本發明屬于藥物載體、制備方法及其應用，特別屬于化療藥物及小分子干擾rna共輸送載體、制備方法及應用。

背景技術：

化療一直是癌癥治療的主要手段，但是化療藥物的體內非靶向分散使得藥物在作用于腫瘤組織的同時，損傷了機體內的其他正常組織器官，從而產生多種化療副作用,加上腫瘤細胞的多藥耐藥性特征，使得化療的臨床療效不盡如人意。腫瘤細胞的多藥耐藥性主要體現在其細胞膜上有能量依賴型藥物外排泵，可將進入細胞膜的小分子藥物泵出膜外，以及腫瘤細胞的抗凋亡機制，抑制了腫瘤細胞的正常凋亡。小干擾rna技術可以有效抑制腫瘤細胞的多藥耐藥性，通過抑制和干擾與多藥耐藥性相關的基因表達，實現腫瘤細胞的藥物外排和抗凋亡抑制。但是小干擾rna技術的應用同樣存在體內非靶向分布、難導入細胞和血液中運輸易被降解的問題。

技術實現要素：

本發明要解決的第1個技術問題是提供一種具有腫瘤組織主動靶向及血液運輸中不易降解的化療藥物和生物藥物靶向共輸送載體。

本發明所要解決的第2個問題是上述載體的制備方法。

本發明所要解決的第3個問題是上述載體的應用。

本發明解決技術問題的技術方案為：一種藥物靶向輸送載體，其結構式如下：

所述的r'為-h或(季銨鹽)或(葉酸根)或(生物素根)。

所述的載體結構式的分子量為n＝160-1600,r'中季銨鹽、葉酸根、生物素根的取代度均不為0。

優選的季銨鹽的取代度為0.59，葉酸根的取代度為0.64，生物素根的取代度為0.72。

所述的取代度為馬鈴薯淀粉中每個葡萄糖單元所修飾的取代基的殘基數。

所述的載體的粒徑分布區間為89-183nm，平均粒徑約100-110nm。

本發明的制備方法包括以下步驟：

a)季銨化淀粉的制備步驟：

將馬鈴薯淀粉充分浸潤于異丙醇中，形成淀粉異丙醇溶液，馬鈴薯淀粉與異丙醇的重量(g)/體積比(ml)為5:(3-5)；

將質量濃度為50-60％醚化劑3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(cta)與質量濃度為40-42％的naoh溶液室溫混合，高速攪拌15-30分鐘，生成2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)溶液，3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨與naoh的摩爾比為1：1-1.5；

將生成的2，3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)倒入淀粉異丙醇溶液中，在室溫的條件下，高速攪拌1-2小時，得到混合物，將混合物密封置于60-70℃反應4-6小時，冷卻至室溫即生成白色季銨化淀粉初產物，加入無水乙酸中和至ph6-8，再通過真空抽濾將季銨化淀粉初產物用無水乙醇洗滌，直至濾液中滴入硝酸銀沒有氯化銀沉淀即可；抽濾產物置于35℃烘箱干燥至恒重，即得到季銨化淀粉；淀粉葡萄糖單元與2,3-環氧丙基三甲基氯化銨的摩爾比為1：1-1.2；

b)納米粒的制備步驟：包括b1酯化步驟、b2透析步驟、b3洗滌及干燥步驟，b4分散步驟；

所述的b1酯化步驟為將a步驟制備的季銨化淀粉、生物素、葉酸、n,n′-二環己基碳二亞胺(dcc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和4-二甲氨基吡啶(dmap)混合溶于二甲亞砜，室溫下攪拌24-48小時后，酯化生成葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物(fbqs)；所述季銨化淀粉、生物素、葉酸、n,n′-二環己基碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺和4-二甲氨基吡啶的質量比為(2.5—4):(1.5—2):(2.5—4):(2.5—4):(2.5—4):1.5；

所述的b2透析步驟為將b1酯化步驟所制的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物裝入分子截流量為8000-14000da的透析袋，浸入去離子水中透析3天，第一天每4小時換一次新鮮的去離子水，后面是一天換一次去離子水，透析產物取出進行真空抽濾；

所述的b3洗滌及干燥步驟為將b2透析步驟抽濾好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物繼續通過真空抽濾的方法用無水乙醚和去離子水交替洗滌3次，再于35℃干燥至恒重；

所述的b4分散步驟為將b3洗滌及干燥步驟制備好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物分散于去離子水中，用探針型超聲波儀超聲處理3-5分鐘，經0.22微米微孔濾膜過濾除去灰塵和其它雜質，得到葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒懸浮濾液，通過真空冷凍(真空度為1pa，溫度為-50℃)干燥得到納米顆粒凍干粉；葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物與去離子水的重量(g)/體積(ml)比為1：800-1000。

所述的室溫為20-25攝氏度。

所述的載體作為化療藥物和生物藥物共載體的應用。

所述的化療藥物為疏水性、分子量小于1000的藥物，比如阿霉素和紫杉醇。

所述的生物藥物為分子量為13–15μg/nmol的干擾rna，如survivin基因的小干擾rna(sirna^sur)或者bcl-2基因的小干擾rna(sibcl-2)。

本發明所制的藥物載體是一種自聚的陽離子核殼型納米微粒，是通過n,n′-二環己基碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺和4-二甲氨基吡啶催化的“一步法”方法酯化反應合成。當生物素與其它生物分子通過酯鍵或者酰胺鍵共價連接時，它的水溶性因失去了親水的羧基而急劇降低，生物素因此可以作為疏水基團形成自聚的納米粒子。

藥物載體的疏水內核可以包載小分子疏水性化療藥物，其正電荷的親水外殼可以靜電吸附負電荷的小分子sirna。另外，葉酸與葉酸受體之間的特異性結合使葉酸可以作為靶向配基與納米微粒共價結合，納米粒子對葉酸受體過表達的腫瘤細胞均具有特異性主動靶向作用。；疏水性抗癌藥物阿霉素和sirna分別通過疏水作用和靜電吸附作用被包載進葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒中，且表現出良好的血清穩定性。化療藥物和sirna的釋放行為都是ph敏感型，在酸性環境下的釋放量和釋放速度都明顯高于和快于堿性環境中。

本發明與現有技術相比，所制備的藥物載體具有無毒、生物相容性好、形態結構穩定，納米粒粒徑分布區間為89-183nm，平均粒徑約為109nm,有利于穿透腫瘤組織；高的載藥量和包封率，能有效包載疏水性抗腫瘤藥物。通過季銨化淀粉的陽離子基團和sirna上的磷酸基團發生靜電吸附作用，有效包載sirna，并在血液中有效保護sirna的完整性。藥物和sirna共載體對腫瘤組織具有主動靶向輸送作用，解決了小分子抗腫瘤藥物和sirna沒有腫瘤組織靶向作用的難題，藥物和sirna共載納米粒可以較長時間滯留腫瘤組織，長時間釋放藥物和sirna，可實現藥物和sirna對腫瘤組織的聯合治療，同時降低對正常組織的毒副作用。

附圖說明

圖1葉酸(a)、生物素(b)、季銨化淀粉(c)和葉酸-生物素-季銨化淀粉(d)的傅里葉紅外光譜圖

圖2馬鈴薯淀粉(a)和葉酸-生物素-季銨化淀粉(b)的1h-nmr圖譜。

圖3實施例1所制的納米微粒的電鏡照片及粒徑分布動態光散射圖。

圖4實施例1所制的納米微粒的芘熒光光譜i386/i374的比值直線圖(臨界自聚濃度圖)。

圖5不同載體/藥物質量比下實施例5所制的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒的dox載藥量和包封率示意圖。

圖6不同載藥納米粒/sirna^sur質量比下實施例6所制的載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒和游離sirna^sur鏈接能力凝膠電泳圖。

圖7實施例6所制的sirna^sur和藥物共載的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒與裸sirna^sur的血清穩定性凝膠電泳圖。

圖8不同ph條件下實施例6所制的sirna^sur和阿霉素共載的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒的dox(a)和sirna^sur累積釋放圖(b)。

具體實施例

下面結合實施例對本發明作詳細的說明。

本發明的高速攪拌是指攪拌速度為800-1000轉/分鐘。

實施例1：

葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒制備

實驗原理如下，

具體制備方法如下：

a)季銨化淀粉的制備步驟：

20克馬鈴薯淀粉充分浸潤于12ml異丙醇中，形成淀粉異丙醇溶液；

將5.925克naoh溶于8.24克去離子水中，形成naoh溶液，再將38.7克60％wt.的醚化劑cta倒入naoh溶液中，高速攪拌15分鐘，生成2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)溶液；

將生成的2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)倒入淀粉異丙醇溶液中在室溫的條件下，高速攪拌1小時，得到混合物，將混合物被密封置于65℃反應4小時，冷卻至室溫即生成白色季銨化淀粉初產物，加入無水乙酸中和至ph6-8，再通過真空抽濾將季銨化淀粉初產物用無水乙醇洗滌，直至濾液中滴入硝酸銀沒有氯化銀沉淀即可，抽濾產物置于35℃烘箱干燥至恒重，即得到季銨化淀粉。

b)納米粒的制備步驟：包括b1酯化步驟、b2透析步驟、b3洗滌及干燥步驟，b4分散步驟；

所述的b1酯化步驟為將a步驟制備的4g季銨化淀粉、1.5g生物素、4g葉酸、4gn,n′-二環己基碳二亞胺、4gn-羥基琥珀酰亞胺和1.5g4-二甲氨基吡啶混合溶于150ml二甲亞砜，室溫下攪拌24h，以dcc、nhs和dmap為脫水劑和催化劑，葉酸和生物素上的羧基分別被活化后脫掉氫氧鍵，季銨化淀粉的羥基脫掉氫鍵，葉酸、生物素和季銨化淀粉經催化發生酯化反應，生成葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物(fbqs)。

所述的b2透析步驟為將b1酯化步驟所制裝入分子截流量為8000-14000da的透析袋，浸入去離子水中透析3天，第一天每4小時換一次新鮮的去離子水，后面是一天換一次去離子水，透析產物取出進行真空抽濾；

所述的b3洗滌及干燥步驟為將b2透析步驟過濾好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物用乙醚和去離子水交替洗滌3次，再通過烘箱35℃干燥至恒重；

所述的b4分散步驟為將0.2克b3洗滌及干燥步驟制備好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物分散于200ml去離子水中，用探針型超聲波儀在100w功率下超聲處理3分鐘，經0.22微米微孔過濾器過濾除去灰塵和其它雜質，得到葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒懸浮濾液，通過真空冷凍干燥(真空度為1pa，溫度為-50℃)得到納米顆粒凍干粉。

實施例1所制的葉酸-生物素-季銨化淀粉表征：

在圖1的葉酸-生物素-季銨化淀粉的傅里葉紅外光圖譜中，出現在1023cm^-1和1152cm^-1處的吸收帶是淀粉骨架的特征峰，在1510cm^-1和2933cm^-1處的吸收帶是淀粉骨架上的季銨基團(c-n,c-h)特征峰。由于葉酸、生物素通過酯化反應成功與季銨化淀粉偶聯，季銨化淀粉上的3200cm^-1至3600cm^-1區域平緩寬帶在葉酸-生物素-季銨化淀粉的相同區域發生了顯著增強，位于1685cm^-1處的酰胺基伸縮帶被觀察到，1727cm^-1處的碳氧雙鍵(c＝o)特征峰也被明顯增強，1558cm^-1和1606cm^-1處的彎曲震動帶是n-h鍵特征峰，根據以上數據結果初步證實葉酸-生物素-季銨化淀粉被成功合成。

葉酸-生物素-季銨化淀粉的¹h-nmr譜圖(圖2)上，6.60ppm(b)和7.60ppm(a)處的特征峰歸屬于葉酸苯環上的氫原子，1.55-1.85ppm區域內的特征峰歸屬于生物素亞甲基上的氫原子，3.12ppm處的單峰是淀粉骨架上的季銨化基團(ch3-n⁺)的甲基氫原子特征峰，以上結果進一步證實葉酸和生物素被鏈接到季銨化淀粉上。

圖3的透射電子顯微鏡照片顯示：葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒為表面光滑、粒徑均勻的球形結構，其動態光散射法測定的實施例1的納米粒粒徑分布區間為89-183nm，平均粒徑約為109nm。

圖4為不同濃度的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒的芘熒光光譜i386/i374的比值直線圖，以芘為熒光探針，當葉酸-生物素-季銨化淀粉溶液濃度高于其臨界自組裝濃度時，芘的熒光光譜在386nm處的吸光度值有很大增加，而此時374nm處的吸光度值無明顯變化，因此本實驗中用i386/i374的比值來確定葉酸-生物素-季銨化淀粉的臨界自組裝濃度。圖4顯示，葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒的臨界自組裝濃度為33mg/ml。

所制備的藥物載體的季銨鹽的取代度為0.59，葉酸根的取代度為0.64，生物素根的取代度為0.72。

實施例2：

葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒制備

具體制備方法如下：

a)季銨化淀粉的制備步驟：

20克天然馬鈴薯淀粉充分浸潤于16ml異丙醇中，形成淀粉異丙醇溶液；

將5.925克naoh溶于8.24克去離子水中，形成naoh溶液，再將38.7克60％wt.的醚化劑cta倒入naoh溶液中，高速攪拌15分鐘，生成2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)溶液；

將生成的2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)倒入淀粉異丙醇溶液中在室溫的條件下，高速攪拌1小時，得到混合物，將混合物被密封置于65℃反應4小時，冷卻至室溫即生成白色季銨化淀粉初產物，加入無水乙酸中和至ph6-8，再通過真空抽濾將季銨化淀粉初產物用無水乙醇洗滌，直至濾液中滴入硝酸銀沒有氯化銀沉淀即可。抽濾產物置于35℃烘箱干燥至恒重，即得到季銨化淀粉。

b)納米粒的制備步驟：包括b1酯化步驟、b2透析步驟、b3洗滌及干燥步驟，b4分散步驟；

所述的b1酯化步驟為將a步驟制備的3g季銨化淀粉、1.5g生物素、3g葉酸、3gn,n′-二環己基碳二亞胺、3gn-羥基琥珀酰亞胺和1.5g4-二甲氨基吡啶混合溶于150ml二甲亞砜，室溫下攪拌24h，以dcc、nhs和dmap為脫水劑和催化劑，葉酸和生物素上的羧基分別被活化后脫掉氫氧鍵，季銨化淀粉的羥基脫掉氫鍵，葉酸、生物素和季銨化淀粉經催化發生酯化反應，生成葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物(fbqs)。

所述的b2透析步驟為將b1酯化步驟所制裝入分子截流量為8000-14000da的透析袋，浸入去離子水中透析3天，第一天每4小時換一次新鮮的去離子水，后面是一天換一次去離子水，透析產物取出進行真空抽濾；

所述的b3洗滌及干燥步驟為將b2透析步驟過濾好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物用乙醚和去離子水交替洗滌3次，再通過烘箱35℃干燥至恒重；

所述的b4分散步驟為將0.2克b3洗滌及干燥步驟制備好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物分散于200ml去離子水中，用探針型超聲波儀在100w功率下超聲處理3分鐘，經0.22微米微孔過濾器過濾除去灰塵和其它雜質，得到葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒懸浮濾液，通過真空冷凍干燥(真空度為1pa，溫度為-50℃)得到納米顆粒凍干粉。

實施例3:

葉酸-生物素-季銨化淀粉納米微粒制備

具體制備方法如下：

a)季銨化淀粉的制備步驟：

20克天然馬鈴薯淀粉充分浸潤于20ml異丙醇中，形成淀粉異丙醇溶液；

將5.925克naoh溶于8.24克去離子水中，形成naoh溶液，再將38.7克60％wt.的醚化劑cta倒入naoh溶液中，高速攪拌15分鐘，生成2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)溶液；

將生成的2,3-環氧丙基三甲基氯化銨(gta)倒入淀粉異丙醇溶液中在室溫的條件下，高速攪拌1小時，得到混合物，將混合物被密封置于65℃反應4小時，冷卻至室溫即生成白色季銨化淀粉初產物，加入無水乙酸中和至ph6-8，再通過真空抽濾將季銨化淀粉初產物用無水乙醇洗滌，直至濾液中滴入硝酸銀沒有氯化銀沉淀即可。抽濾產物置于35℃烘箱干燥至恒重，即得到季銨化淀粉。

b)納米粒的制備步驟：包括b1酯化步驟、b2透析步驟、b3洗滌及干燥步驟，b4分散步驟；

所述的b1酯化步驟為將a步驟制備的3g季銨化淀粉、2g生物素、2.5g葉酸、2.5gn,n′-二環己基碳二亞胺、3gn-羥基琥珀酰亞胺和1.5g4-二甲氨基吡啶混合溶于150ml二甲亞砜，室溫下攪拌24h，以dcc、nhs和dmap為脫水劑和催化劑，葉酸和生物素上的羧基分別被活化后脫掉氫氧鍵，季銨化淀粉的羥基脫掉氫鍵，葉酸、生物素和季銨化淀粉經催化發生酯化反應，生成葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物(fbqs)。

所述的b2透析步驟為將b1酯化步驟所制裝入分子截流量為8000-14000da的透析袋，浸入去離子水中透析3天，第一天每4小時換一次新鮮的去離子水，后面是一天換一次去離子水，透析產物取出進行真空抽濾；

所述的b3洗滌及干燥步驟為將b2透析步驟過濾好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物用乙醚和去離子水交替洗滌3次，再通過烘箱35℃干燥至恒重；

所述的b4分散步驟為將0.2克b3洗滌及干燥步驟制備好的葉酸-生物素-季銨化淀粉復合物分散于200ml去離子水中，用探針型超聲波儀在100w功率下超聲處理3分鐘，經0.22微米微孔過濾器過濾除去灰塵和其它雜質，得到葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒懸浮濾液，通過真空冷凍干燥(真空度為1pa，溫度為-50℃)得到納米顆粒凍干粉。

實施例4：

載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒制備

葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒用于包載抗腫瘤藥物的制備方法為：阿霉素(dox)為抗瘤譜較廣的腫瘤臨床治療使用的疏水性藥物，以其為例進行葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的載藥制備。

鹽酸阿霉素20mg與其3倍摩爾量的三乙胺混合并溶解于10ml的體積濃度為99％二甲基乙酰胺溶液中，形成鹽酸阿霉素溶液。將實施例1所制的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒0.2克分散于200ml去離子水中，在室溫、探針型超聲波儀在100w功率超聲的條件下，將鹽酸阿霉素溶液滴入葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒溶液中，滴加完成后，再超聲處理3分鐘。超聲完畢后，將上述混合溶液保存在4℃中靜置反應48h，然后將混合溶液置于透析袋(分子截流量為8000-14000da)中，在1/15m,ph7.4的磷酸鹽緩沖液中室溫下透析3天，第一天新鮮的磷酸鹽緩沖液每4小時更換一次，其后每天更換一次，將透析產物通過孔徑為0.22μm微孔濾膜去除有機溶劑和游離阿霉素，收集清澈載藥納米粒懸浮溶液，真空冷凍干燥(真空度為1pa，溫度為-50℃)即得到載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒凍干粉；

實施例5

稱取5mg的鹽酸阿霉素與其3倍摩爾量的三乙胺一同溶于2ml的二甲基乙酰胺溶液中，該溶液制備完全相同的5份。分別將葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒凍干粉20mg，40mg，60mg，80mg，100mg分散于8ml去離子水，將上述5份相同的阿霉素溶液分別滴加到不同的5份納米粒懸浮液中，均超聲處理3分鐘，制備成載藥(阿霉素)葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒dox0，dox1，dox2，dox3，dox4。將上述溶液保存在4℃中靜置反應48h，然后將混合溶液置于透析袋(分子截流量為8000-14000da)中，在1/15m,ph7.4的磷酸鹽緩沖液中室溫下透析3天，第一天新鮮的磷酸鹽緩沖液每4小時更換一次，其后每天更換一次，將透析產物通過孔徑為0.22μm微孔濾膜去除有機溶劑和游離阿霉素，收集清澈載藥納米粒懸浮溶液，真空冷凍干燥(真空度為1pa，溫度為-50℃)即得到5份凍干的載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒dox0，dox1，dox2，dox3，dox4。

將5份凍干的載藥納米粒dox0，dox1，dox2，dox3，dox4分散于去離子水中，分別在室溫下用探針型超聲波儀100w功率超聲3分鐘，再經12000rmp高速離心15min，取每份樣品的上清液，以去離子水為空白對照，用紫外分光光度法在490nm處測定吸光值。根據事先測得的阿霉素標準曲線(y＝10.64x+0.0067,r²＝0.9996)，計算包載的藥物含量，然后再分別計算5份樣品的載藥納米粒的載藥量與藥物包封率：

實驗測得增加阿霉素對納米載體的質量比，阿霉素的載藥量增加，但包封率下降(見圖5)。實施例1所制的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒對阿霉素的載藥量為4-12％，藥物包封率為63-77％。

實施例6：

除化療藥物為紫杉醇外，其余與實施例4相同。實驗測得葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒對紫杉醇的載藥量為3-9％，藥物包封率為59-66％。

實施例7：

藥物和sirna^sur共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒制備

研究表明survivin是迄今發現最強的腫瘤細胞凋亡抑制因子，直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性，以survivin為癌癥基因治療靶基因，聯系國內生物基因公司合成survivin的sirna^sur基因序列5’-gaacaucaucauccaggac-3’和fam-sirna^sur(fam：羧基熒光素)。將1mgsirna^sur與40mg載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒(實施例4)混合懸浮于10ml焦碳酸二乙酯處理過的滅菌水中，混合震蕩15min，靜置30min，12000rmp高速離心15min。去掉上清液，將底部沉淀物真空冷凍干燥，(真空度為1pa，溫度為-50℃)，得到sirna^sur和抗癌藥物共同包載的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒凍干粉，以上過程盡量保持無菌操作。

實施例8：

除小分子干擾rna的靶基因為bcl-2外，其它與實施例7相同。

bcl-2也是一種抑制細胞凋亡的癌基因，以bcl-2為癌癥基因治療靶基因，聯系國內生物基因公司合成bcl-2的sirna基因序列(sirna^bcl-2):5’-guacauccauuauaagcugdtdt-3’。

實施例9：

載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的sirna^sur鏈接能力

為研究載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的sirna鏈接能力，用不同納米粒(實施例4)和sirna^sur的質量比(從10/1到60/1)配制藥物和sirna^sur共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒，離心取上清液進行瓊脂糖凝膠電泳成像(見圖6)，結果顯示當載藥葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒和sirna^sur的質量比達到40/1及以上時，游離的sirna^sur完全被載藥納米粒包載。

實施例10：

sirna^sur和sirna共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的血清穩定性

為了測定sirna^sur和sirna共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的血清穩定性，將sirna^sur和sirna^sur共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒(實施例7)懸浮于50％血清濃度的培養基中，于每個預定時間取出3ml樣品，加入十二烷基硫酸鈉終止核糖核酸酶活性并置換出被納米粒包載的sirna^sur，高速離心后取上清液凍存于-80℃冰箱。當所有預定時間的樣品上清液均取出后，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗，觀察樣品中sirna^sur的完整性，圖7顯示被葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒包載的sirna^sur(實施例7)能夠在血清中保持較好的完整性和穩定性。

實施例11：

阿霉素和sirna^sur共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒的藥物(實施例7)和sirna^sur釋放

稱取3份44mg的鹽酸阿霉素和fam-sirna^sur共載葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒，分別懸浮于3份ph為5.3、6.5和7.4的44ml磷酸鹽緩沖液中。每一份懸浮溶液均被等體積(4ml)分裝和密封與11個離心管中，在37℃下溫和震蕩。于每一個預定的時間，在三組樣品中每組取出一個樣品，高速離心后取出上清液，用熒光分光光度法測定上清液中阿霉素和fam-sirna^sur的吸光值并計算其濃度。阿霉素和fam-sirna^sur的熒光發射波長分別是590nm和518nm，激發波長分別是480nm和492nm，計算出不同時間段的阿霉素和fam-sirna^sur累計釋放量并對應時間作圖。圖8顯示了不同ph(5.3、6.5、7.4)條件下，被納米粒包載的藥物(實施例7)和fam-sirna^sur釋放行為均為ph敏感型。在正常生理環境下(ph7.4)阿霉素和fam-sirna^sur的累積釋放量較少，釋放速率較緩慢，而在腫瘤的酸性環境下(ph5.3)阿霉素和fam-sirna^sur的累積釋放量很大，且釋放速度明顯加快。

以上實驗結果表明本發明制備的葉酸-生物素-季銨化淀粉納米粒形態結構穩定，臨界自組裝濃度低，制作簡單。能有效包載疏水性小分子化療藥物和sirna，具有腫瘤組織主動靶向作用，血液中能有效保護sirna的完整性。本發明對實現腫瘤組織化療和基因治療的聯合療效有良好的應用前景，解決了臨床使用的疏水性抗腫瘤藥物難溶于水以及藥物和sirna沒有腫瘤組織靶向作用的難題，即能增強抗腫瘤藥物和sirna對腫瘤組織的療效，也可以減少抗腫瘤藥物和sirna的用量，降低對正常組織的毒副作用。