基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束及其制備方法。首先，采用“一鍋法”開環制備兩親性聚磷酸酯嵌段共聚物；再將其末端羥基進行修飾，得到葉酸修飾的嵌段共聚物；隨后，將四甘醇上羥基修飾為末端含有縮醛基及疊氮基的分子；最后，采用“CuAAC”點擊反應制備得到酸敏感核交聯載藥膠束。本發明制備的核交聯膠束可通過自組裝包載疏水性抗癌藥物，并且在酸性條件下，由于縮醛基的斷裂，導致膠束結構破壞，釋放出所包載藥物，可以用作可控釋放藥物載體。本發明公開的核交聯膠束可以用作高效可控釋放藥物載體，在生物材料及生物醫藥領域具有良好的應用價值。
【專利說明】基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用高分子材料領域，具體涉及一種基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感生物可降解核交聯載藥膠束及其制備方法。

【背景技術】
[0002]兩親性共聚物一般由親水和疏水鏈段組成，由于其在水溶液中可以自組裝成多種形狀納米粒子，如膠束、囊泡、納米棒及薄片等，在生物醫藥、超分子及納米科技等領域具有廣闊的應用前景。眾所周知，多數的抗癌藥物都具有很強的疏水性，而兩親性共聚物自組裝形成的核-殼結構的膠束具有疏水性內核，可以用于包載疏水性抗癌藥物，而親水性的外殼可以起到穩定膠束、增加藥物水溶性的作用，并極大地提高了載藥膠束在體內的循環時間。
[0003]傳統兩親性共聚物載藥膠束主要通過物理包埋方式包載疏水性抗癌藥物。當其注射到體內后存在一定的熱力學不穩定性，在體內循環過程中，由于體液稀釋(低于臨界膠束濃度值)及體液的復雜環境等作用，膠束結構容易被破壞，使抗癌藥物易從膠束內擴散出來，導致藥物在癌變組織部位富集程度較低，嚴重影響治療效果。同時，藥物的毒性對人體帶來很多不良反應。近年來，文獻報道多采用交聯方式來降低抗癌藥物在體內循環過程中的擴散，增加藥物在癌變組織部位的富集。
[0004]膠束交聯的方法主要有兩種:“物理交聯法(Physical cross-links)”和“化學交聯法(Chemical cross-links)”。物理交聯膠束主要通過非共價鍵作用形成,例如:靜電作用、氫鍵、配位鍵、疏水作用及超分子絡合作用等；而化學交聯膠束主要通過共價鍵作用形成，即功能性共聚物分子鏈間的相互反應或者添加功能性小分子交聯劑與共聚物鏈發生化學反應。根據膠束交聯位置的不同，交聯膠束可以分為“核交聯膠束(Core cross-linkedmicelle)”和“殼交聯膠束(Shell cross-linked micelle)”,這種交聯膠束作為藥物載體在體內循環過程中可以穩定存在。
[0005]盡管藥物載體的研究已經有了長足的進展，但是能夠應用到臨床試驗的產品種類有限，藥物載體到達體內后很難以預期的速度在特定的時間和特定的部位進行藥物釋放，這成為限制藥物載體發展的最大障礙。具有良好穩定性的交聯納米粒子在體內循環過程中有效的延長了循環時間，但是進入癌細胞后，載藥膠束將會面臨以預期的速度在特定的時間和特定的部位進行藥物釋放問題，這成為限制藥物載體發展的最大障礙。對此，研究者設計開發了智能響應性納米粒子藥物載體，這類藥物載體受到來自外界環境的刺激(包括溫度、氧化還原條件、光和PH值等)時，其性質會發生相應變化，利用這一點，研究者設計合成了多種刺激響應性納米粒子藥物載體。當受到外界刺激時，納米粒子結構會被破壞，從而將其內部包載的藥物釋放出來，達到藥物的可控釋放。
[0006]一般而言，人體內不同組織及細胞器的pH值會有所差異，如:血液及正常組織部位的PH值一般為7.4，腫瘤及病變部位的pH值為6.5左右，而內涵體及溶酶體內的pH甚至達到5.0?5.5。利用這一特點，可以設計具有酸敏感的聚合物膠束，這些膠束在制備過程中可以包載疏水性藥物，進入體內循環后，在正常組織及體液條件下載藥膠束可以穩定存在，而到達腫瘤部位等酸性環境下，酸敏感基團會發生改變，導致膠束結構破壞，將包載的藥物釋放出來，達到可控藥物釋放目的。常用酸敏感基團主要包括兩種:一種是可逆的酸敏感基團，包括-COOH、-NH2和-SO3H等，其主要是通過在不同pH環境下的質子化及去質子化來作用；另一種是不可逆的酸斷裂鍵，包括縮醛基、縮酮基、腙鍵、肟鍵及原甲酸酯等，在酸性條件下，這些化學鍵會發生不可逆的化學鍵斷裂。
[0007]傳統的交聯結構膠束大多使用具有良好生物相容性的聚乙二醇和聚酯，但是當聚乙二醇分子量較大時，難以通過代謝排出體內，而聚磷酸酯與生物大分子核酸的結構相似，有極好的生物相容性，而且，在體內磷酸二酯酶存在下，磷酸酯可以水解，具有良好的生物降解性；另外，傳統的交聯結構膠束多采用酯鍵或者還原敏感結構來控制藥物釋放，未見將酸敏感基團弓I入核交聯膠束的報道。
[0008]理想的藥物載體應當具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作為抗腫瘤藥物的載體，還應當具有下列特征:在水溶液中可以形成穩定的聚合物膠束，其疏水性內核可以包載疏水性抗癌藥物，親水性外殼起到穩定膠束的作用；在體內循環過程中可以避免藥物的擴散及載體的聚集，提高膠束在體內循環時間；當載藥膠束到達腫瘤或病變組織時，能夠利用主動或者被動靶向，高效進入癌細胞；同時，膠束進入癌細胞后應當具有“智能”響應性，在癌細胞特殊環境下，達到藥物的控制釋放。盡管對于藥物載體的研究已經取得了長足的進展，但是藥物載體的發展仍然面臨巨大的挑戰。
[0009]因此，需要研發新型的核交聯膠束結構用于藥物載體。


【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束及其制備方法，該核交聯載藥膠束具有良好的生物相容性、生物可降解性及酸敏感性，可以用作刺激響應性藥物體系。
[0011]本發明的總體構思是:將開環聚合(ROP)和端炔基與疊氮的環加成反應(CuAAC)聯用，合成葉酸靶向的酸敏感生物可降解核交聯載藥膠束。首先，以含羥基的小分子為引發齊IJ，對環狀磷酸酯類單體進行開環聚合，得到兩親性聚磷酸酯嵌段共聚物；隨后，用葉酸對該嵌段共聚物末端羥基進行修飾，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物；之后，從雙羥基化合物制備得到末端含有疊氮基及縮醛基的小分子；最后，將疏水性抗癌藥物、側鏈含有炔基的葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物和末端含有疊氮基的小分子在水溶液中自組裝，并進行“CuAAC”點擊反應，得到具有酸敏感的核交聯載藥膠束。
[0012]為達到上述目的，本發明采取的技術方案是，一種基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束的制備方法，具體包括以下步驟:
(I)制備聚磷酸酯嵌段共聚物:惰性氣氛中，在1，8-二氮雜二環[5.4.0] i^ —碳-7-烯的催化作用下，以二氯甲烷為溶劑，在10?50°C條件下，以異丙醇為引發劑，以環狀磷酸酯為單體進行開環聚合，反應30秒?60分鐘；再加入環狀磷酸酯單體 [^P:_R2，繼續反應30秒?60分鐘；得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
環狀磷酸酯單體結構式中，R1為CH2或CH2CH2 ；R2為甲基、乙基、異丙基、丁基或單甲基封端的聚環氧乙烷基中的一種；所述單甲基封端的聚環氧乙烷基的化學結構式為=(OT2CH2O)xCH3,式中 X = 2 ?10 ;m = 20 ?90，η = 20 ?90 ;
所述引發劑、「K及1，8- 二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯的摩
?O U 】U I
爾比為 1: (20 ?90): (20 ?90): (0.1 ?2);
上述反應式如下:


Γ.ο—.ο
,.........^ DBU π 1.- rf O-..; O9
—Μ3Η ? m O, ρ,O--..^ O - ? -O - λ.? t ? O ^ Η
■O O CH2CI2 DBU.CH2Cl2'■ °'?'"?>
R10^1'R2






1..1 I:
(2)制備葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物:在二環己基碳二亞胺的催化作用下，以葉酸和羥基琥珀酰亞胺為原料，以二甲亞砜為溶劑，在4-二甲氨基吡啶的存在下，于10?40°C反應8?16小時，再加入步驟(I)制備的聚磷酸酯嵌段共聚物，攪拌，繼續反應8?48小時，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物；
所述聚磷酸酯嵌段共聚物、葉酸、羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺及4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1: (I?2): (1.2?3): (1.2?3): (0.1?I);
上述反應式如下:
9Ht^V',JIdccowapoHO'f11>
,-.,,1- H(.1 - ^ 1................-—……?--- ;-t.;.Q f:1
uH.:?f OUSi OH|Γ.? I—..—I Y
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式中R1 SCH2或CH2CH2 ;R2為甲基、乙基、異丙基、丁基或單甲基封端的聚環氧乙烷基中的一種；所述單甲基封端的聚環氧乙烷基的化學結構式為=(CH2CH2O)xCH3，式中X = 2?10 ;m = 20 ?90, η = 20 ?90 ;
(3)制備疊氮基封端的酸敏感小分子:在4-甲基苯磺酸吡啶鎗的催化作用下，以HO-R3-OH和2-氯乙基乙烯基醚為原料，在冰水浴條件下，反應0.5?I小時，制備氯官能團封端的小分子；然后將上述氯官能團封端的小分子、疊氮化鈉加入#，二甲基甲酰胺溶液中，于40?80°C反應30?50小時，得到疊氮基封端的酸敏感小分子；
所述 HO-R3-OH 中，R3 為(CH2CH2O)yCH2CH2 ,其中 y = O ?7 ;
所述氯官能團封端的小分子的結構式為α_?αγα'κ?αγ_α'___'_'? ；
所述H0-R3-0H、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎗的摩爾比為1: (4?20): (0.1 ?0.5)；
所述氯官能團封端的小分子與疊氮化鈉的摩爾比為1: (4?40); 上述反應式如下:


ppjS
Hoivm + o,、-...Cl —.0.,Rro

CHjCl21..■ ?
Cl....-'—-0Ya-R.!.°、r0'z-.a + N aN.j N1.-.'.,0、「0 R:s.0丫0'..-■.......m3.(4)制備基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束:惰性氣氛中，以疏水性抗癌藥物、步驟(2)制備的葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物和步驟(3)制備的疊氮基封端的酸敏感小分子為原料，在端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑、催化劑配體及還原性物質存在下，以水IN, 二甲基甲酰胺混合液為溶劑，于25?40°C反應18?30小時，得到基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束；
所述葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的炔基、疊氮基封端的酸敏感小分子、端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑、催化劑配體及還原性物質的摩爾比為1: 0.5:1: (I?2): (I ?2)。
[0013]上述技術方案中,所述惰性氣氛為氮氣或氬氣氣氛。
[0014]上述技術方案中，所述步驟(3)中制備氯官能團封端的小分子時以無水二氯甲烷為溶劑。
[0015]上述技術方案中，所述步驟(4)中疏水性抗癌藥物與葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的質量比為1: (2?10)。
[0016]上述技術方案中，所述步驟(4)中疏水性抗癌藥物選自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、阿柔比星、吡柔比星、鹽酸柔紅霉素、司莫司汀、普卡霉素、絲裂霉素、伊達比星或左旋咪唑中的一種；端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑選自氯化亞銅、溴化亞銅或碘化亞銅中的一種；催化劑配體選自聯吡啶、五甲基二亞乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亞乙基四胺中的一種；還原性物質選自維生素C、抗壞血酸鈉、抗壞血鈣或檸檬酸中的一種。
[0017]上述技術方案中，所述步驟(I)?(4)完成后，分別對產物進行提純處理，所述提純過程包括以下步驟:
1)聚磷酸酯嵌段共聚物的提純:開環聚合反應結束后，將反應產物旋蒸濃縮，再將濃縮液滴入甲醇/乙醚混合液中沉淀，倒出上清液，將剩余黏稠液體溶于甲醇溶液中，再轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，然后冷凍干燥，得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
2)葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的提純:反應結束后，將反應液抽濾、濃縮，將濃縮液轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，取出，冷凍干燥，再用二氯甲烷溶解、過濾、濃縮，得到淡黃色黏稠液體，將所得淡黃色黏稠液體在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物；
3)小分子的提純:
(I)氯官能團封端的小分子的提純:反應結束后，加入質量分數為5%的碳酸鈉水溶液終止反應，用二氯甲烷稀釋，再加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有機相，有機相溶液經干燥、過濾、濃縮，常壓蒸餾，將蒸餾剩余產物在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到淡黃色液體，為氯官能團封端的小分子;
(2)疊氮基封端的酸敏感小分子的提純:反應結束后，將反應產物過濾、濃縮，再將濃縮液溶于二氯甲烷溶液中，加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有機相，有機相溶液經干燥、過濾、濃縮，采用薄層層析法分離得到淡黃色液體，將所得產物在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到疊氮基封端的酸敏感小分子；
4)基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束的提純:點擊反應結束后，將反應產物轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，定容，得到基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束。
[0018]上述技術方案中，所述飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液的pH值為10.0。
[0019]本發明還請求保護由上述制備方法制備得到的基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束。該載藥膠束以酸敏感小分子的疊氮基與磷酸酯嵌段聚合物的炔基為交聯點，形成交聯結構。
[0020]本發明公開的核交聯載藥膠束中，葉酸修飾的兩親性聚磷酸酯嵌段共聚物具有良好的生物相容性及生物可降解性，其含有親水和疏水鏈段，可通過自組裝包載疏水性抗癌藥物；所形成的載藥膠束采用含有縮醛基的功能性分子將疏水部分進行化學交聯，制備結構穩定的核交聯載藥膠束。在體內循環過程中，化學交聯結構有效的延長了體內循環時間，而葉酸靶向介導進入癌細胞后，在細胞內酸性條件下，縮醛基斷裂，載藥膠束的化學交聯點破壞，在溶酶體內水解酶的存在下，聚磷酸酯水解，導致膠束的核-殼結構破壞，釋放出所包載藥物，可以用作高效可控藥物釋放體系。
[0021]由于上述方案運用，本發明與現有技術相比，具有以下優點:
1.本發明首次采用“一鍋法”思路，將開環聚合(ROP)和端炔基與疊氮的環加成反應(CuAAC)聯用，合成了基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束；該膠束以具有良好生物相容性和生物可降解性的聚磷酸酯分別作為其親水和疏水鏈段，在水溶液中可以自組裝形成膠束，疏水性內核可以用于包載疏水性抗癌藥物。
[0022]2.本發明將靶向分子葉酸鍵合到兩親性共聚物末端，在細胞內吞過程中介導載藥膠束進入癌細胞，增加藥物利用率。
[0023]3.本發明采用酸敏感分子對獲得的葉酸靶向的兩親性聚磷酸酯嵌段共聚物進行化學交聯，延長膠束在體內循環時間，而且核交聯膠束含有的酸敏感縮醛基位點在酸性環境下斷裂，聚磷酸酯主鏈在酶存在下可以水解，導致膠束結構破壞，釋放出所包載藥物，達到治療腫瘤的目的；因此，本發明公開的核交聯載藥膠束可以用作高效可控釋放藥物體系，在生物材料及生物醫藥領域具有良好的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為實施例一中聚磷酸酯嵌段共聚物(PbYP43-A-PEOP41-OH)的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿(CDCl3);
圖2為實施例二中葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物(PBYP43-6-PE0P41-FA)、實施例一中聚磷酸酯嵌段共聚物(PbYP43-A-PEOP41-OH)和葉酸(FA)的紫外光譜圖，溶劑為乙醇；
圖3為實施例三中氯官能團封端的酸敏感四甘醇(Cl-a-TEG-a-Cl)和疊氮基封端的酸敏感四甘醇(N3-a-TEG-a-N3)的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿(⑶Cl3)；
圖4為實施例三中N3-a-TEG-a-N3的核磁共振碳譜圖，溶劑為氘代氯仿(⑶Cl3)；
圖5為實施例五中酸敏感核交聯(ACCL)膠束的透射電鏡照片和動態光散射曲線；
圖6為實施例五中酸敏感核交聯(ACCL)膠束的核磁共振氫譜圖，溶劑為氘代氯仿(CDCl3)；
圖7為實施例七中葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束的透射電鏡照片和動態光散射曲線；
圖8為實施例十中葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束在不同pH值條件下的累計藥物釋放曲線；
圖9為實施例1^一中未交聯膠束(A)和交聯膠束(B)對L929細胞的毒性測試圖及葉酸靶向交聯膠束對KB細胞的毒性測試圖(C)；
圖10為實施例1^一中游離的阿霉素(DOX)、葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束和酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束對KB細胞的細胞毒性曲線；
圖11為實施例十二中KB細胞對有無葉酸靶向的酸敏感核交聯載藥膠束的內吞照片圖。

【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
實施例一:聚磷酸酯嵌段共聚物(PBYP4-PE0P-0H)的制備
將裝有攪拌子的安瓿瓶放在120°C烘箱中干燥至少24小時，取出，將安培瓶連接到雙排管上，用油泵抽冷至常溫，重復抽充氣三次，最后充滿氮氣，在氮氣保護下，往安瓿瓶中依次加入 1，8-二氮雜二環[5.4.0] i^ — 碳-7-烯(DBU，0.2738 g,0.18 mmol)、二氯甲烷(CH2Cl2,1.5 mL)、異丙醇(ΙΡΑ，0.1121 g，0.12 mmol)和單體 2-炔丁基-2-氧代-1，3，2-二氧磷雜環戊烷(BYP，0.8453 g，4.8 mmol )，將反應瓶放入設定為25°C油浴內，攪拌下反應30分鐘。反應結束后，再加入單體2-乙基-2-氧代-1，3，2-二氧磷雜環戊烷(Ε0Ρ，
0.73 g，4.8 mmol)，繼續于25°C油浴內反應30分鐘。
[0026]開環反應結束后，將產物濃縮，再將濃縮液滴入體積比為1: 10的甲醇/乙醚混合液(100 mL)中沉淀兩次，傾出上清液，將所得黏稠液體溶于甲醇溶液中，再轉移到截留分子量為3500 g-moF1透析袋內，置于去離子水中透析24小時，冷凍干燥，得到黏稠狀液體，即為聚磷酸酯嵌段共聚物(PBYP43-6-PE0P41-0H)，產率81.3%。采用核磁共振氫譜(1H NMR)對其進行表征，附圖1為上述PbYP43-A-PEOP41-OH的核磁共振氫譜(1H NMR)圖，驗證了聚磷酸酯嵌段共聚物的化學結構。
[0027]實施例二:葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物(PBYP4-PE0P-FA)的制備
將裝有攪拌子的支管瓶及磨口玻璃塞按照實施例一方法處理后，充滿氮氣，在通氮氣條件下，依次加入葉酸(FA,0.0159 g,0.036 mmol)、二甲亞砜(DMS0,10 mL)、二環己基碳二亞胺(DCC，0.0096 g, 0.0468 mmol)、#-羥基琥珀酰亞胺(NHS，0.0054 g, 0.0468 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.0057 g，0.0468 mmol )。將反應瓶充滿氮氣，于25°C攪拌反應12小時。反應結束后，再稱取PbYP43-A-PEOP41-OH (0.4161 g，0.0300 mmol)加至反應液中，繼續反應24小時。
[0028]反應結束后，將產物轉移到截留分子量為3500 g.mor1透析袋內，在去離子水中透析24小時，冷凍干燥，得到淡黃色黏稠液體，再加入二氯甲烷(100 mL)溶解、過濾、濃縮，將所得黏稠液體在真空烘箱中常溫干燥36小時，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物(PBYP43-6-PE0P41-FA)，產率77.8%。采用紫外分光光度計(UV-Vis)對其進行表征。附圖2為葉酸、PbYP43-^-PEOP41-OH 和 PBYP43-6_PE0P41-FA 的紫外光譜圖。在波長 220 ?400 nm范圍內，葉酸的最大吸收峰在283 nm, ΡΒΥΡ43-6_ΡΕ0Ρ41-0Η在該范圍內沒有最大吸收峰，而PbYP43-^-PEOP41-FA的最大吸收峰在278 nm，這是由于葉酸上羧基與聚磷酸酯上羥基鍵合后助色基團發生改變，導致葉酸的吸收峰藍移。
[0029]實施例三:疊氮基封端的酸敏感四甘醇(N3-a-TEG-a-N3)的制備
稱取四甘醇(TEG，0.97 g，5 mmol)和4-甲基苯磺酸吡啶鎗(PPTS，0.2513 g，I mmol)加至裝有磁力攪拌子的100 mL支管瓶中，加入甲苯(20 mL)，共沸除水兩次，再將共沸混合物溶于無水二氯甲烷(30 mL)，在冰水浴條件下，緩慢滴加2-氯乙基乙烯基醚(CEVE，2.5 mL,25 mmol)和無水二氯甲燒(10 mL)混合液至支管瓶中，滴加結束后,冰水浴攪拌反應0.5小時。
[0030]反應結束后，加入質量分數為5%的碳酸鈉水溶液終止反應，用二氯甲烷(30 mL)稀釋，再加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液(pH 10.0,10 mL)，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷(20 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥、過濾、濃縮，再加入甲苯(20mL)共沸除去未反應的2-氯乙基乙烯基醚，將所得淡黃色液體在真空烘箱中常溫干燥36小時，得到氯官能團封端的酸敏感四甘醇(Cl-a-TEG-a-Cl)，產率74.9%。
[0031]將Cl-a-TEG-a-Cl (1.025 g,2.5 mmol )、疊氮化鈉(NaN3, 1.625 g，25 mmol)和 Λ； 二甲基甲酰胺(DMF，10 mL)依次加至50 mL圓底燒瓶中，將反應瓶移至60°C油浴中，攪拌反應40小時。
[0032]反應結束后，將產物過濾、濃縮，再將濃縮液溶于二氯甲烷(100 mL)中，加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液(pH 10.0,10 mL)，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷(20 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥、過濾、濃縮，采用薄層層析法分離得到淡黃色液體，將所得產物在真空烘箱中常溫干燥36小時，得到疊氮基封端的酸敏感四甘醇(N3-a-TEG-a-N3)，產率72.2%。采用核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)對產物進行表征，附圖3中(A)和(B)分別為Cl-a-TEG-a-Cl和N3-a-TEG-a_N3的核磁共振氫譜(1H NMR)圖，附圖4為Cl-a-TEG-a-Cl的核磁共振碳譜(13C NMR)圖，結果證明，成功制備了實施例三中兩種功能性分子。
[0033]實施例四:未核交聯(UCCL)膠束的制備
將PBYP434-PE0P41-0H (0.010 g)和Ar, 二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mL.h-1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時。
[0034]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g-moF1的透析袋內，置于去離子水中透析24小時，將透析后的溶液定容至25 mL，得到未核交聯(UCCL)膠束。
[0035]實施例五:酸敏感核交聯(ACCL)膠束的制備
將 PbYP43J-PEOP41-OH (0.010 g，0.72 mmol)、N3-a-TEG_a-N3 (6.5 mg,0.0155 mmol)和#，二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mL.!!—1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時，再依次加入溴化亞銅(CuBr, 4.4 mg,0.031 mmol)、五甲基二亞乙基三胺(PMDETA, 1.3 mL,0.062 mmol )和維生素C (5.5 mg,0.031 mmol)，密封、抽充氣三次。將反應瓶充滿氮氣并移至25°C油浴中，攪拌反應24小時。
[0036]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g-moF1的透析袋內，置于去離子水中透析24小時，將透析后的溶液用水定容至25 mL，得到酸敏感核交聯(ACCL)膠束。分別采用透射電鏡(TEM)和動態光散射儀(DLS)對膠束形貌和粒徑大小進行表征，附圖5為酸敏感核交聯膠束在去離子水中的自組裝的透射電鏡照片(A)和動態光散射曲線(B)，結果表明，酸敏感核交聯膠束在水溶液中呈球形結構，粒徑在160納米左右。采用核磁共振氫譜(1H NMR)對核交聯結構進行表征，附圖6為酸敏感核交聯膠束的核磁共振氫譜(1H NMR)圖，交聯反應后，PBYP鏈段和TEG分子上的質子峰強度很小，而PEOP鏈段質子峰強度基本沒有變化，結果證明，成功制備了酸敏感核交聯網狀結構。
[0037]實施例六:葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)膠束的制備
將 PbYP43J-PEOP41-FA (0.010 g,0.72 mmol)、N3-a-TEG_a-N3 (6.5 mg,0.0155 mmol)和#，二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mL.!!—1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時，再依次加入溴化亞銅(CuBr, 4.4 mg,0.031 mmol)、五甲基二亞乙基三胺(PMDETA, 1.3 mL,0.062 mmol)和維生素C (5.5 mg，0.031 mmol)，密封、抽充氣三次。將反應瓶充滿氮氣并移至25°C油浴中，攪拌反應24小時。
[0038]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g.mor1的透析袋內，置于去離子水中透析24小時，將透析后的溶液用水定容至25 mL，得到葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)膠束。
[0039]實施例七:采用透析法制備包載抗癌藥物的核交聯膠束
將 PbYP43-A-PEOP41-OH 或 PBYP43-6-PE0P41-FA (0.010 g，0.72 mmol)、N3-a-TEG_a-N3(6.5 mg,0.0155 mmol)和Λ； 二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，量取0.4 mL抗癌藥物阿霉素(DOX)的二甲基亞砜(DMSO)溶液(5 mgmL-1)加至混合溶液中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mMh-1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時,再依次加入溴化亞銅(4.4 mg, 0.031 mmol )、五甲基二亞乙基三胺(1.3 mL,
0.062 mmol)和維生素C (5.5 mg，0.031 mmol)，密封、抽充氣三次。將反應瓶充滿氮氣并移至25°C油浴中，攪拌反應24小時。
[0040]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g-moF1的透析袋內，在去離子水中透析24小時，將透析后的溶液定容至25 mL,分別得到酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束和葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束。分別采用透射電鏡和動態光散射對載藥膠束形貌和粒徑大小進行表征，附圖7為葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束在去離子水中的自組裝的透射電鏡照片(A)和動態光散射曲線(B)，結果表明，載藥膠束在水溶液中呈球形結構,粒徑在165納米左右。
[0041]實施例八:采用透析法制備包載抗癌藥物的核交聯膠束
將 PBYP43-辦-PEOP41-FA (0.010 g,0.72 mmol)、N3-a-TEG_a-N3 (6.5 mg,0.0155 mmol)和A； 二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，量取I mL抗癌藥物紫杉醇(PTX)的二甲基亞砜(DMSO)溶液(5 mg-mr1)加至混合溶液中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mL.!!—1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時，再依次加入溴化亞銅(4.4 mg, 0.031 mmol)、五甲基二亞乙基三胺(1.3 mL, 0.062 mmol)和維生素C (5.5mg, 0.031 mmol )，密封、抽充氣三次。將反應瓶充滿氮氣并移至25°C油浴中，攪拌反應24小時。
[0042]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g-moF1的透析袋內，在去離子水中透析24小時，將透析后的溶液定容至25 mL，得到葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束。
[0043]實施例九:采用透析法制備包載抗癌藥物的核交聯膠束
將 PBYP43-辦-PEOP41-FA (0.010 g,0.72 mmol)、N3-a-TEG_a-N3 (6.5 mg,0.0155 mmol)和#，二甲基甲酰胺(2 mL)加至裝有攪拌子的圓底燒瓶中，量取0.2 mL抗癌藥物左旋咪唑(LMS)的二甲基亞砜(DMSO)溶液(5 mgmr1)加至混合溶液中，在持續攪拌下，用微量進樣器以緩慢速度(3 mL.!!—1)加入去離子水(20 mL)，待完全進樣后，攪拌12小時，再依次加入溴化亞銅(4.4 mg, 0.031 mmol)、五甲基二亞乙基三胺(1.3 mL, 0.062 mmol)和維生素C(5.5 mg,0.031 mmol)，密封、抽充氣三次。將反應瓶充滿氮氣并移至25°C油浴中，攪拌反應24小時。
[0044]反應結束后，將反應液轉移到截留分子量為3500 g-moF1的透析袋內，在去離子水中透析24小時，將透析后的溶液定容至25 mL，分別得到酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束和葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束。
[0045]實施例十:酸敏感核交聯膠束包載抗癌藥物阿霉素的體外釋放實驗
取5 mL實施例五制備的葉酸靶向核交聯載藥膠束溶液于截留分子量為12000?14000g-moF1的透析袋中，將該透析袋放入容量為30 mL的離心管內，外部加入不同pH值的緩沖溶液(20 mL)，將離心管置于37°C恒溫振蕩器中進行釋放實驗。每隔一段時間取5 mL透析袋外部溶液，同時補充5 mL相同pH值的緩沖溶液。采用熒光分光光度計檢測釋放阿霉素的含量。載有阿霉素的葉酸靶向酸敏感核交聯膠束在不同PH條件下的累計釋放曲線如附圖8所示，結果表明，藥物在pH 5.0條件下釋放速率明顯快于pH 7.4，可見載藥膠束具有一定的酸敏感性，可以達到藥物可控釋放效果。
[0046]實施例1^一:細胞毒性測試
細胞毒性測試選用人體成纖維細胞(L929 cells)和人鼻咽癌細胞(KB cells)進行，L929細胞培養在加有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，放于37°C，5% CO2,相對濕度為90%的培養箱中培養。選擇處于生長活躍期的細胞接種于每孔含100 μ L DMEM培養基的96孔板中，培養24小時。KB細胞在不含葉酸的RPM1-1640(-)FA培養基中培養兩周以上，再進行實驗。
[0047]配置一定濃度的待測樣品溶液:未核交聯(UCCL)膠束，1000 mg-Γ1 ;酸敏感核交聯(ACCL)膠束，1000 mg-Γ1 ;葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)膠束，1000 mg-Γ1 ;阿霉素，30 mg.!/1 ;葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束，阿霉素濃度為30 mg-Γ1 ;酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束，阿霉素濃度為30 mg.!/1。將一系列不同濃度樣品溶液加入到96孔板中，繼續培養48小時；接著加入25 μ L的MTT試劑，進一步培養4小時后，用酶標儀(B1-Rad 680)在570納米下測量對應的吸光度。按照如下公式計算細胞存活率:
細胞存活率(Cell viability) (%) = [A]test/[A]control X 100式中，[A]test為加有待測樣品條件下測得的吸光度，[AJcontrol為不加樣品空白對照條件下測得的吸光度。每個樣品測試三次，取其平均值。
[0048]附圖9中(A)、(B)和(C)分別為未核交聯(UCCL)膠束及葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)膠束對L929細胞的毒性測試以及葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)膠束對KB細胞的毒性測試，結果表明，兩種聚合物膠束具有較低的毒性和良好的生物相容性；
附圖10為游離的阿霉素(D0X)、葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束和酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束對KB細胞的毒性測試結果，表明隨著阿霉素濃度的增加，樣品殺死癌細胞的能力不斷增強，而且，在相同阿霉素濃度下，載藥膠束比游離阿霉素具有更強殺死癌細胞的能力，且葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束具有最強的抗癌效果。
[0049]實施例十二:細胞內吞測試
KB細胞培養在加有10%胎牛血清(FBS)的RPM1-1640(-)FA培養基中，放于37°C，5%CO2，相對濕度為90%的培養箱中培養。選擇處于生長活躍期的細胞接種于底厚為0.17 mm的玻璃底培養皿中，培養12小時使其貼壁。將培養皿轉移到活細胞工作站的細胞培養系統中，采用含有10 mL載藥膠束溶液(葉酸靶向酸敏感核交聯(ACCL-FA)載藥膠束、酸敏感核交聯(ACCL)載藥膠束，阿霉素濃度:30 mg.!/1)的培養基(I mL)置換出培養皿中的培養基(最終阿霉素濃度:0.3 mg.!/1)，采用活細胞工作站檢測細胞對載藥膠束的內吞過程。附圖11為KB細胞對有無葉酸靶向的酸敏感核交聯載藥膠束的內吞照片，結果表明，葉酸靶向的酸敏感核交聯載藥膠束比沒有葉酸修飾的載藥膠束進入KB細胞的速度更快。
【權利要求】
1.一種基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備聚磷酸酯嵌段共聚物:惰性氣氛中，在1，8-二氮雜二環[5.4.0] i^ —碳-7-烯的催化作用下，以二氯甲烷為溶劑，在10?50°C條件下，以異丙醇為引發劑，以環狀磷酸酯為單體進行開環聚合，反應30秒?60分鐘；再加入環狀磷酸酯單體JO OQtftJi2，繼續反應30秒?60分鐘；得到聚磷酸酯嵌段共聚物； 環狀磷酸酯單體結構式中，R1為CH2或CH2CH2 ；R2為甲基、乙基、異丙基、丁基或單甲基封端的聚環氧乙烷基中的一種，所述單甲基封端的聚環氧乙烷基的化學結構式為=(CH2CH2O)xCH3,式中 X = 2 ?10 ;m = 20 ?90，η = 20 ?90 ;所述引發劑、及1，8- 二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯的摩爾比為 1: (20 ?90): (20 ?90): (0.1 ?2); (2)制備葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物:在二環己基碳二亞胺的催化作用下，以葉酸和羥基琥珀酰亞胺為原料，以二甲亞砜為溶劑，在4-二甲氨基吡啶的存在下，于10?40°C反應8?16小時，再加入步驟(I)制備的聚磷酸酯嵌段共聚物，攪拌，繼續反應8?48小時，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物； 所述聚磷酸酯嵌段共聚物、葉酸、羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺及4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1: (I?2): (1.2?3): (1.2?3): (0.1?I); (3)制備疊氮基封端的酸敏感小分子:在4-甲基苯磺酸吡啶鎗的催化作用下，以HO-R3-OH和2-氯乙基乙烯基醚為原料，在冰水浴條件下，反應0.5?I小時，制備氯官能團封端的小分子；然后將上述氯官能團封端的小分子、疊氮化鈉加入#，二甲基甲酰胺溶液中，于40?80°C反應30?50小時，得到疊氮基封端的酸敏感小分子；
所述 HO-R3-OH 中，R3 為(CH2CH2O)yCH2CH2，其中 y = O ?7 ; 所述氯官能團封端的小分子的結構式為丫 aWaYaVi1; 所述H0-R3-0H、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎗的摩爾比為1: (4?20): (0.1 ?0.5)； 所述氯官能團封端的小分子與疊氮化鈉的摩爾比為1: (4?40); (4)制備基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束:惰性氣氛中，以疏水性抗癌藥物、步驟(2)制備的葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物和步驟(3)制備的疊氮基封端的酸敏感小分子為原料，在端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑、催化劑配體及還原性物質存在下，以水IN, 二甲基甲酰胺混合液為溶劑，于25?40°C反應18?30小時，得到基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束； 所述葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的炔基、疊氮基封端的酸敏感小分子、端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑、催化劑配體及還原性物質的摩爾比為1: 0.5:1: (I?2): (I ?2)。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中制備氯官能團封端的小分子時以無水二氯甲烷為溶劑。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中疏水性抗癌藥物與葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的質量比為1: (2?10)。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中端炔基與疊氮的環加成點擊反應催化劑選自氯化亞銅、溴化亞銅或碘化亞銅中的一種；催化劑配體選自聯吡啶、五甲基二亞乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亞乙基四胺中的一種。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中疏水性抗癌藥物選自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、阿柔比星、卩比柔比星、鹽酸柔紅霉素、司莫司汀、普卡霉素、絲裂霉素、伊達比星或左旋咪唑中的一種。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中還原性物質選自維生素C、抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣或檸檬酸中的一種。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述惰性氣氛為氮氣或氬氣氣氛。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)?(4)反應完成后，分別對產物進行提純處理，所述提純過程包括以下步驟: 1)聚磷酸酯嵌段共聚物的提純:開環聚合反應結束后，將反應產物旋蒸濃縮，再將濃縮液滴入甲醇/乙醚混合液中沉淀，倒出上清液，將剩余黏稠液體溶于甲醇溶液中，再轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，然后冷凍干燥，得到聚磷酸酯嵌段共聚物； 2)葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物的提純:反應結束后，將反應液抽濾、濃縮，將濃縮液轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，取出，冷凍干燥，再用二氯甲烷溶解、過濾、濃縮，得到淡黃色黏稠液體，將所得淡黃色黏稠液體在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到葉酸修飾的聚磷酸酯嵌段共聚物； 3)小分子的提純: (1)末端修飾縮醛基的小分子的提純:反應結束后，加入質量分數為5%的碳酸鈉水溶液終止反應，用二氯甲烷稀釋，再加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有機相，有機相溶液經干燥、過濾、濃縮，常壓蒸餾，將蒸餾剩余產物在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到淡黃色液體，為末端修飾縮醛基的小分子; (2)疊氮基封端的酸敏感小分子的提純:反應結束后，將反應產物過濾、濃縮，再將濃縮液溶于二氯甲烷溶液中，加入飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液，振蕩后靜置，分出下層有機相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有機相，有機相溶液經干燥、過濾、濃縮，采用薄層層析法分離得到淡黃色液體，將所得產物在真空烘箱中常溫干燥24?36小時，得到疊氮基封端的酸敏感小分子； 4)基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束的提純:點擊反應結束后，將反應產物轉移到透析袋內，置于去離子水中透析24?72小時，定容，得到基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述飽和氯化鈉磷酸緩沖溶液的pH值為10.0。
10.根據權利要求1?9所述的任意一種制備方法制備得到的基于聚磷酸酯的葉酸靶向酸敏感核交聯載藥膠束。
【文檔編號】A61K47/34GK104173282SQ201410366013
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】倪沛紅, 胡健, 何金林, 張明祖 申請人:蘇州大學