一種具有生物活性器官的制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有生物活性器官的制造方法，包括：讀取待加工器官的三維模型，對所述三維模型進行分層，讀取每層層文件的結構特征數據；在多孔基底上制作該層文件對應的器官截面，得到帶有器官截面的器官基底；對于任意兩個相鄰的器官截面，在多孔基底上制作該相鄰兩個器官截面之間的營養通道截面，得到帶有營養通道截面的營養通道基底；在器官基底上，根據每層層文件的結構特征數據信息，利用三維打印噴頭實現細胞在器官截面上的沉積；將器官基底和營養通道基底按照次序依次固定，培養，形成具有生物活性器官。本發明采用了無菌濾紙或多孔薄膜作為器官截面的支撐，避免了無強度的凝膠堆積形成的器官易坍塌，難以成型的缺點。
【專利說明】一種具有生物活性器官的制造方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制造領域，尤其是涉及一種具有生物活性器官的制造方法。

【背景技術】
[0002] 活性組織的制造可為人類的組織缺損提供最佳的替換品，因而一直是組織工程領 域的研究熱點。而血管作為生物體中的基本組織，承擔著營養輸送的重要任務，目前有關制 作血管的方法主要有以下幾類：
[0003] -類是以制作無生物活性的器官，主要以血管為主，例如：申請公布號為 CN100364489A的專利文獻公開了一種抗折型機織人造血管，血管管坯由經緯紗交織而成， 在血管管坯的外表面有彈性帶；在管坯的外壁具有以挑紗方式將經紗間隔挑成的一個個紗 圈，紗圈以螺旋狀或網絡狀排列于管坯的外壁，彈性帶穿入一個個紗圈內，由紗圈定位于管 坯的外壁。申請公布號為CN1522675A的專利文獻公開了一種內壁無褶型機織人造血管， 以平紋或斜紋與絞紗為基本組織，其特征是在構成基本組織的經紗間輔以一定間隔的經浮 長紗，共同組成血管管坯的組織結構，管坯緯紗間的間隔因壓縮而消除，形成光滑的血管 內壁，管坯經紗中的經浮長紗則因壓縮而形成拱起，構成血管外壁的皺褶。申請公布號為 CN1248156A的專利文獻公開了一種外科手術中之移植件的多層復合管狀結構，包括：一包 括一生物相容性材料的外層；一包括冶金法粘接到該外層的一非透射性材料的中間層；和 一包括冶金法粘接到該中間層的一生物相容性材料的內層。這一類制作方法，僅能制作無 活性的器官，適用性差。
[0004] 第二類是以非人動物制作活性器官，例如申請公布號為CN102512263A的專利文 獻公開了一種把異體的器官換為器官接受者細胞組成的器官：首先準備好器官大小與人 (器官接受者）器官大小差不多的動物（器官提供者），然后，在器官移植前或移植后向動 物的器官或循環的動物或器官接受者血液中注入相應的動物組織干細胞的抗體交聯物。接 下來在移植手術成功后按照常規劑量使用免疫抑制劑，同時注射干細胞動員劑，本發明具 有器官來源充足，成本低，而且患者無需等待器官捐獻者的出現就可以隨時買到合適的器 官，患者無需終身服用免疫抑制藥物。然而這種方法，以犧牲其他動物為前提，可實施性差。
[0005] 第三類是目前最具有研發前景的方法之一，該類方法以高分子等材料為主，基于 活體細胞直接制造血管，目前主要是方法是通過凝膠顆粒包裹細胞，然后使用三維運動平 臺控制凝膠顆粒有序的沉積，實現活性血管的制造。這種方法的主要缺點是沉積后的血管 組織，無法具有正常血管的功能，所沉積細胞間無法有效的建立通訊聯系，因而也就無法具 有正常血管的彈性、能分泌抗血栓物質等特性。


【發明內容】

[0006] 本發明提供了一種具有生物活性器官的制造方法，可方便快速的制造出器官，該 方法適于各種生物器官的制造中，具有加工方便，效率高、易于給制造出的器官輸送營養、 易于對器官細胞施加各種模擬體內器官所處環境的刺激。
[0007] -種具有生物活性器官的制造方法，包括：
[0008] (1)讀取待加工器官的三維模型，對所述三維模型進行分層，得到層文件，讀取每 層層文件的結構特征數據；
[0009] (2)對于每一個層文件，根據其結構特征數據，分別在多孔基底上制作該層文件對 應的器官截面，得到帶有器官截面的器官基底；
[0010] (3)對于任意兩個相鄰的器官截面，在多孔基底上制作該相鄰兩個器官截面之間 的營養通道截面，得到帶有營養通道截面的營養通道基底；
[0011] (4)在器官基底上，根據每層層文件的結構特征數據信息，利用三維打印噴頭實現 細胞在器官截面上的沉積；
[0012] (5)將器官基底和營養通道基底按照次序依次固定，培養，形成具有生物活性器 官。
[0013] 步驟（1)中，待加工器官的三維模型可通過三維軟件得到，例如可采用 Solidworks、rhinocero等，也可采用CT掃描，然后三維重建的方式獲得。對三維模型進行 分層可采用常見的分層軟件，例如MagicRP、Slic3R、Skeinforge等。步驟（1)中分層厚度， 一般根據步驟（2)中多孔基底的厚度確定，一般為0. 1-lmm，進一步優選為0. 1-0. 4mm。
[0014] 步驟（2)和步驟（3)中，所述多孔基底可獨立的選擇無菌濾紙或多孔薄膜；可以是 商品化的親水無菌濾紙、也可以是自制的多孔親水薄膜，厚度在0. lmm-lmm之間，親水無菌 濾紙或多孔親水薄膜的孔徑大小要能夠通過細胞，即孔徑控制在30 μ m-500 μ m之間。
[0015] 每層器官基底上主要包括如下結構：器官截面、以及便于實現器官截面固定的其 他輔助結構；所述器官截面包括與器官結構對應的孔結構、位于孔結構內壁的營養吸收纖 毛、以及除孔結構以外的細胞組織區域。所述其他輔助結構主要包括用于實現器官截面軸 向固定的組裝定位孔、用于實現器官截面與器官基底其余部分徑向固定的連接件。
[0016] 步驟（3)中，在多孔基底上制作兩個相鄰器官截面之間的營養通道截面時，一般 根據相鄰兩個器官截面中任一器官截面的結構制作；營養通道基底一般包括營養通道截 面、以及便于實現營養通道截面固定的其他輔助結構；營養通道截面包括與器官截面上孔 結構對應的徑向傳輸孔結構、以及軸向傳輸孔結構，軸向傳輸孔結構一般位于兩個相鄰器 官截面的細胞組織區域之間，便于實現對兩層細胞的營養輸送。所述其他輔助結構主要包 括用于實現營養通道截面軸向固定的組裝定位孔、用于實現營養通道截面與營養通道基底 其余部分徑向固定的連接件。
[0017] 步驟（4)中，利用三維打印噴頭實現細胞在器官截面上的沉積，沉積區域為器官 截面上除孔結構以外的細胞組織區域，與器官上細胞組織的分布一致。
[0018] 三維打印噴頭可使用壓電式噴頭、擠壓式、氣動式等各種噴頭。血管截面，由三層 環形截面構成，最里面是內皮細胞，中間是平滑肌細胞，外層是成纖維細胞。為固定住細胞， 可使用凝膠將細胞包裹，采用凝膠將細胞包裹可采用溫敏凝膠如明膠，也可采用離子反應 實現，如使用纖維蛋白+凝血酶獲得纖維蛋白凝膠、海藻酸鈉+氯化鈣獲得海藻酸鈉凝膠。
[0019] 對于明膠，可使用熱溶液將明膠熔化，混入細胞后，裝入噴頭，通過二維平臺的運 動，實現細胞在無菌濾紙或多孔薄膜上的沉積。然后對無菌濾紙或多孔薄膜降溫，使得明膠 凝結成凝膠，依次按順序使用三個噴頭沉積血管的三種細胞，從而獲得血管截面。
[0020] 如采用離子反應實現，以纖維蛋白凝膠為例，將纖維蛋白混合細胞后的溶液裝入 噴頭，通過二維平臺的運動，實現纖維蛋白及在無菌濾紙或多孔薄膜上的沉積。然后將無菌 濾紙或多孔薄膜浸入凝血酶溶液中，纖維蛋白形成纖維蛋白凝膠，依次按順序使用三個噴 頭沉積血管的三種細胞，從而獲得血管截面。
[0021] 步驟（4)完成后，根據需要，作為優選，增加培養步驟，S卩：將帶沉積好的器官截面 的器官基底放入培養液中培養，1-2天。培養的目的是是剛沉積出的血管截面上的細胞適應 新的環境，可順利的和培養液進行營養交換，進行生長。本步驟為優選，可根據實際情況省 略。
[0022] 當加入培養步驟時，步驟（4)的凝膠固化過程也可待步步驟（4)完成后進行，即在 培養步驟中的培養液中混入凝血酶，反應獲得凝膠。
[0023] 步驟（5)中，利用器官基底和營養通道基底上的組裝定位孔將多層器官截面和營 養通道截面軸向固定。同時，器官基底和營養通道基底上的徑向連接件實現對器官截面和 營養通道截面的徑向固定。固定完成后，多層器官截面和營養通道截面的孔結構相互對應， 形成完整的培養流道。
[0024] 步驟（5)中，培養過程為：將固定好的三維器官放入培養液中培養，在培養流道內 通入培養液，施加流場刺激，模擬實際器官在流動時所受體內流動剪切及器官的實際生長 環境，除對器官施加流場刺激外，也可對器官施加拉伸及剪切力作用。培養7-30天即可獲 得活性血管。
[0025] 本發明制作方法可以用于各種器官的制作，例如可用于環形截面的血管的制作， 除了環形截面，由橢圓形截面或其他無規則截面構成的器官也同樣可以采用本發明的方式 進行制造，例如可用于制作半月板。
[0026] 本發明通過培養流道實現了對器官徑向的營養輸送，通過營養通道截面實現器官 軸向的營養輸送，保證器官在培養前期細胞的成活率，避免細胞死亡，保證器官制作的成功 率。
[0027] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0028] (1)、由于采用了無菌濾紙或多孔薄膜作為血管截面的支撐，避免了無強度的凝膠 堆積形成的器官易坍塌，難以成型的缺點。
[0029] (2)、本方法獲得的器官易于構造擬器官生長的環境，通過特殊設計的器官培養流 道，很容易對器官施加流場刺激，也很容易施加拉伸及剪切力，更好的模擬器官生長環境。
[0030] (3)、通過特殊設計的營養吸收纖毛，便于器官吸收營養物質，從而避免了現有制 造器官的技術中出現的營養只限于表面，難以達到組織內部的情形。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明實施例1使用的無菌濾紙結構圖。
[0032] 圖2為本發明實施例1中器官基底的結構示意圖。
[0033] 圖3為本發明實施例1中營養通道基底的結構示意圖。
[0034] 圖4為本發明實施例1中的帶有細胞的環形的血管截面圖。
[0035] 圖5為本發明實施例1中制備得到具有生物活性血管的二維結構示意圖。
[0036] 圖6為本發明實施例2中需要制備的半月板的結構示意圖。
[0037] 圖7(a)-圖7(c)為本發明實施例2中制備的半月板基底的結構示意圖。
[0038] 圖8(a)-圖8(c)為本發明實施例2制備的營養通道基底的結構示意圖。
[0039] 圖9為本發明實施例2中制備的得到具有生物活性半月板的二維結構示意圖。

【具體實施方式】
[0040] 實施例1 :制作血管
[0041] 利用三維軟件例如Solidworks制作血管的三維模型，對得到的三維模型進行分 層，得到多層層文件，厚度為0. 34mm，同時讀取每層層文件的結構特征數據信息，輸入到數 控激光切割機中，然后進行如下步驟。
[0042] (a)、如圖1所示，多孔基底采用無菌濾紙100,無菌濾紙采用Whatman濾紙，型號為 3030-961，厚度為0. 34_的濾紙。對于每一個層文件，使用數控激光切割機在圖1所示的 無菌濾紙100上切割出圖2所示的血管基底、以及與該層血管基底相鄰的圖3所示的營養 通道基底。
[0043] 制作圖2所示的血管基底時，利用數控激光切割機在圖1所示的無菌濾紙100上 加工出血管組裝定位孔101、血管培養流道外截面孔102、血管培養流道內截面孔103、血管 固定連接件104、血管外壁營養吸收纖毛105、血管內壁營養吸收纖毛106,血管外壁營養吸 收纖毛105及血管內壁營養吸收纖毛106間為環形區域107,用于細胞在該處沉積，構成圖 4所示的血管截面200。血管截面200,由三層環形截面構成，最里面是內皮細胞，中間是平 滑肌細胞，外層是成纖維細胞。
[0044] 制作圖3所示的營養通道基底時，利用數控激光切割機在圖1所示的無菌濾紙100 上加工出營養通道組裝定位孔301、血管培養流道外截面孔302、營養通道固定連接件304、 以及血管截面毛細輸送通道307。血管截面毛細輸送通道307為環形，位于兩個相鄰血管截 面200的中間，方便為血管內外層通過濾紙的毛細效應輸送營養。
[0045] (b)、通過安裝有壓電式噴頭的二維工作平臺，在圖2所示的環形區域107位置沉 積出帶有細胞的環形的血管截面200,如圖4所示。共沉積三層細胞構成血管截面200,最 里面是內皮細胞，中間是平滑肌細胞，外層是成纖維細胞。使用三個獨立噴頭分別噴射纖維 蛋白溶液混合內皮細胞、纖維蛋白溶液混合平滑肌細胞、纖維蛋白溶液混合成纖維細胞。沉 積完成血管截面200后，將濾紙浸入凝血酶溶液中，血管截面200處的纖維蛋白和凝血酶反 應形成纖維蛋白凝膠，起到固定血管截面上的各種細胞的作用。
[0046] (c)、將沉積好血管截面的濾紙放入培養液中培養1-2天。培養的目的是剛沉積出 的血管截面上的細胞適應新的環境，可順利的和培養液進行營養交換，進行生長。培養液沒 有特殊要求，可采用常用的牛血清培養液。
[0047] (d)、將多片步驟（c)處理后帶有血管截面200的無菌濾紙及為血管細胞提供營 養輸送的帶有營養通道截面的無菌濾紙，通過血管組裝定位孔101和營養通道組裝定位孔 301，疊加組裝起來，實現從二維血管截面到三維血管502的制作，如圖5所示。血管基底 500和營養通道基底501的數量比為1-10,優選為1 :1。由血管培養流道外截面孔102、血 管培養流道外截面孔302組成血管外壁培養流道503 ;由血管培養流道內截面孔103、血管 截面毛細輸送通道307組成血管內壁培養流道504。
[0048] (e)、將三維血管放入培養液中培養，在血管外壁培養流道503及血管內壁培養流 道504內通入培養液，施加流場刺激，模擬實際血管在流動時所受體內流動剪切及血管的 實際生長環境，除對血管施加流場刺激外，也可對血管施加拉伸及剪切力作用，培養10天 后獲得活性血管。
[0049] 在血管外壁培養流道503及血管內壁培養流道504內通入培養液可更好的促進內 皮細胞間通訊，構成血管內膜，成纖維細胞間的通訊，構成血管外膜，平滑肌細胞間的通訊 以及和內皮細胞及成纖維細胞的通訊，構成血管中間層。由于無菌濾紙或多孔薄膜所具有 的毛細效應，三維血管可通過血管外壁營養吸收纖毛105、血管內壁營養吸收纖毛106,吸 收營養物質，從而避免了現有制造血管的技術中出現的營養只限于表面，難以達到組織內 部的情形。
[0050] 實施例2 :制作半月板
[0051] 利用三維軟件例如Solidworks制作半月板的三維模型，對得到的三維模型進行 分層，得到多層層文件，如圖6所示，厚度為0. 34mm，同時讀取每層層文件的結構特征數據 信息，輸入到數控激光切割機中，然后進行如下步驟。
[0052] (a)、如圖1所示，多孔基底采用無菌濾紙100,無菌濾紙采用Whatman濾紙，型號為 3030-961，厚度為0. 34_的濾紙。對于每一個層文件，使用數控激光切割機在圖1所示的 無菌濾紙100上依次切割出圖7 (a)-圖7 (c)所示的半月板基底、以及與該層半月板基底相 鄰的圖8(a)-圖8(c)所示的營養通道基底。
[0053] 制作半月板基底時，利用數控激光切割機在圖1所示的無菌濾紙100依次切出半 月板截面700,用于細胞在該處沉積。圖7(a)-圖7(c)所示為半月板中不同位置層文件對 應的幾種半月板基底圖結構。
[0054] 制作營養通道基底時，利用數控激光切割機在圖1所示的無菌濾紙100上加工出 以及半月板截面營養輸送通道800。圖8(a)-圖8(c)所示為半月板中不同位置層文件對應 的營養通道基底。半月板截面營養輸送通道800,位于兩個相鄰半月板截面700的中間，方 便為半月板外層通過濾紙的毛細效應輸送營養。
[0055] (b)、通過安裝有噴頭的二維工作平臺，在圖7所示的區域位置沉積出帶有軟骨細 胞的半月板截面700,使用一個噴頭噴射纖維蛋白溶液混合軟骨細胞。沉積完成半月板截面 700后，將濾紙浸入凝血酶溶液中，半月板截面700處的纖維蛋白和凝血酶反應形成纖維蛋 白凝膠，起到固定半月板截面上的細胞的作用。
[0056] (c)、將沉積好半月板截面的濾紙放入培養液中培養1-2天。培養的目的是剛沉積 出的半月板截面上的細胞適應新的環境，可順利的和培養液進行營養交換，進行生長。培養 液沒有特殊要求，可采用常用的牛血清培養液。
[0057] (d)、將多片步驟（c)處理后帶有半月板截面700的無菌濾紙及為半月板細胞提供 營養輸送的帶有營養通道截面的無菌濾紙，疊加組裝起來，實現從二維半月板截面到三維 半月板903的制作，如圖9所示。半月板基底900和營養通道基底901的數量比為1-10,優 選為1 :1。
[0058] (e)、將三維半月板放入培養液中培養，在半月板外壁培養流道902內通入培養 液，施加流場刺激，模擬實際半月板在流動時所受體內流動剪切及半月板的實際生長環境， 除對半月板施加流場刺激外，也可對半月板施加拉伸及剪切力作用，培養10天后獲得活性 半月板。
【權利要求】
1. 一種具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，包括： (1) 讀取待加工器官的三維模型，對所述三維模型進行分層，得到層文件，讀取每層層 文件的結構特征數據； (2) 對于每一個層文件，根據其結構特征數據，分別在多孔基底上制作該層文件對應的 器官截面，得到帶有器官截面的器官基底； (3) 對于任意兩個相鄰的器官截面，在多孔基底上制作該相鄰兩個器官截面之間的營 養通道截面，得到帶有營養通道截面的營養通道基底； (4) 在器官基底上，根據每層層文件的結構特征數據信息，利用三維打印噴頭實現細胞 在器官截面上的沉積； (5) 將器官基底和營養通道基底按照次序依次固定，培養，形成具有生物活性器官。
2. 根據權利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步驟（2) 和步驟（3)中，所述多孔基底為無菌濾紙或多孔薄膜；厚度為0. lmm-lmm，孔徑控制為 30 μ m_500 μ m〇
3. 根據權利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述器官基底 和營養通道基底的數量比例為1:1-10。
4. 根據權利要求3所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述器官基底 和營養通道基底的數量比例為1:1。
5. 根據權利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步驟（4)完成 后，先將沉積好細胞的器官基底放入培養液中培養，1-2天，然后再進行步驟（5)。
6. 根據權利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步驟（4)中，利 用三維打印噴頭實現細胞在器官截面上的沉積時，采用凝膠將細胞包裹打印。
7. 根據權利要求6所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述凝膠為明 膠；使用時將明膠熔化，混入細胞后，裝入噴頭，通過二維平臺的運動，實現細胞在器官截面 的沉積；然后對沉積后的器官截面降溫，使得明膠凝結成凝膠。
8. 根據權利要求6所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述凝膠為纖 維蛋白凝膠、海藻酸鈉凝膠；使用時，將纖維蛋白或海藻酸鈉與細胞混合后的溶液裝入噴 頭，通過二維平臺的運動，實現纖維蛋白或海藻酸鈉在器官截面上的沉積；然后將沉積后的 器官截面浸入凝血酶溶液或氯化鈣溶液中，纖維蛋白形成纖維蛋白凝膠或者海藻酸鈉形成 海藻酸鈉凝膠。
9. 根據權利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述具有生物 活性器官為血管或半月板。
【文檔編號】A61F2/06GK104146793SQ201410362702
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】賀永, 劉安, 肖簫, 傅建中, 嚴世貴 申請人:浙江大學