以酒精使組織回水(rehydration)，以 hematoxylin solution (Sigma, MS-16)染色 2 分鐘，再以水流沖洗15分鐘。接著以eosin Y(Sigma, E4382)染色I分鐘，再以水流沖洗15分鐘。最后以酒精脫水后以封片膠封片。于抽風柜干燥一天后在顯微鏡下觀察結果并以CCD數位照相統(OLYMPUS, DP70)照相存盤。5. 2梅生三色染色/膠質纖維染色(Masson ' s trichrome Stain)組織化學染色的一種，主要用以區別膠原纖維。在酸性環境，對膠原纖維、肌肉纖維有選擇性染色。膠原纖維經酸處理后使Biobrich Scarlet由膠原滲出而被苯胺藍(aniline blue)染色,呈現藍色。染色步驟如下將皮膚組織切片(5 ii m/section),放55°C烤30分鐘,Xylene脫臘后以酒精使組織回水(rehydration),以媒染劑(Mordant)浸泡30分鐘，再以Carrazi ' s hematoxylin solution染色40分鐘。完成后以水流沖片沖洗10分鐘，0.75% Orange Gsolution染色 I 分鐘后，以 1%冰醋酸洗兩次,Masson B stain solution染色10分鐘，以1%冰醋酸洗兩次，2. 5%憐鑰酸-憐鶴酸(Phosphomolybdic-Phosphotungstic acid) 10分鐘，以1%冰醋酸洗兩次，以苯胺藍(anilinblue)染色15分鐘，浸泡1%冰醋酸兩次后以酒精脫水后以封片膠封片。于抽風柜干燥一天后以顯微鏡觀察并以CCD數位照相統(OLYMPUS，DP70)照相存盤。5. 3 彈性蛋白染色(Elastic Stain (Modified Verhoff' s))用于區別彈性蛋白之染色法，彈性蛋白呈現藍黑色。染色步驟如下將皮膚組織切片(3 y m/section)，放置55 °C烤30分鐘，Xylene脫蠟后以酒精使組織回水(rehydration),以活化的彈性蛋白染色溶液(working elastic stain solution)染色 15分鐘，流水沖洗后，以 2%Ferric Chloride Differentiating Solution 染色 20 秒,流水沖洗后，以 5%Sodium Thiosulfate Solution 染色 I 分鐘，流水沖洗后，以 Van Gieson ' sSolution染色3分鐘，以酒精脫水后以封片膠封片。于抽風柜干燥一天后以顯微鏡觀察并 以CXD數位照相統(OLYMPUS，DP70)照相存檔。5. 4 黏液素胭脂紅染色(Mucicarmine Stain (Modified Southgate’s))對黏液素(mucine)具專一性之染色法，黏液素由上皮細胞與結締組織細胞分泌。carmine (胭脂紅)與招染媒(氯化招)劑形成carmine-Al,與帶負電荷的硫酸基、羧基結合而呈紅色。染色步驟如下將皮膚組織切片(5 y m/section)，放置55°C烤片30分鐘，Xylene脫臘后以酒精使組織回水(rehydration),以二次水沖洗，以hematoxylin染色3分鐘，流水沖洗2分鐘，以Bluing Reagent染色30秒,浸泡二次水，以活化的Mucicarminesolution (33%Mucicarmine)染色I小時，快速以流水沖洗后浸泡于二次水，以Tartrazinesolution染色I分鐘,快速以流水沖洗后浸泡于二次水，以酒精脫水后以封片膠封片。于抽風柜干燥一天后在顯微鏡下觀察結果并以CCD數位照相統(OLYMPUS，DP70)照相存檔。5. 6 免疫組織化學染色(Immunhistochemistry, IHC)主要利用免疫組織突光染色(Immunofluorescence, IF)偵測組織中特殊抗原表現。染色步驟如下將皮膚組織切片(3 u m/section)，放置55°C烤片30分鐘，Xylene脫蠟后以酒精使組織回水(rehydration),以 antigen retrieval buffer 加熱 121°C 10 分鐘，以DAKO pen (厭水筆)將組織區域圈住，取3%雙氧水(H202)于IXPBS溶液中室溫下浸泡組織10分鐘，除去內生性還原酶的活性,清洗液rinse buffer (IX PBS+0. 3%TritonX-100)清洗一次，再以5%FBS于IX PBS中處理組織室溫30分鐘，阻斷抗體非專一性的鍵結，以清洗液 rinse buffer (IX PBS+0. 05%TritonX-100)清洗一次，加入適當稀釋(I: 100 1:200) —級抗體(hyaluronic acid、Q)44; Abeam),于室溫下作用2小時或4°C隔夜，以清洗液rinsebuffer (IX PBS+0. 05%TritonX-100)清洗3次；加入適當稀釋之二級抗體(1:5000)，于室溫下作用I小時，以清洗液rinse buffer (1XPBS+0. 05%TritonX-100)清洗3次；加入DAB呈色劑(3，3’-Diaminobenzidine) (LSAB2 Kit, DAK0, CA, USA)呈色 10 分鐘。陽性反應呈紅棕色，若未有顏色出現即為陰性(negative)結果，以hematoxyline染I分鐘做對比染色(counter stain),洗去過多之hematoxyline,再以自來水浸泡10分鐘，以酒精脫水后以封片膠封片。于抽風柜干燥后在顯微鏡下觀察結果并以CCD數位照相統(OLYMPUS，DP70)照相存檔。[實施例7]如下文般進行統計分析三只蘭嶼母豬中，每群組的實驗分析結果以平均值土標準差(mean土SD)之形式表示。常態分布之資料采用Student’s t-test分布實驗資料相異性的意義；非常態分布的資料采用Mann-Whitney U test分析實驗資料的相關性。統計結果之p值〈0. 05視為有統計上的意義。
上述實施例僅用以例示說明本發明的原理及功效，而非用于限制本發明。任何熟于此項技藝之人士均可在不違背本發明的技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明的權利保護范圍應如后述的申請專利范圍所列。
權利要求
1.一種用于改善皮膚美觀的組合物，其特征在于該組合物包括有效量之至少一種來源的⑶34干細胞所成的組群。
2.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該⑶34干細胞含量為約IO5至約109。
3.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該CD34干細胞含量為以該組合物總量計之約IO4至約IO80
4.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該CD34干細胞含量為以該組合物總量計之約IO3至約IO70
5.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該CD34干細胞含量為以該組合物總量計之約IO2或更少。
6.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該組合物為適于施用在皮膚的局部施用組合物。
7.根據權利要求I所述的組合物，其特征在于該組合物進一步包括美容上可接受的載具。
8.根據權利要求I所述的組合物，其中該組成物進一步包括至少一選自于包括膠原蛋白、玻尿酸以及其混合物。
9.一種淡化皮膚皺紋的方法，包括將有效量的根據權利要求8所述的組合物局部施用于皮膚。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于該至少一種活性萃取物含量為以該組合物總重量計的約0. 001重量％至約20重量％。
11.根據權利要求9所述的方法，其特征在于該至少一種活性萃取物含量為以該組合物總重量計的約0. 05重量％至約10重量％。
12.根據權利要求9所述的方法，其特征在于該至少一種活性萃取物含量為以該組合物總重量計的約0. 5重量％至約5重量％。
13.根據權利要求9所述的方法，其特征在于該有效量CD34干細胞含量為該組合物量之約IO5至約109，且有效治療下述之一者或多者之量a)減少/預防線紋及皺紋；b)增加皮膚新陳代謝 '及c)減少皮膚變色作用。
14.根據權利要求9所述的方法，其特征在于該有效量為該組合物重量的約0.001重量％至約20重量％，且有效治療下述的一個或多個的量a)減少或預防膠原蛋白耗損；b)改善皮膚堅實度/豐滿度；c)改善皮膚結構；d)減少/預防線紋及皺紋；e)改善皮膚色調； f)增加皮膚新陳代謝。
全文摘要
一種用于改善皮膚老化外觀的醫藥組合物，其包含一有效量的活細胞成分，該活細胞成分選自以下群組具表面抗原CD34的有核細胞，其醫藥上可來自骨髓、周邊血液。
文檔編號A61Q19/08GK102743412SQ20121020417
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者林欣榮, 林珀丞, 邱紫文, 韓鴻志 申請人:穎奕生醫科技股份有限公司