一種脂質體-聚合物雜化納米粒子及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種脂質體-聚合物雜化納米粒子及其制備方法和應用。所述脂質體-聚合物雜化納米粒子包括兩親性聚合物納米粒子和包覆于所述兩親性聚合物納米粒子表面的磷脂雙分子層，以及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子內部及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子與磷脂雙分子層之間的水溶性不同的藥物。本發明的納米粒子具有多層結構，包埋水溶性不同的藥物，實現不同藥物的協同作用，生物相容性高，血液中的循環時間長，具有靶向和緩控釋作用，提高藥物的療效，降低藥物的毒副反應，可用于作抗腫瘤藥物的載體系統。本發明的制備方法工藝簡單，操作過程方便，可實驗室小規模生產，也可工業化大規模生產。
【專利說明】一種脂質體-聚合物雜化納米粒子及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及制藥【技術領域】，尤其涉及由水溶性不同的藥物和兩親性聚合物以及脂質體組裝形成脂質體-聚合物雜化納米粒子的制備方法及制得的納米粒子，及其在抗腫瘤藥物制備中的應用。
【背景技術】
[0002]21世紀的今天雖然醫學技術高速發展，癌癥仍然是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。盡管過去幾十年中，隨著醫療水平的提高癌癥患者的生存幾率有所提高，但是相對于其他疾病(例如心血管疾病)死亡率的下降速度，癌癥的死亡率仍舊很高。近20年來，中國每4-5個死亡者中就有一個死于癌癥，居死亡原因之首。最新統計資料顯示，中國每年癌癥新發病例為220萬人，因癌癥死亡的人數為160萬人，現有病歷310萬。癌癥每年給中國造成的經濟損失逾千億元。癌癥難以治療的主要原因之一是腫瘤細胞具有強大的自我調節機制，能快速通過調節自身的代謝通路而產生補償機制而對各種治療藥物產生抗藥性，降低藥物對細胞的殺傷力。相對而言，正常細胞，特別是癌癥病人的正常細胞，即使經過很長時間的藥物治療，仍然對抗癌藥物極其敏感。藥物的聯合作用是一種非常具有潛力的用來治療一些通過補償機制而具有抗藥性疾病的治療方法。所以越來越多的研究者嘗試利用不同藥物組合來治療癌癥，但是簡單地對患者直接給予藥物混合治療存在很多問題，例如難以分析兩種或多種藥物的藥物代謝動力學，另外多種藥物在體內的分布一致性也難以確定，同時也無法保證兩種藥物能同時作用于相同腫瘤細胞。
[0003]納米載藥體系(Nanoparticle Drug Delivery System)是指藥物與納米載體形成的粒徑介于1-1OOOnm的藥物輸送系統,包括納米球、納米囊、納米粒子和納米脂質體等。納米載藥體系與其它藥物載體相比，表現出明顯的優勢:1)改善藥物水溶性，提高藥物的透膜能力和生物利用度。2)提高藥物的穩定性，實現可控釋，延長藥物在體內的半衰期。3)引入具有不同刺激(例如pH、溫度和酶等)敏感的生物材料，實現藥物在腫瘤部位的可控釋放，減輕藥物的副作用。4)實現藥物在腫瘤部位的富集，由于腫瘤部位新生血管的不完整性，以及缺乏淋巴管的清除作用，導致納米載體具有被動腫瘤靶向效應，即EPR(EnhancedPermeability and Retention)效應。另外,通過在納米載體表面修飾各種主動祀向配體，如葉酸、RGD多肽等,可以實現納米粒子對腫瘤部位的的主動祀向。此外，設計特殊的納米載體，可以使納米藥物穿越血腦屏障、血睪屏障、胎盤屏障等天然生物屏障，解決治療中存在的瓶頸難題。這種特性可以使得納米粒子在進入正常組織之前優先進入到腫瘤組織當中。所以藥物可以在腫瘤組織區域達到比較高的濃度從而減少一些藥物的副作用。主動靶向方式主要通過在納米粒子上連接靶向性的配體或抗體，這樣可以使得藥物選擇性的被運輸到腫瘤組織。常用的載藥體系主要包括以下幾種:多聚化合物、樹枝狀化合物、脂質體、膠束和一些無機納米顆粒。聚合物具有很好的力學穩定性，藥物包載能力強，但是生物相容性較差。而磷脂制備的脂質體具有很好的生物相容性，尤其是具有適量PEG修飾的脂質體，能夠逃逸免疫追捕，延長在體內的循環時間，但是脂質體由于力學性質不穩定，容易造成藥物的突然釋放，近來一些科學家逐步將脂質體和聚合物兩種納米粒子結合在一起，用磷脂雙分子層對聚合物納米粒子進行包載，制備出聚合物雜化納米載藥體系。
[0004]利用脂質體-聚合物雜化納米材料運輸多種藥物正在逐漸成為熱點。發明人發明和設計了一種利用兩親性聚合物同時包載水溶性不同的藥物的方法，本方法簡單實用，要求條件低，可以用于大規模工業化生產。

【發明內容】

[0005]針對現有技術的不足，本發明提供一種脂質體-聚合物雜化納米粒子及其制備方法和應用，本發明的納米粒子具有多層結構，包埋水溶性不同的藥物，實現不同藥物的協同作用，生物相容性高，血液中的循環時間長，具有靶向和緩控釋作用，提高藥物的療效，降低藥物的毒副反應。本發明的制備方法工藝簡單，操作過程方便，可實驗室小規模生產，也可工業化大規模生產。
[0006]在第一方面，本發明提供一種脂質體-聚合物雜化納米粒子，包括兩親性聚合物納米粒子和包覆于所述兩親性聚合物納米粒子表面的磷脂雙分子層，以及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子內部及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子與磷脂雙分子層之間的水溶性不同的藥物。 [0007]在第二方面，本發明提供一種制備第一方面所述的脂質體-聚合物雜化納米粒子的方法，包括如下步驟:
[0008](I)將兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液混合，超聲處理形成第一乳液；
[0009](2)將含有表面活性劑的水溶液與所述第一乳液混合，在攪拌下加入疏水性藥物的有機溶液，并攪拌均勻，然后超聲處理形成第二乳液；
[0010](3)在攪拌下將所述第二乳液加入含有表面活性劑的水溶液，并攪拌均勻，然后蒸去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0011](4)將所述聚合物納米粒子懸液和親水性藥物的水溶液與磷脂雙分子層薄膜混合，進行薄膜超聲處理，得到脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0012]作為本發明的優選技術方案，所述磷脂雙分子層薄膜是通過如下方法制得的:將卵磷脂和膽固醇溶于有機溶劑，蒸去有機溶劑，所述卵磷脂和膽固醇自組裝成所述磷脂雙分子層薄膜。
[0013]優選地，所述卵磷脂選自大豆卵磷脂、腦磷脂等各種來源的磷脂和聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂，聚乙二醇一端可以連接相關的靶向基團或者成像基團。
[0014]優選地，所述卵磷脂和膽固醇的摩爾比為1:1~1:0.1，例如1:1、1:0.9,1:0.8、1: 0.6、1: 0.3或1: 0.1，在此摩爾比范圍內能夠形成較好的磷脂雙分子層薄膜。
[0015]優選地，所述有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮，更優選為二氯甲烷。
[0016]此處和本發明中其它地方出現的“選自”，如沒有特別說明，均指可以從所列具體選項中選擇一個或至少兩個。
[0017]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(1)中兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液以體積比2:1~10:1混合，例如以2:1、3:1、4:1、5:1、7:1和9:1混合，在此體積比范圍內能形成良好的“油包水”乳液。
[0018]優選地，所述步驟(1)中兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液以體積比4:1混合，這是形成“油包水”乳液的一個較佳的體積比。
[0019]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(1)中的兩親性聚合物選自聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚賴氨酸-聚丙交酯乙交酯(EPL-PLGA)和聚醚酰亞胺-聚乳酸(PE1-PLA)。可以單獨使用一種，也可以混合使用至少兩種。
[0020]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(1)中的親水性藥物選自阿霉素鹽酸鹽、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬?？梢詥为毷褂靡环N，也可以混合使用至少兩種。需要說明的是:本發明不在于親水性藥物的選擇，任何親水性藥物均可用于實現本發明。
[0021]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(1)中的兩親性聚合物的有機溶液中的有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮。可以單獨使用一種，也可以混合使用至少兩種。
[0022]上述制備方法中，所述步驟(1)和步驟(2)中可以采用超聲波細胞破碎儀實施超聲處理；所述步驟(3)可以采用旋轉蒸發儀蒸去有機溶劑；所述步驟(4)可以采用超聲清洗儀進行薄膜超聲處理，對超聲清洗儀的功率沒有特殊要求，可根據制備體系大小確定。
[0023]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液、第一乳液和疏水性藥物的有機溶液的體積比為2-5:1-2:0.1-0.5，例如2:1:0.1、2:1:0.5、2:2:0.1,2:2:0.5,5:1:0.1,5:1:0.5,5:2:0.1 或 5:2:0.5。在此體積比范圍內能形成較好、穩定的第二乳液。
[0024]優選地，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液、第一乳液和疏水性藥物的有機溶液的體積比為2:1.25:0.25。這是形成第二乳液的一個較佳的體積比。
[0025]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(2)中的表面活性劑選自聚乙烯醇或其它相似的高分子聚合物?？梢詥为毷褂靡环N，也可以混合使用至少兩種。
[0026]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液中表面活性劑的質量濃度為1_3%，例如1.2%、1.5%、1.8%、2.1 %、2.5%、2.7 %或2.9%，優選為2%。
[0027]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(2)中的疏水性藥物選自伊立替康和紫杉醇。可以單獨使用一種，也可以混合使用至少兩種。需要說明的是:本發明不在于疏水性藥物的選擇，任何疏水性藥物均可用于實現本發明。
[0028]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(2)中的疏水性藥物的有機溶液中的有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮?？梢詥为毷褂靡环N，也可以混合使用至少兩種。
[0029]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(3)中的第二乳液和含有表面活性劑的水溶液的體積比為 10:2 ~10:5，例如 10:2、10:3、10:4、10:4.5 或 10:4.8。
[0030]優選地，所述步驟(3)中的第二乳液和含有表面活性劑的水溶液的體積比為10:3.5o
[0031]本發明中，表面活性劑的作用在于穩定形成的乳液。
[0032]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(3)中的表面活性劑選自聚乙烯醇或其它相似的高分子聚合物?？梢詥为毷褂靡环N，也可以混合使用至少兩種。
[0033]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(3)中的含有表面活性劑的水溶液中表面活性劑的質量濃度為 0.3-1%，例如 0.3%,0.4%,0.5%,0.7%,0.8%,0.9%,0.95%或
0.98%，優選為 0.6%0
[0034]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(4)中的親水性藥物選自阿霉素鹽酸鹽、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬?？梢詥为毷褂靡环N，也可以混合使用至少兩種。需要說明的是:本發明不在于親水性藥物的選擇，任何親水性藥物均可用于實現本發明。
[0035]作為本發明的優選技術方案，所述步驟⑷的體系中卵磷脂與兩親性聚合物的質量比為1:1~1:10,例如1: 1、1:2、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:9.5。在此質量比范圍內，卵磷脂與兩親性聚合物的比例比較合理，能夠充分利用二者，雖然在此質量比范圍以外也能實現本發明，但是該質量比范圍是優選的。
[0036]作為本發明的優選技術方案，所述步驟(4)的體系中疏水性藥物和親水性藥物總量與兩親性聚合物的質量比為1:10~1:100，例如1:10、1:15、1:20、1:30、1:50、1:70、1:80、1:90或1:95。本發明中，疏水性藥物和親水性藥物二者可以以任意比例使用，可以根據對具體藥物的需求情況決定二者的比例關系，因為本發明的脂質體-聚合物雜化納米粒子的形成基本上不依賴于疏水性藥物和親水性藥物的量。
[0037]需要說明的是:本發明的制備方法中，步驟⑴和步驟⑷使用的親水性藥物可以相同，也可以不同。本發明的制備方法適用于包埋抗癌藥物，也適用于包埋水溶性不同但需要協同作用一起使用的針對其它疾病的藥物。
[0038]在第三方面，本發明提供如第一方面所述的脂質體-聚合物雜化納米粒子在制備抗腫瘤藥物的納米載藥體系中的應用。
[0039]本發明的有益效果為:本發明采用兩次乳化的方法制備包載有水溶性不同藥物和兩親性聚合物的聚合物納米粒子藥物，而后采用薄膜超聲自組裝法將磷脂雙分子層包裹在聚合物納米粒子表面，同時將親水性藥物包載在聚合物納米粒子和磷脂雙分子層的界面，得到包載多種藥物、具有多層結構的脂質體-聚合物雜化納米粒子。所述脂質體-聚合物雜化納米粒子由于表面的磷脂雙分子層，本身生物相容性高，能夠成功逃脫網狀內皮組織和一些免疫細胞的吞噬，延長在血液中的循環時間，使得納米粒子藥物本身具有靶向和緩控釋作用，提高藥物的療效，降低其自身的毒副反應，還實現不同藥物協同作用對例如腫瘤細胞等產生多靶點作用，從不同途徑對例如腫瘤細胞等產生殺傷作用。
[0040]本發明的制備方法是利用兩次乳化和薄膜超聲法將水溶性不同的藥物和納米材料包載成納米粒子。所用試劑均為市售普通試劑，設備簡單，操作過程方便適用，既可在實驗室小規模生產，又可工業化大規模生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為本發明實施例1制備的載有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬的納米粒子透射電鏡圖。
[0042]圖2為本發明實施例1制備的載有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬的納米粒子粒度分布圖，可以看出粒徑主要分布在60-200nm，分布均勻對稱，粒徑大小為168.63 ±24.56nm。[0043]圖3為本發明實施例1制備的載有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬的納米粒子溶解于乙腈的高效液相色譜圖，5-氟尿喃唳(Free5-Fu)在2.4分鐘出現特征吸收峰(270nm)，伊立替康(Free CPT)在7.9分鐘出現特征吸收峰(360nm)，奧沙利鉬(Free ΑΧΟ)在3.2分鐘出現特征吸收峰(260nm)，納米粒子(LNP-5-Fu-AXO-CPT)的樣品分別出現了三個特征峰(270nm、260nm和360nm),表明在所制備的納米粒子中載有5-氟尿嘧唳、伊立替康和奧沙利鉬三種藥物。
[0044]圖4為本發明的包載有5-氟尿嘧啶(5-Fu)和伊立替康(CPT)兩種藥物的聚合物納米粒子(NPs)和包載有5-氟尿嘧啶(5-Fu)、伊立替康(CPT)和奧沙利鉬(AXO)三種藥物的脂質體-聚合物雜化納米粒子(LNPs)的在pH = 4.4 (a)和pH = 7.2 (b)條件下的藥物釋放曲線。
[0045]圖5為本發明所制備的5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬三種藥物的脂質體-聚合物雜化納米粒子作用于胰腺癌細胞的細胞毒性柱狀圖。所用藥物總濃度為0.2 μ mol/mL,可以看出空載納米粒子對胰腺癌細胞基本沒有毒性，而包載有三種藥物的納米粒子對胰腺癌細胞的殺傷作用比游離藥物的效果更好。
【具體實施方式】
[0046]下面將結合實施例對 本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，以下實施例僅為本發明的優選實施例，以便于更好地理解本發明，因而不應視為限定本發明的范圍。
[0047]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑廠商購買得到的。
[0048]實施例1
[0049]制備以伊立替康作為疏水性藥物模型、以5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬作為親水性藥物模型、以mPEG/PLA作為兩親性聚合物模型、以卵磷脂和膽固醇作為脂質體模型并載有三種藥物的具有多層結構的脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0050](I)將20mg的聚合物PLA-PEG溶于ImL 二氯甲烷中，作為油相；加入250 μ L溶有2mg/mL的5-氟尿喃唳水溶液；
[0051](2)利用超聲波細胞破碎儀(寧波新芝超聲細胞破碎儀:SCIENTZ_IID)在4%功率下作用4分鐘，形成均一乳液；
[0052](3)將2mL的2%聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況下加入，同時將250 μ L溶有2mg/mL伊立替康的二氯甲烷緩慢加入；
[0053](4)攪拌3min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用5分鐘；
[0054](5)將IOmL的0.6% PVA加入圓形燒杯，將(4)制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌10分鐘；
[0055](6)用旋轉蒸發儀(東京理化:N-1100D-WD)除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0056](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于二氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。
[0057](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和奧沙利鉬水溶液，并置于超聲清洗儀(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0058](9)8000-13000rpm離心5_10min,沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納米粒子。
[0059]在透射電鏡下觀察納米粒子，結果如圖1所示，可以看出納米粒子大小約為lOOnm。
[0060]利用激光粒度儀測得納米粒子的粒徑為168.63±24.56nm(圖2);分散度為
0.264,zeta電位為-14.6±0.14，表明該溶液穩定性較好；5_氟尿嘧啶包封率為20.5%，伊立替康包封率為96.13%，奧沙利鉬包封率為21.37%。
[0061]將(9)中的沉淀冷凍干燥后用乙腈溶解，利用高效液相色譜檢測，可以看出納米粒子同時具有5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬的特征峰(圖3)，說明利用該方法可以將三種藥物同時包載到納米粒子中。
[0062]實施例2
[0063]制備包載伊立替康、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬的納米粒子，得到粒徑大小約為161.63±21.76nm的球形納米粒子，5-氟尿嘧啶載藥量為2%，包封率為20%，【具體實施方式】如下:
[0064](I)將20mg的聚合物PLA-PEG溶于ImL 二氯甲烷中，作為油相；加入250 μ L溶有8mg/mL的5-氟尿喃唳水溶液；
[0065](2)利用超聲波細胞破碎儀在4%功率下作用4分鐘，形成均一乳液；
[0066](3)將2mL的2%聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況加入，同時將250 μ L溶有10mg/mL伊立替康的二氯甲烷緩慢加入；
[0067](4)攪拌3min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用5分鐘；
[0068](5)將IOmL的0.6% PVA加入圓形燒杯，將(4)制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌10分鐘；
[0069](6)用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0070](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于二氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。
[0071](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和奧沙利鉬(1.14g)水溶液，并置于超聲清洗儀中(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0072](9)8000-13000rpm離心5_10分鐘，沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納
米粒子。
[0073]實施例3
[0074]制備包載5-氟尿嘧啶和伊利替康兩種藥物的納米粒子，得到粒徑大小約為165.63 ±14.38nm的球形納米粒子，載藥量為12%，伊立替康包封率為96%，【具體實施方式】如下:
[0075](1)將20mg的聚合物PLGA-PEG溶于ImL 二氯甲烷中，作為油相，加入250 μ L溶有
0.4mg/mL的5-氟尿喃唳水溶液；
[0076](2)利用超聲波細胞破碎儀在4%功率下作用4分鐘，形成均一乳液；[0077](3)將2mL的2%聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況下加入，同時將250 μ L溶有10mg/mL伊立替康的二氯甲烷緩慢加入；
[0078](4)攪拌3min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用5分鐘；
[0079](5)將IOmL的0.6% PVA加入圓形燒杯，將⑷制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌10分鐘；
[0080](6)用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0081](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于二氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。[0082](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和5-氟尿嘧啶水溶液，并置于超聲清洗儀中(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0083](9) 13000rpm離心10分鐘，沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納米粒子。
[0084]實施例4
[0085]制備5-氟尿嘧啶、伊利替康和奧沙利鉬三種藥物納米粒子，得到粒徑大小約為163.63±20.83nm的球形納米粒子，載藥量為5 %，奧沙利鉬包封率為21 %，【具體實施方式】如下:
[0086](1)將20mg的聚合物PLGA-PEG溶于ImL 二氯甲烷中，作為油相；加入250μ L溶有0.4mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液；
[0087](2)利用超聲波細胞破碎儀在4%功率下作用4分鐘，形成均一乳液；
[0088](3)將2mL的2%聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況下加入，同時將250 μ L溶有2mg/mL伊立替康的二氯甲烷緩慢加入；
[0089](4)攪拌3min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用5分鐘；
[0090](5)將IOmL的0.6% PVA加入圓形燒杯，將(4)制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌10分鐘；
[0091](6)用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0092](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于二氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。
[0093](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和ImL的5mg/mL奧沙利鉬水溶液，并置于超聲清洗儀中(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0094](9) 13000rpm離心10分鐘，沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納米粒子。
[0095]實施例5
[0096]制備包載紫杉醇、阿霉素鹽酸鹽和奧沙利鉬的納米粒子，得到粒徑大小約為180.53 土 27.08nm的球形納米粒子，阿霉素鹽酸鹽載藥量為5 %，包封率為50 %，【具體實施方式】如下:
[0097](I)將30mg的聚合物EPL-PLGE溶于ImL三氯甲烷中，作為油相；加入500μ L溶有5mg/mL的阿霉素鹽酸鹽水溶液；
[0098](2)利用超聲波細胞破碎儀在4%功率下作用10分鐘，形成均一乳液；
[0099](3)將5mL的I %聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況加入，同時將100 μ L溶有10mg/mL紫杉醇的三氯甲烷緩慢加入；
[0100](4)攪拌5min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用10分鐘；
[0101](5)將12mL的I % PVA加入圓形燒杯，將⑷制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌10分鐘；
[0102](6)用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0103](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于三氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。
[0104](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和奧沙利鉬水溶液，并置于超聲清洗儀中(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0105](9)8000rpm離心10分鐘，沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納米粒子。
[0106]實施例6
[0107]制備包載伊立替康、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬的納米粒子，得到粒徑大小約為159.63±23.87nm的球形納米粒子，5-氟尿嘧啶載藥量為1.5%，包封率為25%，【具體實施方式】如下:
[0108](I)將18mg的聚合物PLA-PEG溶于ImL 二氯甲烷中，作為油相；加入100 μ L溶有4mg/mL的5-氟尿喃唳水溶液；
[0109](2)利用超聲波細胞破碎儀在4%功率下作用5分鐘，形成均一乳液；
[0110](3)將2mL的3%聚乙烯醇(PVA)加入圓形燒杯，將⑵制備的乳液在攪拌的情況加入，同時將500 μ L溶有5mg/mL伊立替康的二氯甲烷緩慢加入；
[0111](4)攪拌7min后取出再次利用超聲波細胞破碎儀在5%功率下作用5分鐘；
[0112](5)將15mL的0.3% PVA加入圓形燒杯，將⑷制備的乳液，在攪拌的情況下緩慢加入，攪拌15分鐘；
[0113](6)用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液；
[0114](7)將0.06g卵磷脂和0.015g膽固醇溶于二氯甲烷，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑，卵磷脂和膽固醇在燒瓶底部自組裝成磷脂雙分子層薄膜。
[0115](8)在(7)中加入(6)制備好的聚合物納米粒子懸液和奧沙利鉬水溶液，并置于超聲清洗儀中(東芝:SB-5200DTDN)中，用99%的功率超聲，使得磷脂雙分子層在聚合物納米粒子表面自組裝，形成脂質體-聚合物雜化納米粒子。
[0116](9) 1000Orpm離心8分鐘，沉淀即為載有水溶性不同抗癌藥物的復合納米粒子。
[0117]試驗例I
[0118]將包載有兩種藥物(CPT和5-Fu)的聚合物納米粒子(沒有外層的磷脂雙分子層)和本發明的方法制備得到的包載有三種藥物(CPT、AXO和5-Fu)的脂質體-聚合物雜化納米粒子分散于PH = 4.4和pH = 7.2的緩沖液中，在不同的時間點取樣離心，測得上清液中的藥物濃度，計算出藥物的釋放率(釋放率=藥物的釋放量/藥物的總量*100% )，實驗結果如圖4所示，可以看出相對于聚合物納米粒子，脂質體-聚合物納米粒子的穩定性更好，在酸性(pH = 4.4)和中性(pH = 7.2)條件下都更加穩定，體現在藥物的釋放率低，可見本發明方法制備得到的脂質體-聚合物雜化納米粒子具有優異的穩定性，利于藥物的緩慢釋放。[0119]試驗例2
[0120]將處于對數生長期的胰腺癌細胞調成1*103個/孔接種于96孔培養板，分別加入5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬游離藥物(游離藥物組)，空載納米粒子(不含藥物的脂質體-聚合物雜化納米粒子)和載有三種抗癌藥物(5-氟尿嘧啶、伊立替康和奧沙利鉬)的脂質體-聚合物雜化納米粒子(載藥納米粒子組)，游離藥物和載藥納米粒子組中所有藥物的總濃度均為0.2 μ mol/mL,三種藥物的比例完全相同，每種濃度平行5孔。給予10%牛血清RPMI1640培養液，每孔加100 μ L培養液，分別培養12h、24h、36h和48h后，利用CCK-8法檢測每組中細胞的促凋亡作用效果。實驗結果如圖5所示，每個時間點的三個并列柱狀圖從左至右依次對應空載納米粒子、游離藥物組和載藥納米粒子組。由圖5的結果可以看出，相對于游離藥物，載藥脂質體-聚合物雜化納米粒子對胰腺癌細胞的毒性更強，而空載納米粒子幾乎沒有表現出對胰腺癌細胞的毒性。
[0121] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及詳細方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及詳細方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【權利要求】
1.一種脂質體-聚合物雜化納米粒子，包括兩親性聚合物納米粒子和包覆于所述兩親性聚合物納米粒子表面的磷脂雙分子層，以及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子內部及包埋于所述兩親性聚合物納米粒子與磷脂雙分子層之間的水溶性不同的藥物。
2.一種制備權利要求1所述的脂質體-聚合物雜化納米粒子的方法，包括如下步驟: (1)將兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液混合，超聲處理形成第一乳液； (2)將含有表面活性劑的水溶液與所述第一乳液混合，在攪拌下加入疏水性藥物的有機溶液，并攪拌均勻，然后超聲處理形成第二乳液； (3)在攪拌下將所述第二乳液加入含有表面活性劑的水溶液，并攪拌均勻，然后蒸去有機溶劑，得到聚合物納米粒子懸液； (4)將所述聚合物納米粒子懸液和親水性藥物的水溶液與磷脂雙分子層薄膜混合，進行薄膜超聲處理，得到脂質體-聚合物雜化納米粒子。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷脂雙分子層薄膜是通過如下方法制得的:將卵磷脂和膽固醇溶于有機溶劑，蒸去有機溶劑，所述卵磷脂和膽固醇自組裝成所述磷脂雙分子層薄膜； 優選地，所述卵磷脂選自大豆卵磷脂、腦磷脂和聚乙二醇修飾的磷脂； 優選地，所述卵磷脂和膽固醇的摩爾比為1:1~1:0.1 ; 優選地，所述有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮，更優選為二氯甲烷。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液以體積比2:1~10:1混合； 優選地，所述步驟(1)中兩親性聚合物的有機溶液與親水性藥物的水溶液以體積比4:1混合。
5.根據權利要求2-4任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的兩親性聚合物選自聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇、聚賴氨酸-聚丙交酯乙交酯和聚醚酰亞胺-聚乳酸； 優選地，所述步驟(1)中的親水性藥物選自阿霉素鹽酸鹽、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬； 優選地，所述步驟(1)中的兩親性聚合物的有機溶液中的有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮。
6.根據權利要求2-5任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液、第一乳液和疏水性藥物的有機溶液的體積比為2-5:1-2:0.1-0.5 ； 優選地，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液、第一乳液和疏水性藥物的有機溶液的體積比為2:1.25:0.25。
7.根據權利要求2-6任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的表面活性劑選自聚乙烯醇； 優選地，所述步驟(2)中的含有表面活性劑的水溶液中表面活性劑的質量濃度為1-3%，優選為2% ； 優選地，所述步驟(2)中的疏水性藥物選自伊立替康和紫杉醇； 優選地，所述步驟(2)中的疏水性藥物的有機溶液中的有機溶劑選自二氯甲烷、三氯甲燒、二甲基亞砜、四氫呋喃和丙酮。
8.根據權利要求2-7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的第二乳液和含有表面活性劑的水溶液的體積比為10:2~10:5 ; 優選地，所述步驟(3)中的第二乳液和含有表面活性劑的水溶液的體積比為10:3.5 ; 優選地，所述步驟(3)中的表面活性劑選自聚乙烯醇； 優選地，所述步驟(3)中的含有表面活性劑的水溶液中表面活性劑的質量濃度為0.3-1%，優選為 0.6%。
9.根據權利要求2-8任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的親水性藥物選自阿霉素鹽酸鹽、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉬； 優選地，所述步驟(4)的體系中卵磷脂與兩親性聚合物的質量比為1:1~1:10 ;優選地，所述步驟(4)的體系中疏水性藥物和親水性藥物總量與兩親性聚合物的質量比為 1:10 ~1:100。
10.如權 利要求1所述的脂質體-聚合物雜化納米粒子在制備抗腫瘤藥物的納米載藥體系中的應用。
【文檔編號】A61K47/34GK103893123SQ201410164437
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】聶廣軍, 李鳳, 趙瀟, 王海, 郝繼輝 申請人:國家納米科學中心