牙齒相關干細胞的新用途
【專利摘要】牙齒相關干細胞的新用途。提供了牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療牙齒相關疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病、與T淋巴細胞異常活化或升高相關的疾病、紅斑狼瘡或系統性紅斑狼瘡的產品，或者制備用于修復牙齒相關組織的產品中的新用途。還提供了包含牙齒相關干細胞的組合物以及使用牙齒相關干細胞預防或治療疾病的方法。
【專利說明】牙齒相關干細胞的新用途
[0001]本申請為申請號為201080005266.5、發明名稱為“牙齒相關干細胞的新用途”的發
明申請的分案申請。
發明領域
[0002]本發明涉及牙齒相關干細胞的新用途。具體地，本發明涉及牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的產品中的用途，或者在制備用于牙齒相關組織形成或修復的產品中的用途；還涉及牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡的產品中的用途；還涉及根據上述用途的治療方法；還涉及包含牙齒相關干細胞的組合物。
【背景技術】
[0003]干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的原始細胞，可分為胚胎干細胞和成體干細胞。在成體組織及器官中普遍存在著特異的成體干細胞，目前已經發現的例如來源于人的牙齒相關干細胞都是來源于中胚層的間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs),包括牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stem cellsfrom human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontal ligamentstem cells, PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla, SCAP)(1-4，即指文獻I至4，下同)，它們可以來源于多種動物(例如哺乳動物，例如人)。研究表明牙齒相關干細胞具有很高的增殖能力和多向分化潛能，能夠向成骨細胞、脂肪細胞、神經樣細胞分化。當把牙齒相關干細胞和三維支架材料的復合物植入到裸鼠皮下時，能夠產生自體牙髓牙本質復合體樣結構和牙骨質牙周膜復合體樣結構(1，3)。目前在自體小型豬模型上已經應用I3DLSCs和SCAP成功再生出生物牙根(4)。目前國際上干細胞研究焦點之一集中在建立各種組織成體干細胞庫，進行干細胞的臨床試驗研究。
[0004]根據WH0(2003)統計數字表明，牙齒相關疾病所波及的人群范圍已遠遠超過其它任何一種疾病。目前，全世界每年用于牙齒疾病的治療費用已超過200億美元。在牙齒相關疾病中，牙周病是一種全世界范圍內發病率很高的細菌感染性疾病，最終導致牙齒支持組織喪失和牙齒缺失，并能引起一系列的全身系統性疾病(13);而牙齒缺失可對人體消化系統和全身健康造成嚴重的影響，同時也會使患者產生不良的社會心理影響。但目前對牙周病及牙齒組織缺損沒有好的藥物或治療方法進行治療或修復；有關牙齒缺失的治療主要仍是采用人工材料制作牙齒的替代物。
[0005]系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是以多臟器受累和血中存在多種抗體為特征的自身免疫病，常規的免疫抑制或免疫調節治療可使多數患者的生存期延長，生活質量得到改善。1996年意大利學者Marmont首先報道用自體骨髓移植治療重癥紅斑狼瘡取得成功后，國內外迅速開展了自體外周血干細胞移植和自體骨髓移植治療重癥SLE等多種難治性免疫病，取得了較好的療效。造血干細胞移植能使部分患者達到病情控制，但其費用高、并發癥多，病情復發率高達40%-50%，不能被常規使用；并且，移植后雖然部分患者有可能達到長期緩解，但均不能徹底根治自身免疫性疾病，部分患者存在復發的問題。
[0006]因此，目前仍然需要可有效治療某些牙齒相關疾病和某些免疫性疾病的新穎方法。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供有效治療某些牙齒相關疾病和某些免疫性疾病的新穎方法。本發明人在研究中現出人意料地發現牙齒相關干細胞例如牙周膜干細胞(PDLSCs)不但在自體的牙齒中使缺損的牙齒組織再生，而且能在異體缺損的牙齒組織使牙齒組織再生，同時TOLSCs還對異常升高的T淋巴細胞有抑制作用。本發明基于上述研究結果得以完成。
[0008]發明概沭
[0009]本發明首先涉及TOLSCs在制備用于預防或治療牙周病，牙齒缺損修復的產品中用途。
[0010]本發明還涉及TOLSCs在制備用于預防或治療與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或癥狀的產品中用途。
[0011]本發明還涉及一種預防或治療牙周病，修復缺損牙齒組織的方法，其包括給予需預防或治療牙周病或需修復缺損牙齒組織的宿主以有效預防或治療量或修復缺損牙齒組織量的I3DLSCs。
[0012]本發明涉及一種預防或治療與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或癥狀的方法，其包括給予T淋巴細胞異常升高的宿主預防或治療有效量的roLSCs。
[0013]發明詳沭
[0014]更詳細地，本發明提供了以下的各個方面以及各個方面的具體項。
[0015]本發明第一方面提供了牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的產品中的用途，或者在制備用于牙齒相關組織形成或修復的產品中的用途。
[0016]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
[0017]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物。在一個實施方案中，所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0018]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，并且選自:牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0019]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的與牙齒相關的疾病或病情或者牙齒相關組織形成或修復選自:牙周病、牙周炎、牙齒缺損、牙齒組織缺損、牙齒缺損修復、牙齒相關組織缺損和修復、牙齒相關組織替代物再生、等等。
[0020]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞用于自體或者異體的牙齒相關的疾病或病情，或者用于自體或異體的牙齒相關組織形成或修復。
[0021]根據本發明第一方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關組織包括但不限于牙齒、牙根、牙髓、牙齦等等，以及其它與牙齒內部、牙齒表層、牙齒表面或者牙齒周圍相關的組織。
[0022]本發明第一方面及其各子項的特征和優點同樣適用于本發明其它任一方面及其各子項。
[0023]本發明第二方面提供了牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡的產品中的用途。
[0024]根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
[0025]根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物。在一個實施方案中，所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0026]根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，并且選自:牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0027]根據本發明第二方面任一項的用途，其中所述的牙齒相關干細胞用于自體或者異體的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡。
[0028]本發明第二方面及其各子項的特征和優點同樣適用于本發明其它任一方面及其各子項。
[0029]本發明第三方面提供了預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的方法，或者形成或修復牙齒相關組織的方法，該方法包括給有需要預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的宿主施用有效量的牙齒相關干細胞，或者該方法包括給有需要形成或修復牙齒相關組織的宿主施用有效量的牙齒相關干細胞。
[0030]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
[0031]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物。在一個實施方案中，所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0032]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，并且選自:牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0033]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的與牙齒相關的疾病或病情或者牙齒相關組織形成或修復選自:牙周病、牙周炎、牙齒缺損、牙齒組織缺損、牙齒缺損修復、牙齒相關組織缺損和修復、牙齒相關組織替代物再生、等等。
[0034]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞用于自體或者異體的牙齒相關的疾病或病情，或者用于自體或異體的牙齒相關組織形成或修復。
[0035]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關組織包括但不限于牙齒、牙根、牙髓、牙齦等等，以及其它與牙齒內部、牙齒表層、牙齒表面或者牙齒周圍相關的組織。
[0036]根據本發明第三方面任一項的方法，其中所述的宿主是哺乳動物。在一個實施方案中，所述的宿主是選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0037]在本發明第三方面任一項方法的一個實施方案中，其包括以下步驟:
[0038](a)采集人牙周膜；
[0039](b)培養 hPDLSCs ；
[0040](c)任選地冷凍保存M3DLSCs ；
[0041](d)任選地融化hPDLSCs，以及任選地對hTOLSCs檢查支原體、細菌、集落形成效率、間質干細胞標記模式和核型分析；
[0042](e)制備 hPDLSCs 片；
[0043](f)將HA/TCP置于容納有hPDLSCs片的器皿中；
.[0044](j)在任選的牙周初始治療后，將hTOLSCs片與HA/TCP植入到牙周損傷缺陷處；
[0045](k)任選的進行臨床和放射照相評價、血液學和免疫學評價。
[0046]本發明第三方面及其各子項的特征和優點同樣適用于本發明其它任一方面及其各子項。
[0047]本發明第四方面提供了預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡的方法，該方法包括給有此需要的宿主施用有效量的牙齒相關干細胞。
[0048]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
[0049]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物。在一個實施方案中，所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0050]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，并且選自:牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0051]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述的牙齒相關干細胞用于自體或者異體的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡。[0052]根據本發明第四方面任一項的方法，其中所述的宿主是哺乳動物。在一個實施方案中，所述的宿主是選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0053]本發明第四方面及其各子項的特征和優點同樣適用于本發明其它任一方面及其各子項。
[0054]本發明第五方面提供了一種組合物，其包含有效量的牙齒相關干細胞和任選的藥學可接受的載體。
[0055]根據本發明第五方面任一項的組合物，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
[0056]根據本發明第五方面任一項的組合物，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物。在一個實施方案中，所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0057]根據本發明第五方面任一項的組合物，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，并且選自:牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙牙髓干細胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干細胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳頭干細胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0058]根據本發明第五方面任一項的組合物，其是用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情，或者用于牙齒相關組織形成或修復，或者用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡。
[0059]根據本發明 第五方面任一項的組合物，其中所述的有效量是可以有效地用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的劑量，或者是要以有效地用于牙齒相關組織形成或修復的劑量，或者是要以有效地用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡的劑量。
[0060]本發明第五方面及其各子項的特征和優點同樣適用于本發明其它任一方面及其各子項。
[0061]根據本發明上下文的詳細記載，本發明令人滿意地實現上上述的各個方面及其各子項。
[0062]下面對本發明的各個方面和特點作進一步的描述。
[0063]本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。
[0064]本發明人在研究中現出人意料地發現TOLSCs等牙齒相關的干細胞不但在自體的牙齒中使缺損的牙齒組織再生，而且能在異體缺損的牙齒組織使牙齒組織再生。本發明基于上述研究結果得以完成。因此，本發明涉及牙齒相關干細胞例如roLSCs在制備用于預防或治療牙周病，牙齒缺損修復的產品中用途(例如圖8所示)；還涉及一種預防或治療牙周病，修復缺損牙齒組織的方法，其包括給予需預防或治療牙周病或需修復缺損牙齒組織的宿主以有效預防或治療量或修復缺損牙齒組織量的牙齒相關干細胞例如roLSCs。
[0065]此外，本發明提出生物牙根再生的新理念；利用自體異體SCAP/DPSCs和TOLSCs再生出了具有生物學功能的生物牙根，在新形成的功能性生物牙根上再進行冠的修復，恢復患者的咀嚼功能(例如圖10所示)；提供生物牙根再生的具體實施方法，為進一步對生物牙根再生的機理進行深入研究及生物牙根的商品化提供依據。因此，本發明涉及生物牙根再生的新理念，并涉及SCAP，DPSCs, PDLSCs等牙齒相關的干細胞在生物牙根再生中的用途。本發明還涉及生物牙根再生的具體實施辦法，其中包括牙周膜干細胞膜片的制備及其所需最佳細胞數及最佳生長時間。
[0066]再者，本發明涉及牙齒相關干細胞例如TOLSCs在制備用于預防或治療與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或癥狀的產品中用途。本發明還涉及一種預防或治療與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或癥狀的方法，其包括給予T淋巴細胞異常升高的宿主預防或治療有效量的牙齒相關干細胞例如roLSCs。本發明進一步涉及牙齒相關干細胞例如SHED在預防或治療系統性紅斑狼瘡病等自身免疫系統病中用途(例如圖11所示)。
[0067]根據本發明，術語“牙周病”包括但不限于牙周炎。
[0068]根據本發明，術語“缺損牙齒組織”包括但不限于宿主牙齒的各種缺損情況，如各種原因引起的牙齒脫落。
[0069]根據本發明，術語“宿主”通常指哺乳動物，包括但不限于人，豬，牛，馬等。在一個實施方案中，術語“宿主”是指人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
[0070]根據本發明，術語“產品”是指適于roLSCs應用的各種形式。根據本發明，術語“產品”還指適于牙齒相關干細胞 應用的各種形式，例如組合物、藥物組合物等。
[0071]根據本發明，術語“與牙齒相關的疾病或病情”是指本文所述宿主罹患或者表現的疾病、病情、體癥、身體狀態等，這些疾病、病情、體癥、身體狀態等與牙齒相關。
[0072]根據本發明，術語“牙齒相關組織形成或修復”或者術語“牙齒相關組織的形成或修復”或者“形成或修復牙齒相關組織”等，它們具有相同或近似的含義，并且通常是指本文所述宿主的牙齒相關組織進行形成、修復、生成、再生、培養等處理或操作，或者對牙齒相關組織異常(例如缺損)進行形成、修復、生成、再生、培養等處理或操作。
[0073]根據本發明，術語“組合物”是具有本領域技術人員通常理解的含義，并且通常是指可接或間接(例如臨用前稀釋)用于臨床使用的形式，例如劑型、藥物劑型、給藥形式、等。在臨床應用領域或者藥物領域，術語“組合物”還通常與“藥物組合物”具有同等含義。
[0074]可改變本發明組合物或藥物組合物中牙齒相關干細胞的實際劑量水平，以便所得的干細胞量能有效針對具體宿主、患者在特定組合物及其組成以及相應給藥方式的情況下得到所需的治療或預防反應。劑量水平須根據具體干細胞的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴重程度、疾病或病情的治療進程、形成和修復(以及生成、再生、培養等)處理或操作的進程、以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領域的做法是，干細胞的劑量以及施用時間從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。因此，就本發明而言，本領域技術人員在本發明詳細公開的信息的教導下，可以根據例如但不限于上述的具體情況來確定在具體情況下所適用的具體劑量，而無需要作具體限定。特別是，可以參考本發明實施例部分中所用的具體量來確定任一情況下的使用量，例如在本發明下文使用了具體劑量的五指山小型豬roLSCs，本領域技術人員可根據上述劑量并結合本領域公知技術教導將該劑量換算為人用條件下的劑量。
[0075]本發明牙齒相關干細胞可以單獨(即以原樣形式)或以藥物組合物的形式給藥。本發明藥物組合物可根據給藥途徑配成各種適宜的劑型。使用一種或多種生理學上可接受的載體，包含賦形劑和助劑，它們有利于將牙齒相關干細胞加工成可以在藥學上使用的制劑。適當的制劑形式取決于所選擇的給藥途徑，可以按照本領域熟知的常識進行制造。在本發明的一個實施方案中，所述牙齒相關干細胞存在于細胞相容的介質(例如，生理鹽水如0.9%生理鹽水，等等)中。在本發明的一個實施方案中，所述牙齒相關干細胞存在于細胞相容的介質中，并且在低溫下保存，例如在冷藏、冷凍等條件下保存，并且可任選在在臨用前復溶成適用根據本發明精神而施用的形式。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0076]圖1.人TOLSCs免疫分子的表達:應用流式細胞術檢測fPDLSCs和cPDLSCs相關免疫分子的表達。HLA-1，HLA-ΠDR,⑶80和⑶86的表達情況如圖所示:fPDLSCs (76.2%±5.8%, η=5)和 cPDLSCs (78.5%±6.4%, η=5)表達 HLA-1,但是不表達HLA-Π DR和共刺激分子⑶80、⑶86。
[0077]圖2.PDLSCs抑制T淋巴細胞增殖:(a) fPDLSCs/cPDLSC不會引起同種異體T淋巴細胞增殖。(b) fPDLSCs/cPDLSC劑量依賴性地抑制絲裂原PHA引起的T淋巴細胞增殖。(c)延遲加入fPDLSCs/cPDLSC也能夠抑制PHA引起的T淋巴細胞增殖。(d) fPDLSCs/cPDLSC能夠抑制雙向混合淋巴細胞反應。
[0078]圖3.PDLSCs通過分泌PGE2抑制T淋巴細胞增殖:(a)在Transwell培養實驗中，PDLSCs也能抑制T淋巴細胞增殖.，提示I3DLSCs分泌可溶性因子來發揮免疫抑制作用。(b)在單純roLSCs培養上清和MLR上清中都存在TGF- β 1，但是兩者之間沒有顯著性差異。(c)PGE2的濃度在MLR中顯著性升高。(d)中和實驗表明抗TGF- β I抗體沒有恢復T淋巴細胞增殖，PGE2抑制劑抵消了 I3DLSCs的免疫抑制作用，提示PGE2是介導TOLSCs免疫抑制作用的主要因子。(e，f)roLSCs的免疫抑制作用并沒有引起T淋巴細胞的凋亡(e)，與單純用PHA刺激T淋巴細胞后的凋亡率一致(f)。(g) I3DLSCs引起的被抑制的T淋巴細胞用PHA或者IL-2再刺激時可以重新恢復增殖。
[0079]圖4.HGF和IL-10的測定:在單純TOLSCs培養上清和MLR上清中都沒有測到HGF和IL-10，說明這兩種因子沒有參與roLSCs介導的免疫抑制作用。
[0080]圖5.PDLSCs介導的牙周組織再生:(a)在_4w和Ow,四組的臨床指標之間沒有顯著性的差異。但是治療后12周，自體或者同種異體roLSCs移植組的ro，GR和AL與空白對照組和HA/TCP相比顯著恢復。(b，c, d, e)CT掃描顯示治療前都有明顯的牙周骨缺損，而且缺損程度相近。治療后12周，自體roLSCs組(h)和同種異體roLSCs組(i)完全獲得了牙周骨再生?？瞻讓φ战M幾乎沒有骨組織再生(f)，而HA/TCP組的骨缺損程度加重(g).(j，k，l，m)組織學研究發現自體或者同種異體roLSCs組在骨缺損區有明顯的新骨和牙周組織再生。但是，典型的牙周炎表現如深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纖維在HA/TCP組和空白對照組仍然清晰可見。PD:探診深度，GR:牙齦退縮，AL:附著喪失，D:牙本質，C:牙骨質，PDL:牙周膜，B:骨。
[0081]圖6.同種異體TOLSCs移植不會引起免疫排斥反應:(a)在如圖所示的各個時間點，同種異體roLSCs移植組的⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴細胞沒有顯著性差異；(b)在移植后3天，⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴細胞數目以及活化T淋巴細胞的標志物——⑶40L的表達情況在四個治療組之間沒有明顯差異。
[0082]圖7.移植后12w的免疫狀況:在治療后12w，⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴細胞數目以及活化T淋巴細胞的標志物一⑶40L的表達情況在四個治療組之間也沒有明顯差異。
[0083]圖8.描繪了本發明的一個實施例中I3DLSCs介導的牙周組織再生。
[0084]圖9.描繪了在小型豬上成功再生生物牙根。
[0085]圖10.描繪了在小型豬上進行生物牙根再生獲得成功。
[0086]圖11.描繪了脫落乳牙牙髓干細胞治療系統性紅斑狼瘡鼠血清及腎臟組織學改變。
[0087]圖12.說明同種異體人牙周膜干細胞(hPDLSCs)用于治療牙周病的標準操作的一個實例。
【具體實施方式】
[0088]通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾`。
[0089]本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。
[0090]實施例1:PDLSCs對T淋巴細朐增葙的抑制作用
[0091]材料和方法
[0092]I)、人 PDLSCs
[0093]選取首都醫科大學附屬北京口腔醫院口腔頜面外科門診拔除的18-28歲的健康患者的正常第三磨牙，按照以往文獻報道的方法分離和培養roLSCs (3)。人體組織的利用得到首都醫科大學倫理委員會的批準。為了下一步實驗中應用凍存牙周膜干細胞(cryopreserved periodontal ligament stem cells, cFOLSCs),將部分新鮮分離的牙周膜干細胞(freshly isolated periodontal ligament stem cells, fPDLSCs)凍存在液氮中3個月。3個月后，凍存細胞在37°C水浴中快速解凍、接種、常規培養。在本研究中，應用的細胞都在第2-4代。在同一實驗中，應用同一代的fPDLSCs和cPDLSCs。
[0094]2)、外周血單個核細朐
[0095]應用梯度密度離心法分離健康供者的外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMCs)。
[0096]3)、杭體
[0097]本研究中應用抗人白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)_1、HLA-ΠDR, CD80、CD86 抗體(BD Biosciences)，抗 CD3、CD4、CD8、CD40L、轉化生長因子β (transforming growth factor β , TGF- β )、肝細胞生長因子(hepatocyte growthfactor, HGF)抗體(Abeam),抗.1L-10、FITC 標記的抗.小鼠 IgG 抗.體(AbD Serotec)。
[0098]4)、流式細朐術
[0099]為了研究TOLSCs表面相關免疫分子的表達，將1.0X 106fPDLSCs或者cPDLSCs分別與抗HLA-1、HLA-ΠDR,⑶80或者⑶86抗體室溫下孵育I小時。經過磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗后，細胞再與FITC標記的抗小鼠IgG 二抗室溫下孵育30分鐘。孵育結束后上流式細胞儀(BD Inmmunocytometry Systems)檢測表達情況。
[0100]5)、混合淋巴細朐反應
[0101]作為刺激細胞，5.0X 104fPDLSCs或者cTOLSCs先在直線加速器下照射20Gy，然后加入等細胞量的同種異體PBMCs，在96孔板、0.2mlRPM1-1640中共同孵育5天。在結束反應前18個小時，每孔加入I μ Ci的3H-thymidine (3H-TdR)。18個小時后，在玻璃纖維濾紙上收集細胞，應用液體閃爍儀(PerkinElmer)計算3H-TdR摻入率。3H-TdR摻入率的結果以每分鐘計數土標準差(CPM 土 SD)來表示。
[0102]為了研究I3DLSCs對增殖T淋巴細胞的影響以及此種影響是否具有劑量依賴性，在絲裂原促增殖實驗中，以終濃度為0.5 μ g/mL的PHA (Sigma-Aldrich)刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖，與不同劑量的自體fPDLSCs或者cPDLSCs共孵育5天(PDLSCs的量分別為1.0X IO4, 5.0XlO4, 2.5 X IO5, 5.0XlO5)。結束孵育前18小時每孔加入I μ Ci的3H-TdR, 18小時后收集細胞并且計算3H-TdR摻入率。
[0103]進一步研究延遲加入roLSCs是否會影響T淋巴細胞增殖。先用終濃度為0.5 μ g/mL的PHA刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖2天，然后加入同等劑量的fPDLSCs或者cPDLSCs再共同孵育3天。3天后測定3H-TdR摻入率。
[0104]在證實roLSCs能夠抑制絲裂原PHA引起的T淋巴細胞增殖后，我們觀察I3DLSCs對雙向混合淋巴細胞反應(mi xed lymphocyte reaction,MLR)的影響。來自兩個不同個體的PBMCs (5.0X IO4)與等量的第三方fPDLSCs或者cTOLSCs共同孵育5天。結束孵育前18小時每孔加入I μ Ci的3H-TdR,孵育結束后收集細胞、計算3H-TdR摻入率。
[0105]6)、與PDLSCs共孵育后的T淋巴細胞的再次刺激
[0106]為了觀察TOLSCs對T淋巴細胞的增殖抑制是否可逆，我們進行了再激活實驗。PBMCs (5.0XlO4)先與等量的PDLSCs和PHA (0.5 μ g/mL)共同孵育5天，然后把通過梯度密度離心法獲得的T淋巴細胞與PHA(OjygAiL)或者重組人白介素2(interleukin2, IL-2, 50U/mL;R&D systems)共同反應 2 天。2 天后，應用 3H-TdR 摻入法測定T淋巴細胞增殖率。
[0107]7)、Transwell 培養實驗
[0108]為了觀察通過細胞-細胞直接接觸還是I3DLSCs分泌可溶性因子來介導TOLSCs對T淋巴細胞的增殖抑制,我們進行了 Transwell培養實驗。Transwell培養系統(Costar)具有直徑為0.4 μ m孔徑的微膜，此微膜可以把兩種細胞人為地分隔開來。將PBMCs (5.0X IO4)與PHA (0.5 μ g/mL)置于Transwell培養系統的上腔，而5.0 X IO4PDLSCs (從本實驗開始，本研究的以下部分都用fPDLSCs)接種在下腔。5天后，應用3H-TdR摻入法測定T淋巴細胞增殖率。
[0109]8)、可溶件因子的測定及中和實驗[0110]當發現可溶性因子介導roLSCs對T淋巴細胞的增殖抑制后，我們應用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immumosorbent assay, ELISA)來測定單純 F1DLSCs 的培養上清(接種1-5天)和MLR培養上清(5.0 X IO4PDLSCs,等量PBMCs和0.5 μ g/mL的PHA)中 TGF_i3 1(R&D systems), HGF (R&D systems),前列腺素 E2 (prostaglandin E2,PGE2;Assay Designs)和 IL_10(R&D systems)的濃度。通過酶標儀(Molecules Devices)在 45Onm(TGF-0 I, HGF 和 IL-10)或者 405nm(PGE2)讀取光密度值。
[0111]然后進彳丁中和實驗，在Transwell培養系統中建立MLR的反應體系，包括PBMCs (5.0 X IO4)，PDLSCs (5.0 X IO4)和PHA (0.5 μ g/mL)，在反應的同時分別加入以下抗體或者試劑:抗TGF-β抗體(10ng/mL)，抗HGF抗體(10ng/mL)和抗IL-10抗體(10ng/mL)或者PGE2的抑制劑吲哚美辛(5 μ mol/L; Sigma-Aldrich)。5天后，通過3H-TdR摻入法測定T淋巴細胞增殖率。
[0112]9)、測定凋亡T淋巴細胞的百分率
[0113]建立MLR 的反應體系，包括 PBMCs (5.0 X IO4) ,PDLSCs (5.0XlO4)和 PHA (0.5 μ g/mL), 5天后應用Annexin V-Fluos凋亡試劑盒(Roche Diagnostics)來測定凋亡T淋巴細胞的百分率。
[0114]實施例2 =PDLSCs介導的牙周骨缺損修復
[0115]I)、材料和方法
[0116]五指山小型豬和貴州香豬￠-8月齡，體重30-40千克)由中國農業大學實驗動物中心提供。本實驗通過首都醫科大學倫理委員會批準。小型豬尖牙roLSCs的分離和培養方法同人roLSCs。按照文獻報道的方法(13)，制備12只雌性五指山小型豬的牙周炎骨缺損模型，總共制備24處下頜第一恒磨牙的牙周炎骨缺損。24處缺損隨機分為以下4個組:【I】空白對照組，不做任何治療；.【2】單純材料組，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料(武漢理工大學提供)、明膠海綿覆蓋缺損、縫合；【3】自體TOLSCs移植組，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0 X IO7五指山小型豬TOLSCs、明膠海綿覆蓋缺損、縫合；【4】異體TOLSCs移植組，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0X IO7香豬PDLSCs、明膠海綿覆蓋缺損、縫合。在制備牙周炎骨缺損模型前(_4w)、移植治療前(Ow)和治療后12w進行臨床檢查,包括探診深度(probing depth,PD)、牙銀退縮(gingival recession,GR)和附著喪失(attachment loss,AL)。在Ow和治療后12w應用CT(Siemens)觀察骨再生的情況。在_4w、治療后l-7d、2w、4w,8w和12w進行血常規檢查、血生化檢查、免疫球蛋白檢查和T淋巴細胞相關標志物的檢查，包括⑶3+細胞計數、⑶4+細胞計數、⑶8+細胞計數以及活化T淋巴細胞的標志物——⑶40L的表達情況。在治療后12w，處死動物，從實驗部位獲取標本，固定、脫鈣、石蠟包埋，行HE染色，觀察組織再生情況。
[0117]通過Student ’ t檢驗和方差分析進行統計學分析，p<0.05認為是有統計學差異。
[0118]2)、結果和說明
[0119]2-1)、PDLSCs具有低免疫原性
[0120]首先觀察到人roLSCs的免疫表型，發現fPDLSCs (76.2%±5.8%, n=5)和cPDLSCs (78.5%±6.4%, n=5)表達 HLA-1，但是不表達 HLA-Π DR 和共刺激分子 CD80、⑶86 (圖1)，與體外培養擴增的BMSCs表達狀況相似(23)。
[0121]進一步研究roLSCs作為抗原提呈細胞對T淋巴細胞增殖的影響。實驗組為預先經過直線加速器20Gy照射的5.0X IO4PDLSCs與等量的同種異體PBMCs共孵育。作為陽性對照的T淋巴細胞增殖組為:5.0X IO4PBMCs與與等量的同種異體PBMCs共孵育。單獨培養等量的PBMCs為陰性對照。結果表明，實驗組I3DLSCs沒有引起同種異體PBMCs增殖，而陽性對照組可以引起顯著的
[0122]T淋巴細胞增殖(圖2a)，提示TOLSCs具有低免疫原性。
[0123]2-2)、PDLSCs能夠抑制T淋巴細朐增葙
[0124]進一步觀察TOLSCs對絲裂原和同種異體抗原引起的T淋巴細胞增殖的影響。將fPDLSCs 和 cPDLSCs 接種，細胞量分別為:1.0XlO4, 5.0XlO4, 2.5 X IO5 和 5.0X 105，然后加入自體 PBMCs (5.0 X IO4)和終濃度為 0.5 μ g/mL 的 PHA0 PHA 刺激 PBMCs (5.0 X IO4)增殖為陽性對照。結果發現，PHA刺激的PBMCs增殖明顯地被fPDLSCs或者cTOLSCs所抑制，而且這種抑制是劑量依賴性的。此種免疫抑制作用必須要求TOLSCs的存在，而不是由體積效應(bulk effect)引起，因為在增殖反應體系中加入等量的自體PBMCs不會引起抑制作用(圖2b)。此外，即使在PHA刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖后兩天再加入I3DLSCs,仍然能夠明顯抑制T淋巴細胞的增殖(圖2c)。我們進一步觀察I3DLSCs對MLR的影響。來自兩個不同個體的PBMCs和第三方的I3DLSCs共同孵育。結果表明，fPDLSCs和cTOLSCs都能夠抑制雙向MLR (圖2d)。本部分實驗數據表明，PDLSCs能夠劑量依賴性地和抗原非特異性地抑制同種異體T細胞受體引起的和絲裂原引起的T淋巴細胞增殖。
[0125]2-3)、PDLSCs通討分泌PGE2抑制T淋巴細朐增葙
[0126]我們進一步研究TOLSCs抑制T淋巴細胞增殖的機制問題。為了闡明是否通過PDLSCs和PBMCs細胞-細胞直接接觸引起，我們首先進行了 Transwe 11培養實驗，將TOLSCs和PBMCs人為地分隔開來。研究結果表明，無論是Transwell培養實驗還是細胞-細胞直接接觸實驗，都能夠取得相近的T淋巴細胞增殖抑制效果，提示這種免疫抑制作用與細胞-細胞直接接觸無關，而是依靠可溶性因子的存在(圖3a)。
[0127]通過ELISA，我們測定單純TOLSCs培養上清中和MLR上清中幾種可能性的可溶性因子。無論I3DLSCs培養上清還是MLR上清，都沒有發現HGF和IL-10 (圖4)。然后我們繼續觀察TGF-β I和PGE2，因為這兩者被認為是BMSCs發揮免疫調節功能的主要因子(7，25)。如圖3b和圖3c所示，在接種后l-5d的PDLSCs培養上清中，TGF-β I和PGE2的濃度相對穩定，沒有明顯的波動。但是，在MLR上清中，PGE2的濃度達15.19±1.26ng/ml，與單純PDLSCs培養的濃度相比明顯升高，TGF-β I的濃度為1459.79±109.49pg/mL，沒有明顯變化。
[0128]我們通過在MLR體系中添加特異性的抗TGF- β，IL-10, HGF抗體和PGE2抑制劑來觀察其恢復τ淋巴細胞增殖的能力，進一步確定roLSCs抑制τ淋巴細胞增殖的主要因子。結果發現，加入PGE2抑制劑能夠顯著恢復T淋巴細胞的增殖，而且此時的增殖力同單純用PHA刺激PBMCs的增殖力相近(圖3d)。而實驗體系中加入抗TGF- β，IL-10, HGF的中和抗體并沒有恢復T淋巴細胞的增殖(圖3d)。這些數據表明PGE2是介導TOLSCs抑制T淋巴細胞增殖的主要因子。
[0129]就BMSCs的免疫抑制機制而言，雖然目前尚不清楚哪一種因子發揮主導性的作用以及某些研究還存在不一致，但是大多數的研究認識還是通過BMSCs分泌抗增殖的可溶性因子比如IL-10，HGF, TGF- β I, PGE2,吲哚胺-2，3- 二氧化酶和一氧化氮(5，6，17，19，20，24-28)引起。Beyth等(28)報道IL-10是BMSCs免疫抑制作用的主要介導因子。DiNicola等(7)通過抗體中和實驗發現TGF-β I和HGF是發揮作用的主要因素。另有研究表明PGE2的抑制劑能夠抵消BMSCs的免疫抑制作用(25)。這些研究都表明了可溶性因子參與了 BMSCs的免疫抑制作用。我們的研究提示PGE2是TOLSCs抑制T淋巴細胞增殖的主要因子。
[0130]2-4)、PDLSCs的免疫抑制作用與T細胞凋亡無關，而是誘導T細胞無能
[0131]進一步研究TOLSCs的免疫抑制作用是否引起了 T淋巴細胞的凋亡?，F發現，在PDLSCs、PBMCs和PHA的反應體系中，凋亡的T淋巴細胞比例與單純PBMC、PHA反應體系相似，排除了 T淋巴細胞凋亡是引起免疫抑制的可能性(圖3e，f)。然后，把被I3DLSCs抑制了 5天的T淋巴細胞提取，用PHA或者IL-2再刺激兩天。結果發現，已經被抑制了的T淋巴細胞再次明顯增殖，這種增殖程度與單純PHA刺激PBMCs的程度相近似(圖3g)。因此，可以認為I3DLSCs的T淋巴細胞增殖抑制是可逆的，通過誘導T淋巴細胞無能引起。
[0132]2-5)、PDLSCs介導的牙周纟目織再牛
[0133]鑒于roLSCs的免疫調節特性，研究同種異體I3DLSCs能否修復小型豬牙周炎骨缺損模型。在移植后12周，同種異體移植roLSCs組的ro為3.5±0.6mm,自體移植組的H)為3.3±0.4mm，HA/TCP組為13.1±1.1mm,空白對照組為10.6±1.3_。統計學分析表明自體或者同種異體I3DLSCs移植組與HA/TCP組和空白對照組相比牙周組織得到了明顯再生，而自體或者同種異體roLSCs組之間并沒有顯著差異(圖5a)。CT掃描顯示自體和同種異體PDLSCs組的牙槽骨明顯再生，基本恢復到了正常水平，而HA/TCP組和空白對照組僅僅少量再生或者沒有再生(圖5a-h)。組織學觀察表明，在自體和同種異體TOLSCs組，明顯再生出新骨、牙骨質和牙周纖維，在HA/TCP組和空白對照組，仍可見明顯的牙周炎表現，包括深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纖維(圖5j-m)。此外，與移植治療前4w相比，治療后各時間點的血常規檢查(表I)、血生化檢查(表2)、免疫球蛋白檢查(表3)和免疫學相關指標(圖6，圖7)都沒有明顯變化，表明 同種異體移植TOLSCs修復牙周炎骨缺損沒有排斥反應的發生。
[0134]表I
[0135]
【權利要求】
1.牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情的產品中的用途，或者在制備用于牙齒相關組織形成或修復的產品中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
3.根據權利要求1或2的用途，其中所述的牙齒相關干細胞來自哺乳動物，例如所述的牙齒相關干細胞來自選自以下的哺乳動物:人、豬(例如五指山小型豬、貴州香豬)、牛、馬、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、綿羊、山羊。
4.根據權利要求1至3任一項的用途，其中所述的與牙齒相關的疾病或病情或者牙齒相關組織形成或修復選自:牙周病、牙周炎、牙齒缺損、牙齒組織缺損、牙齒缺損修復、牙齒相關組織缺損和修復、牙齒相關組織替代物再生、等等。
5.牙齒相關干細胞在制備用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡的產品中的用途。
6.根據權利要求5的用途，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
7.一種組合物，其包含有效量的牙齒相關干細胞和任選的藥學可接受的載體。
8.根據權利要求7的組合物，其中所述的牙齒相關干細胞選自:牙髓干細胞、脫落乳牙牙髓干細胞、牙周膜干細胞、和根尖牙乳頭干細胞。
9.根據權利要求7或8的組合物，其是用于預防或治療與牙齒相關的疾病或病情，或者用于牙齒相關組織形成或修復，或者用于預防或治療免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、與T淋巴細胞異?；罨嘘P`的疾病或病情、與T淋巴細胞異常升高有關的疾病或病情、紅斑狼瘡、或者系統性紅斑狼瘡。
【文檔編號】A61K35/32GK103432007SQ201310273342
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2010年1月22日 優先權日:2009年1月23日
【發明者】王松靈, 施松濤, 丁剛 申請人:首都醫科大學