本發(fā)明是有關于一種用以制備改善惡病質的組合物的用途，特別為一種用以制備改善惡病質的含硒微生物發(fā)酵液和/或含硒植物萃取液。

背景技術：

近年來，癌癥一直高居全球人類死亡原因的前幾位，其中約30％～87％的癌癥病人會有惡病質(cachexia)的癥狀，而其中又約有22％的癌癥病人死于惡病質而非腫瘤本身。惡病質是癌癥病患體內荷爾蒙、新陳代謝異常，或因食物攝取量減少所產生的結果。再者，癌癥患者若合并化療藥物治療雖可有效的抑制癌細胞生長，然亦伴隨更嚴重的肌肉及脂肪的流失。

再者，亦有一些研究亦指出，硒可有效抑制乳癌、肺癌、小腸癌、大腸癌及肝癌的癌細胞生長，并引發(fā)癌細胞的程序性凋亡(apoptosis)。一些研究亦顯示，于惡病質的治療上，營養(yǎng)的補給并不能減緩病患體重的減少，例如癌癥末期的患者，就算患者增加進食的量或提高營養(yǎng)的攝取，也無法預防或阻止患者體重的持續(xù)下降。

然目前市售微量元素如硒元素相關營養(yǎng)補充品，大多為無機態(tài)的硒元素，一個人若服用超過50微克就會有中毒危險，所以醫(yī)師與藥劑師皆會交待不可攝取過量。故有機態(tài)的的硒酵母，就愈來愈受到人們重視，前述硒酵母，可使礦物質硒在釀酒酵母體內轉化為無毒的有機形態(tài)硒，不但不具毒性，對人體而言，其吸收度相較無機型態(tài)的亞硒酸鈉為高。

然而，現(xiàn)有可將無機態(tài)的硒元素轉化為有機形態(tài)硒的微生物，無論于菌種或菌株都相當有限。進一步，現(xiàn)有的微生物其有機硒的轉化率、產率皆不高，故如何有效提升有機硒的轉化率、產率便成為重要問題。另外，前述的有機硒除可作成錠劑或膠囊而方便人們服用外，若人們平日飲食中，即可藉由攝食蔬菜而補充人體所缺乏的有機硒，不僅補充方便，且有機硒攝食來源多樣化，而更能提高因來源不同，有機硒與其它微量元素、蛋白質相結合的可能性，進而達到寓醫(yī)于食、增進人體健康的目的。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述，如何提升有機硒于微生物細胞內的轉化率、產率，亦提升有機硒于微生物萃取物、微生物發(fā)酵物、植物萃取液中的量，進而可大量生產，降低成本，提供人們方便取得而服用有機硒為一重要課題。

前述微生物萃取物的有機硒、微生物發(fā)酵液的有機硒、植物萃取液的有機硒給予癌癥或經(jīng)化療所誘導惡病質患者，可改善前述患者因患癌癥、或接受化療所導致惡病質的現(xiàn)象。

因此，本發(fā)明的目的對于提升含硒有機物于微生物萃取物、微生物發(fā)酵液、植物萃取液的量而改善已知含硒有機物于微生物、植物中含量不足的缺點。此外，本發(fā)明亦對于減緩因癌癥/腫瘤或因接受化療藥物所導致的惡病質具改善功效，進而改善惡病質患者因已知不易自微生物萃取物、微生物發(fā)酵液、植物萃取液取得足量的含硒有機微量元素而導致日常生活質量不佳的問題。

在本發(fā)明實施例中，提供一種用以制備改善惡病質的組合物，其中所述組合物選自含硒微生物萃取物、含硒微生物發(fā)酵液、含硒植物萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒微生物是選自含硒釀酒酵母、含硒乳酸菌、含硒樟芝菌絲體中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒微生物發(fā)酵液是選自含硒樟芝菌絲體發(fā)酵液、含硒釀酒酵母發(fā)酵液、含硒乳酸菌發(fā)酵液中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒釀酒酵母是選自含硒釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、含硒釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、含硒釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、含硒釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)、含硒釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒乳酸菌是選自含硒植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、含硒植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、含硒嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、含硒芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、含硒嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、含硒植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、含硒副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒植物萃取液是選自含硒蔬菜萃取液、含硒水果萃取液、含硒稻米萃取液、含硒麥萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒蔬菜萃取液是選自含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實施例中，其中含硒植物萃取液可為含硒植物發(fā)酵液，其中含硒植物發(fā)酵液是利用樟芝菌絲體、釀酒酵母或乳酸菌中的一種或多種進行發(fā)酵而成。

在本發(fā)明實施例中，其中所述惡病質是選自癌癥誘導導致的惡病質或/和化療藥物誘導導致的惡病質。

在本發(fā)明實施例中，其中所述組合物有清除自由基的能力。

在本發(fā)明實施例中，其中所述自由基為dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。

在本發(fā)明實施例中，其中所述組合物能縮小10％至98％腫瘤體積。

在本發(fā)明實施例中，其中所述組合物能縮小30％至95％腫瘤體積。

在本發(fā)明實施例中，其中所述組合物能降低癌癥的惡病質個體的血清中的tnf-α含量為35pg/ml至75pg/ml。

在本發(fā)明實施例中，其中所述組合物能降低化療藥物的惡病質的個體的血清中的il-6含量為1.8至16倍。

附圖說明

圖1為制備改善惡病質的組合物的制程流程圖，其中：a為第一制程流程圖；b為第二制程流程圖。

圖2顯示于100l發(fā)酵槽中有機硒樟芝菌絲體的發(fā)酵情形。

圖3顯示于100l發(fā)酵槽中有機硒釀酒酵母的發(fā)酵情形。

圖4顯示于100l發(fā)酵槽中有機硒乳酸桿菌的發(fā)酵情形。

圖5顯示小鼠肺癌細胞在含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液或含硒發(fā)酵液下的存活率。

圖6顯示含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液或含硒發(fā)酵液清除dpph自由基的能力。

圖7顯示含硒酵母發(fā)酵液、含硒樟芝發(fā)酵菌絲體、含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液于不同的稀釋倍數(shù)縮小腫瘤大小的能力。

附圖標記說明：s101、含硒微生物；s103、含硒微生物發(fā)酵液；s105、含硒微生物萃取物；s201、含硒植物；s203、含硒植物萃取液；s205、含硒發(fā)酵混合液。

實施方式

本發(fā)明是提供一種制備具改善惡病質(cachexia)的包含微量元素有機物的組合物、其用途及其制備方法，其中達到微量元素有機物是選自含硒(se)、鈷(co)、錳(mn)、鋅(zn)的有機物，較佳為含硒有機物。

硒在自然界中一般以“有機”與“無機”兩種型態(tài)存在。有機硒較無機硒更容易被生物利用，也是最佳的硒補充形式。有機硒化合物(organoseleniumcompounds)是指分子中含有硒的有機化合物，如生物體內的硒半胱氨酸(selenocysteine)即屬于此類，這些有機硒的生體可利用率較無機硒高出甚多，且臨床效果好，毒性低，副作用小，是硒攝取的最佳補充方式。有機硒具有抗氧化、提升免疫功能、排除人體內的毒素及對抗惡性腫瘤作用。

表一、有機硒與無機硒的比較

本發(fā)明所述微量元素有機物包括含微量元素的微生物、含微量元素的微生物發(fā)酵液、植物及/或植物萃取物。在實施例中，含微量元素的微生物為含硒微生物。含硒微生物包括，但不限于，含硒樟芝菌絲體、含硒釀酒酵母、含硒乳酸菌等。

本發(fā)明的含硒微生物發(fā)酵液包括含硒樟芝菌絲體發(fā)酵液、含硒釀酒酵母發(fā)酵液、及/或含硒乳酸菌發(fā)酵液。其中，所述含硒微生物發(fā)酵液于本發(fā)明中特別是指含硒微生物經(jīng)發(fā)酵后的液體，且并無經(jīng)離心處理。

在特定實施例中，釀酒酵母包括，但不限于，釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)或釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)。

又，「乳酸菌」是指能夠代謝糖類、產生50％以上乳酸之細菌，具有這些功能的細菌包括乳酸桿菌(lactobacillus)等。在本發(fā)明特定實施例中，乳酸菌包括，但不限于，植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)。

此外，本發(fā)明所述的植物較佳為可食用植物，例如蔬菜、水果、稻米、麥等，較佳為蔬菜。

在實施例中，含微量元素的植物，如含硒的植物，包括，但不限于含硒的紅鳳菜、地瓜葉、小白菜、甘藍、萵苣、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、莧菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、蓮花白、苜蓿芽或豆芽菜。

本發(fā)明所述的植物萃取液是一個或多個植物的萃取液，較佳為蔬菜萃取液。

在實施例中，植物萃取液包括，但不限于紅鳳菜、地瓜葉、小白菜、甘藍及/或萵苣萃取液。

本發(fā)明的微量元素有機物可為發(fā)酵液產品。

在實施例中，將紅鳳菜萃取液、地瓜葉萃取液、小白菜萃取液、甘藍萃取液、萵苣萃取液及/或樟芝菌絲體以釀酒酵母、及/或乳酸菌發(fā)酵而獲得發(fā)酵液產品。

在本發(fā)明中，本發(fā)明含硒有機物的使用方式包括口服或注射。

此外，本發(fā)明的組合物可單獨給藥，或是在包括有藥學上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑的組合物中給藥。上述載體可為溶劑、散布媒劑(dispersionmedia)、涂層(coatings)、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑等。稀釋劑可為制菌注射水(bacteriostaticwaterforinjection，bwfi)、磷酸緩沖液、ringer溶液或葡萄糖溶液等。賦形劑可為碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸鈉、乳醣、淀粉、明膠、藻酸、硬脂酸或硬脂酸鎂等。

本發(fā)明另提供一種降低腫瘤體積/治療癌癥的方法，包括給予一個體有效劑量的本發(fā)明含硒有機物。在一實施例中，每日給予0.01-100mg/kg，較佳為1-100mg/kg以上，更佳為每日給予5-60mg/kg。

不僅如此，本發(fā)明所給予的劑量可依照不同的參數(shù)做適當?shù)恼{整。上述參數(shù)包括，但不限于，個體的種類，個體的大小、疾病的嚴重性。本發(fā)明的活性成分可以一次給予或24小時內多次給予或連續(xù)給予。

本發(fā)明中所述的“個體”是指人類或非人類的動物，如，狗、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或靈長類動物，特別為實驗動物、家畜、及馴養(yǎng)的動物。在一實施例中，動物可為人類。在另一實施例中，動物可為嚙齒目動物，例如，小鼠或大鼠。

本發(fā)明的含硒有機物具抗氧化能力，可清除自由基。自由基包括，但不限于，no^－、o^－、ho^－、hoo^－、hso4^－及其類似物。在一實施例中，自由基為dpph自由基。

在另一實施例中，本發(fā)明組合物可有效降低腫瘤體積，其可減少10％以上，較佳為20％～99％。較佳地，本發(fā)明組合物可降低腫瘤體積30％至95％。例如，于一實施例中，含硒紅鳳菜萃取物與含硒地瓜葉萃取物可將癌癥個體的腫瘤縮小至10％以下。

本發(fā)明組合物具有預防及/或治療癌癥的效果，因此可給藥投予至癌癥患者、接受化療或放療的個體、癌癥高危險族群等。且本發(fā)明的組合物具有高度的安全性，不會對人體造成影響，因此也可作為長期的飲食補充品。

本發(fā)明組合物可有效地治療及/或預防癌癥，包括良性前列腺肥大、前列腺癌、乳癌、子宮癌、血癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膽癌、甲狀腺癌、肝癌、腎臟癌以及鼻咽癌等，較佳為大腸癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、子宮頸癌或肝癌。

所有說明書中所揭示的發(fā)明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示的每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示的特點均只是等同或相似特點的一般系列的實例。

無需進一步詳盡說明，本技術領域的人員可根據(jù)以上描述，使用本發(fā)明至其最大限度。下面的具體實施方式，其應解釋為僅是說明性的，且不可用于限制本發(fā)明。本文所引用的文獻均并入本發(fā)明。

若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內容相同。

實施例

1.制備方法

如圖1所示，圖式圖1為本發(fā)明一種用以制備改善惡病質的組合物的制備方法的流程圖，其中圖1a為第一制程的含硒微生物的發(fā)酵方法，含硒微生物(s101)是藉由微生物于發(fā)酵步驟中加入亞硒酸鈉而得含硒微生物發(fā)酵液(s103)，含硒微生物發(fā)酵液(s103)進一步以菌萃取步驟而得含硒微生物萃取物(s105)。圖1b為第二制程的含硒植物萃取方法，包含將含硒植物(s201)藉由萃取步驟而得含硒植物萃取液(s203)，含硒植物萃取液(s203)藉加入微生物進行發(fā)酵且可進一步再加入另一微生物或同一微生物而得含硒發(fā)酵混合液(s205)。

1-1含有機硒樟芝菌絲體發(fā)酵液/萃取液的制備

將樟芝菌絲體自-80℃冰箱中取出解凍后，取單一菌落至10ml的ymbroth培養(yǎng)基，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時進行活化。

取活化后的菌液7.5ml至150mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm培養(yǎng)16-24小時進行第一次繼代培養(yǎng)。接著，將第一次繼代培養(yǎng)菌液150ml接種入3l種菌培養(yǎng)基(如一種培養(yǎng)好氧反硝化菌的富集培養(yǎng)基fm)中，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時做為種菌。

將150ml含種菌的新鮮培養(yǎng)基以無菌操作倒入滅菌的血清瓶中，將種菌接入發(fā)酵槽中進行培養(yǎng)。發(fā)酵槽所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有70g/l葡萄糖、15g/l酵母蛋白胨(yeastpeptone)、mgso4.1.7g/l7h2o、2.5g/lkh2po4及6.5g/l(nh4)2so4。在樟芝菌絲體對數(shù)生長期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時)添加3ml的亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l發(fā)酵培養(yǎng)基中(使發(fā)酵培養(yǎng)液中亞硒酸鈉溶液的最終濃度為30μg/ml。

參閱圖2，發(fā)酵時間為11天，以100l發(fā)酵槽生產可得有機硒樟芝菌絲體有機硒轉化率為88％，胞內硒(se)濃度可達732mg/kg，菌體重量可達2600g/100l。

另外，本發(fā)明是藉由感應耦合電漿質譜儀(inductivelycoupledplasmamasssepectrometry，icp-ms)測定硒含量。舉例而言，本發(fā)明利用感應耦合電漿質譜儀而測定含有機硒(含硒)樟芝菌絲體、含有機硒(含硒)釀酒酵母、含有機硒(含硒)乳酸菌的菌體細胞的硒含量。另外，本發(fā)明有機硒轉化率(％)則定義為：(菌體重量×有機硒含量/無機硒總量)×100％。

1-2含有機硒釀酒酵母的制備

將釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)-80℃冰箱取出并于37℃下解凍，取單一菌落于10mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，以150rpm震蕩培養(yǎng)16－24小時進行活化。

取活化后的菌液7.5ml接種于150mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時進行第一次繼代培養(yǎng)。

將第一次繼代培養(yǎng)的種菌150ml倒入滅菌的血清瓶中，接著利用泵將種菌接入發(fā)酵槽中開始進行培養(yǎng)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有70g/l葡萄糖、15g/l酵母蛋白胨(yeastpeptone)、1.7g/lmgso4.7h2o、2.5g/lkh2po4、6.5g/l(nh4)2so4。于釀酒酵母的對數(shù)生長期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時)添加3ml亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l培養(yǎng)基中(使亞硒酸鈉溶液于發(fā)酵培養(yǎng)液最終濃度為30μg/ml)，總添加量為3ml。

參照圖3及表二，使用100l發(fā)酵槽，發(fā)酵時間為1天，所獲得的含有機硒(含硒)釀酒酵母的有機硒轉化率為37-77％，胞內硒濃度可達537-792mg/kg，菌體重量可達1400-2200g/100l。

再者，如前述，各種釀酒酵母于培養(yǎng)時經(jīng)添加亞硒酸鈉溶液，而后得含硒釀酒酵母如含硒釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、含硒釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、含硒釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、含硒釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)、含硒釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)(如表二所示)。又，如前述，本發(fā)明所使用的釀酒酵母其篩選的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關產品進行。

表二、各種釀酒酵母的硒濃度及轉化率

1-3有機硒乳酸桿菌的制備

將乳酸菌(如本發(fā)明實施例的植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)-80℃冰箱取出并于37℃下解凍，取單一菌落于10mlmrsbroth培養(yǎng)基(mrs肉湯培養(yǎng)基)中，于30℃，以150rpm震蕩培養(yǎng)16－24小時進行活化。

取活化后的菌液7.5ml接種于150mlmrsbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時進行第一次繼代培養(yǎng)。

將第一次繼代培養(yǎng)的種菌150ml倒入滅菌的血清瓶中，接著利用泵將種菌接入發(fā)酵槽中開始進行培養(yǎng)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有10g/l蛋白胨、10g/l牛肉抽出物、5g/l酵母抽出物、20g/l葡萄糖、1g/l聚山梨醇脂80、2g/lk2hpo4、5g/l醋酸鈉、2g/l檸檬酸銨、0.1g/lmgso4.7h2o、0.05g/lmnso4.4h2o。于乳酸菌的對數(shù)生長期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時)添加3ml亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l培養(yǎng)基中(使發(fā)酵培養(yǎng)液最終濃度為30μg/ml)，總添加量為3ml。

參照圖4，使用100l發(fā)酵槽，發(fā)酵時間為1天，所獲得的含有機硒(含硒)乳酸菌有機硒轉化率為56-92％，胞內硒濃度可達682-1471mg/kg，菌體重量可達1200-1782g/100l。

再者，如前述，各種乳酸菌于培養(yǎng)時經(jīng)添加亞硒酸鈉溶液，而后得含硒乳酸菌如含硒植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、含硒植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、含硒嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、含硒芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、含硒嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、含硒植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、含硒副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)。又，如前述，本發(fā)明所使用的釀酒酵母其篩選的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關產品進行。

表三、各種乳酸菌的硒濃度及轉化率

1-4含硒有機蔬菜的制備

將上述發(fā)酵廢液加至80kg篦麻粕原料，將氮、磷、鉀比例調整為1:2:1。拌入篦麻粕原料，混合攪拌與升溫至90℃，將蔬果殘渣水分降低至70％，降溫至50℃后加入菌根菌菌酛(如摩西球囊霉(glomusmosseae)、幼套球囊霉(glomusetunicatum)、根內球囊霉(glomusintraradices)、近明球囊霉(glomusclaroideum)、沾屑球囊霉(glomusspurcum)、墾丁內養(yǎng)囊霉(entrophosporakentinensis)、莫氏無梗囊霉(acaulosporamorrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(scutellosporanigra)中的一種或多種)，使前述菌根菌菌酛的比例為5％，濃度達10⁹cfu/ml。將此原料于30℃下反應60分鐘，并在90分鐘內逐漸升溫至100℃后維持10分鐘，以獲得有機硒微生物固肥。

亦可將上述發(fā)酵廢液直接加入菌根菌菌酛(摩西球囊霉(glomusmosseae)、幼套球囊霉(glomusetunicatum)、根內球囊霉(glomusintraradices)、近明球囊霉(glomusclaroideum)、沾屑球囊霉(glomusspurcum)、墾丁內養(yǎng)囊霉(entrophosporakentinensis)、莫氏無梗囊霉(acaulosporamorrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(scutellosporanigra)中的一種或多種)，使前述菌根菌菌酛的比例為5％，濃度達10⁹cfu/ml。將此原料于30℃下反應60分鐘，并在90分鐘內逐漸升溫至100℃后維持10分鐘，以獲得有機硒微生物液肥。

其中，前述菌根菌菌酛的分離、培養(yǎng)與繁殖是參考美國西維吉尼大學的國際菌根菌保存中心(westvirginiauniversity，invam)等菌根菌研究、農業(yè)應用單位其作業(yè)程序而進一步改良、應用。

利用此有機含硒微生物肥料種植紅鳳菜、萵苣、地瓜葉、小白菜、甘藍、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、莧菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、蓮花白、苜蓿芽、豆芽菜等，以獲得含硒蔬菜，并分別制作成含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒地瓜葉萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液等。

2.含硒有機物的抗癌效果

在本實施例中，使用(a)含硒釀酒酵母萃取物(硒含量715mg/kg)、(b)含硒樟芝菌絲體萃取物(硒含量732mg/kg)、(c)含硒紅鳳菜萃取液(硒含量10mg/kg)、(d)含硒萵苣萃取液(硒含量10mg/kg)、(e)含硒發(fā)酵混合液(硒含量10mg/kg)，將含硒紅鳳菜萃取液或/和含硒萵苣萃取液或/和含硒小白菜萃取液或/和含硒甘藍萃取液的含硒蔬菜萃取液經(jīng)釀酒酵母或乳酸菌而混合發(fā)酵后加入0.5(w/w)％樟芝菌絲體進行試驗。于本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液其中一實施例(參閱圖1)，特別是指將含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍萃取液經(jīng)釀酒酵母或乳酸菌混合發(fā)酵30天后，加入0.5(w/w)％樟芝菌絲體進行試驗。

含硒蔬菜萃取液亦可選自含硒地瓜葉萃取液、含硒甘藍萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液或含硒豆芽菜萃取液，另外，亦可選擇釀酒酵母、含硒釀酒酵母、乳酸菌、含硒乳酸菌、樟芝菌絲體、含硒樟芝菌絲體進行發(fā)酵并混合。將含硒量稀釋為10mg/kg，以平衡含硒量所造成的結果差異。分別將此(a)含硒釀酒酵母萃取物、(b)含硒樟芝菌絲體萃取物、(c)含硒紅鳳菜萃取液、(d)含硒萵苣萃取液、(e)含硒發(fā)酵混合液5種含硒物質稀釋100、200、400及800倍。

2.1細胞毒性試驗

利用mts試驗測試上述5種含硒有機物對于小鼠肺癌細胞(line-1)的細胞毒性。參閱圖5，稀釋100倍的含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液與含硒發(fā)酵混合液對于肺癌細胞(小鼠肺癌細胞)的生長具有抑制能力。在各組中，將含硒有機物稀釋200-800倍可抑制70％-40％的肺癌細胞生長。5種含硒有機物皆可作為有效抑制肺癌細胞的物質，且具有劑量依賴性。

2.2抗氧化試驗

取100μl的含硒有機物加入100μl由甲醇所配制的1mm1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph自由基)，均勻混合靜置30分鐘，使用分光光度計檢測517nm吸光值。空白組以100μl的甲醇代替。吸光值越低表示樣品清除dpph自由基能力越強。清除率(scavengingeffect)＝(1-(樣品517nm吸光值/空白組517nm吸光值))×100％。

參閱圖6，含硒發(fā)酵混合液清除dpph自由基效果最好，經(jīng)100倍稀釋后，dpph自由基清除率約為90％；而含硒釀酒酵母萃取物與含硒樟芝菌絲體萃取物則約為30-35％；含硒蔬菜汁其清除率約為60％。

2.3惡病質動物試驗一

將6至8周大的balb/cbyj小鼠，依體重平均分配至各組。小鼠飼料為一種商業(yè)基礎飼料(例如的5001laboratoryrodentdiet)，其經(jīng)高溫高壓滅菌，采任意食用的方式喂食。動物模式包括(1)腫瘤誘導惡病質的動物模式及(2)化療動物模式。

在前述(1)腫瘤誘導惡病質的動物模式中，對照組以皮下注射1×10⁵(產生中度惡病質)與5×10⁵(產生重度惡病質)肺癌細胞line-1至balb/cbyj小鼠，制造肺癌的惡病質急性反應，控制組則是注射0.1mlpbs(磷酸鹽緩沖液)，實驗組則以管灌/喂食0.1ml/天的含硒發(fā)酵混合液(10mg/kg)。

腫瘤誘導惡病質的動物模式實驗結果顯示，腫瘤小鼠的增重率顯著低于正常小鼠。中度惡病質組別的小鼠的體重下降15.6％，重度組則下降19.1％。攝食率各組間則無顯著差異(p>0.05)，如表四所示。由此結果可知，惡病質的體重減輕癥狀是由腫瘤所引起，屬于癌因性厭食。此外，腫瘤小鼠的血清白蛋白顯著降低，此結果與惡病質的惡化程度具有負相關性(表四)。在重度惡病質小鼠中，血清中發(fā)炎激素tnf-α含量顯著增加(表四)。實驗組小鼠的體重、血清白蛋白、發(fā)炎激素tnf-α及il-6與正常小鼠無顯著差異，此結果可顯示含硒發(fā)酵混合液有助于降低腫瘤誘導動物的惡病質產生。亦即，本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液能降低癌癥的惡病質個體的血清中tnf-α含量為35pg/ml至75pg/ml。

表四、腫瘤誘導惡病質的動物模式實驗

*p<0.01；n為動物只數(shù)

在(2)化療動物模式中，以腹腔連續(xù)注射多西他賽(docetaxel)2次(低劑量組，產生中度惡病質)與4次(高劑量組，產生重度惡病質)至balb/cbyj小鼠，制造化療誘導的惡病質急性反應。控制組則是注射0.1mlpbs，實驗組則灌/喂食0.1ml/天的含硒發(fā)酵混合液(10mg/kg)。

化療誘導的惡病質的動物模式實驗結果顯示，多西他賽(docetaxel)處理的小鼠其增重率、攝食率與血清白蛋白量顯著低于正常小鼠，且隨著施打次數(shù)增加其嚴重度越高，如表五所示。低劑量組別的小鼠其體重流失5.5％，高劑量組則流失了11.6％。化療藥物(docetaxel)會引起厭食現(xiàn)象，顯示由化療引起的體重流失有一部分是由于厭食所引起。在docetaxel處理小鼠血清中，發(fā)炎激素tnf-α含量各組間無顯著差異，但是il-6含量是正常鼠的2至3倍。臨床上惡病質癥狀，包括低白蛋白與高發(fā)炎激素表現(xiàn)，皆與動物模式所發(fā)現(xiàn)的特征吻合。實驗組小鼠的體重、血清白蛋白、發(fā)炎激素tnf-α及il-6與正常小鼠無顯著差異，此結果可顯示含硒發(fā)酵混合液有助于降低化學誘導動物的惡病質產生。亦即，本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液能降低化療藥物誘導惡病質的個體的血清中il-6含量為1.8至16倍。

表五、docetaxel誘導惡病質的動物模式實驗

*p<0.01；n為動物只數(shù)

2.4惡病質動物試驗二

選用六到八周齡c57bl/6雄性小鼠，并依體重將小鼠隨機分為：對照組，喂食生理食鹽水；實驗一組，給予含硒酵母發(fā)酵液；實驗二組，給予含硒樟芝菌絲體萃取物；實驗三組，給予含硒紅鳳菜萃取液；實驗四組，給予含硒地瓜葉萃取液。于此實施例的對照組與實驗組中，是將1×10⁵llc細胞(肺癌細胞)注射至c57bl/6小鼠右腳背皮下而誘導腫瘤發(fā)生，并對應前述各實驗組而每日分別給予20或40毫克/公斤體重的含硒酵母發(fā)酵液、含硒樟芝發(fā)酵菌絲體、含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜菜萃取液。如圖7，其中如含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液于稀釋100倍時，實驗組小鼠的腫瘤相較對照組縮小90％以上。再者，前述各實驗組使用本發(fā)明前述的含硒有機物皆可抑制腫瘤大小達60％以上。

綜上所述，本發(fā)明藉由提供含微量元素的微生物、含微量元素的微生物發(fā)酵液、植物及/或植物萃取物，能有效改善生物體惡病質的情形，進而提升有惡病質患的生活質量。

發(fā)明所揭露的所有特征應可以任何結合方式實現(xiàn)。本發(fā)明所揭露的每一特征應可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一個特征僅僅只是均等物或相似特征的一個種類的一實施例。

由上述內容可知，任何所屬本領域技術人員，將可輕易從本發(fā)明所揭露的內容中了解到本發(fā)明的特征，在不偏離隨附權利要求書所界定的本發(fā)明的精神與范圍下，當可在此進行各種改變、取代以及修正。因此，其他實施例亦落于本發(fā)明權利要求書所要求保護的范圍之內。