本發明屬于生物醫學領域，尤其是涉及小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用及其篩選方法。

背景技術：

長期以來，在臨床和基礎研究中，小分子化合物被廣泛作為藥物或調控分子，用于治療疾病或研究生物系統。這些小分子化合物，可以以共價或非共價的方式與靶標蛋白進行結合。但是，由于早期的研究人員擔心共價化合物會有較大的脫靶("off-target")效應，造成很大的副作用，因此在過去的合理藥物篩選和設計中，共價化合物通常被避免。也正因為如此，過去的計算機輔助篩選方法，基本上都針對非共價化合物的對接(docking)進行優化，用于篩選、設計、優化和評價非共價化合物與蛋白質的結合。然而，近幾年的總結研究發現，在臨床上使用的小分子化合物藥物中，有近1/3的藥物是共價化合物，即通過共價機制(中間態或最終形式)，與靶標蛋白進行結合。這類共價化合物藥物包括阿司匹林、盤尼西林、磷霉素等。因此，近幾年來，很多計算軟件和方法進行了改善，以用于針對蛋白靶標的共價化合物(藥物或調控分子)的篩選和優化，例如DOCKovalent,CovalentDock,CovDock,DOCKTITE等。但是，這些方法都涉及到很復雜的共價鍵形成的計算，而且預測結果也并不太理想。其中，DOCKovalent是目前唯一一個成功指導實驗篩選得了到共價抑制劑的計算方法。

多胺(polyamines)是一類從氨基酸代謝產生的帶正電的陽離子小分子，在所有生物體中都存在，對細胞生長、分化、存活及正常生物學功能等都不可缺少。多胺帶多正電荷的特性，使它們能通過與帶負電荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白質、細胞膜等)形成靜電作用，從而調控非常廣泛的生物學過程，包括染色體結構形成、DNA合成與穩定、DNA復制、轉錄和翻譯、蛋白質磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調控、自由基清除等。天然的多胺有很多種。在哺乳動物中，天然存在的有三種，即putrescine(腐胺),spermidine(精脒),spermine.(精胺)，它們對哺乳動物正常生長和發育必不可少。由于多胺具有重要的生物學功能，其細胞內水平受到嚴格的調控。在快速繁殖的細胞(如腫瘤細胞)中，多胺水平也會上升和失調。 多胺水平升高，伴隨著細胞增殖加快、凋亡減少、以及腫瘤浸潤和轉移相關基因的表達水平升高等。因此，多胺的調控，成為腫瘤治療和藥物研發中的一個重要手段。

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)是多胺體內合成的一個關鍵酶，對于精胺和精脒的合成至關重要，因為精胺和精脒的氨丙基來源于AdoMetDC的脫羧反應。因此，合成AdoMetDC抑制劑，抑制精胺和精脒的生成，是目前很受關注的一個腫瘤治療途徑。同時，由于病原微生物也需要維持正常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制劑也成為針對病原微生物的一個重要藥物靶標。

當前，AdoMetDC的抑制劑MGBG(米托胍腙)已經被用于臨床中的抗白血病治療和癌癥的化療輔助藥物。但MGBG會導致嚴重的線粒體損傷，因此毒副作用非常大。AdoMetDC的抑制劑CGP 48664(SAM486A)已經進入I期和II期臨床評估。因此，開發出具有更好效果的AdoMetDC新型抑制劑具有重要意義和價值。

在我們的前期研究中(Scientific Reports,2015,vol.5:10754)，我們提出了一個S-腺苷甲硫氨酸AdoMetDC的非共價抑制劑的篩選策略。通過將活性AdoMetDC(腺苷甲硫氨酸脫羧酶)的一個底物結合口袋的關鍵非天然氨基酸Pyruvate68，突變為Ser(絲氨酸)，我們驗證可以預測非共價抑制劑的結合構象，并用于非共價抑制劑的篩選。同時，我們發現，共價抑制劑的結合構象，也可以比較好的得到預測，但是由于小分子共價基團與Ser68間存在空間碰撞，所以共價基團會有較大的偏差。

技術實現要素：

基于此，本發明提供小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用其篩選方法。

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，該小分子抑制劑的結構式為：

其中R₁可以為甲酸基及其衍生取代基團、氨基及其衍生取代基團，噻吩并R₂基團中的R₂可以為環己烯及其取代基團、苯基及其取代基團、苯胺或苯甲酰胺或其 取代苯基基團、吡咯及其取代基團、吡啶及其取代基團；該抑制劑還包括含有通式I所示的化學結構的藥學上可接受的鹽。

進一步優選該小分子共價抑制劑的結構式為：

該小分子商品標號為：MCULE-3626300541(http://zinc.docking.org/substance/80699)

一種篩選S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的小分子共價抑制劑的方法，所述方法包括以下步驟：

1)以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的晶體結構為基礎，將S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶晶體結構中的丙酮酰68殘基刪除，并在Rosetta軟件中優化，得到優化后的蛋白晶體結構；

2)搜索用于對接的小分子，小分子化合物庫來自ZINC對接數據庫，搜索小分子，服務器返回搜索結果后，得到對應的小分子結構；

3)將所述步驟1)優化后的蛋白晶體結構和步驟2)搜索得到的小分子結構利用AutoDockVina軟件進行對接計算，得到對接計算結果；

4)對步驟3)得到的計算結果進行篩選，根據打分排序，篩選得到小分子共價抑制劑；

完成所述方法在篩選S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的共價抑制劑上的應用。

所述步驟2)搜索小分子條件為：①SMILES表達式：C(＝O)NN，并選擇“substructure”子結構，以搜索含有上述基團的分子結構；②分子量大于200且小于400；③脂水分配系數≤3.5；④可旋轉鍵大于等于3，且小于等于9；⑤氫鍵供體大于等于2，且小于等于10；⑥氫鍵受體大于等于2，且小于等于10。

所述步驟4)篩選條件包括：①SMILES表達式中共價結合原子即NH₂中的N的位置，與原晶體結構中Pyr68的共價O原子或抑制劑共價結合后的共價N原子位置的距離小 于1埃；②該構象的對接打分小于等于-8.0。

所述方法還包括光譜法和高效液相色譜方法檢測小分子對S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制作用、驗證小分子共價抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是否是共價結合的。

所述光譜法為小分子與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶混合后在37℃共孵育30min后，添加底物甲硫氨酸反應5min后進行檢測，DMSO為溶劑對照，S-腺苷甲硫氨酸抑制劑米托胍腙為陽性對照。

所述高效液相色譜方法所用儀器為Waters e2695，柱子為Waters C18反相柱，所述反向柱為5um，4.6x250mm，柱溫30℃，流動相0.01mol/L甲酸銨：甲醇＝97：3，所述0.01mol/L甲酸銨pH為3.5，流速0.5mL/min，檢測波長254nm；上樣前，加入反應體系9倍體積的甲醇終止反應，12000g離心10min除去變性的蛋白后，取上清樣品進行分析，通過檢測底物甲硫氨酸的消耗，驗證小分子對S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的抑制作用。

所述驗證小分子共價抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶是否是共價結合的具體方法為，將小分子共價抑制劑與S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶孵育不同時間后添加底物甲硫氨酸啟動催化反應，10min后終止反應檢測底物的消耗，所述孵育不同時間為0min，30min，60min，90min。

所述的方法中所用的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物口袋，其特征在于：以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的晶體結構為基礎，將AdoMetDC晶體結構中的第68位丙酮酰基刪除后，與底物甲硫氨酸結合口袋形成擴大的結合口袋為S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物篩選和設計口袋。

本發明優點：

1、本發明篩選的共價抑制劑對S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶作用明顯；

2、本發明方法操作簡單，不需要對已有小分子對接算法進行復雜修改，且效果良好，該方法適用于快速進行共價抑制劑的篩選與設計；

3、本發明方法與其他預測方法比，具有相當或更好的預測效果。

4、本發明的計算篩選方法，由于不需要根據實驗體系的不同而修改對接算法，所以與其它已知共價抑制劑篩選方法相比，具有更廣泛的適用性，可以適用于所有共價抑制劑的篩選和設計體系；可以廣泛利用已經發展完善的眾多非共價抑制劑的對接計算方法，因此可以大大加速共價抑制劑的篩選、優化和發現。

5、本發明的實驗對象是人源AdoMetDC，但是由于不同來源的AdoMetDC之間具 有同源性，因此我們的抑制劑通用能夠作用于其它非人源的AdoMetDC，以及其它的AdoMetDC的同源蛋白酶。

附圖說明

圖1：本發明小分子共價抑制劑對AdoMetDC的活性抑制作用對比效果。

圖2：HPLC分析結果驗證這個小分子對AdoMetDC的抑制作用；

圖3：本發明小分子共價抑制劑與AdoMetDC共孵育不同時間對抑制能力的影響；

圖4：本發明小分子共價抑制劑分子結構；

圖5：本發明小分子共價抑制劑與AdoMetDC的對接構象。

具體實施方式

下面結合實施例來進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表述的范圍。

實施例1

1)以S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)的晶體結構為基礎，將PDB ID為3DZ5的AdoMetDC晶體結構中的Pyr68殘基刪除，并在Rosetta中優化，得到優化后的SCAR蛋白晶體結構；

2)用于對接的小分子化合物庫，來自與ZINC(http://zinc.docking.org)對接數據庫，小分子搜索條件為：①SMILES表達式：CONN，并選擇“substructure”子結構，以搜索含有上述基團的分子結構；②分子量大于200且小于400；③xLogP≤3.5；④可旋轉鍵大于等于3，且小于等于9；⑤氫鍵供體大于等于2，且小于等于10；⑥氫鍵受體大于等于2，且小于等于10，服務器返回搜索結果后，得到對應的小分子的結構；

3)將所述步驟1)優化后的結構和步驟2)搜索到小分子結構利用AutoDockVina進行對接計算，得到對接計算結果；

4)對步驟3)得到的計算結果進行篩選，篩選條件包括：①SMILES表達式中共價結合原子(NH₂中的N)的位置，與原晶體結構中Pyr68的共價O原子(或抑制劑共價結合后的共價N原子)位置的距離小于1埃；①該構象的對接打分小于等于-8.0，根據打分排序，選擇可購買化合物用于實驗篩選，得到小分子共價抑制劑MCULE-3626300541(小分子名稱為銷售商編號)；該小分子共價抑制劑的結構式為：

實施例2

利用專利(ZL201410530672.3)的方法，我們進行了AdoMetDC活性評價，光譜法檢測所述步驟4)得到的實施例1小分子共價抑制劑對AdoMetDC的活性抑制作用，小分子與AdoMetDC混合后在37度共孵育30min后，添加底物反應5min后進行檢測，DMSO為溶劑對照，AdoMetDC抑制劑MGBG(米托胍腙)為陽性對照，結果見圖1，這個小分子共價抑制劑都比MGBG有更好的抑制能力；

實施例3

利用高效液相色譜(HPLC)方法，通過檢測底物AdoMet的消耗，驗證實施例1小分子對AdoMetDC的抑制作用。HPLC所用儀器為Waters e2695，柱子為Waters C18反相柱(5um，4.6x250mm)，柱溫30度，流動相0.01mol/L甲酸銨(pH 3.5)：甲醇＝97：3，流速0.5mL/min，檢測波長254nm。上樣前，加入9倍體積的甲醇終止反應，12000g離心10min除去變性的蛋白后，取上清樣品進行分析，結果見圖2，由圖2可知小分子與AdoMetDC在37度混合孵育30min后，添加底物反應0min、5min或10min后終止反應，并檢測底物的消耗。圖2顯示，這個小分子共價抑制劑都能夠抑制底物的消耗(主峰越高，表示檢測體系中底物量越多)；

實施例4

利用HPLC方法，驗證實施例1小分子共價抑制劑都是與AdoMetDC共價結合的，將小分子共價抑制劑與AdoMetDC孵育不同的時間(0min，30min，60min，90min)后添加底物AdoMet啟動催化反應，10min后終止反應檢測底物的消耗。結果顯示(圖3)隨著共孵育時間的延長，小分子具有更高的抑制能力，隨著孵育時間的延長，AdoMetDC的活性(空心圓)沒有顯著變化，非共價抑制劑MGBG(空心方塊)的抑制能力也沒有增加。而我們發現的3個小分子抑制劑，與AdoMetDC孵育時間越長， 抑制效果越好(底物殘余百分比越大)。底物殘余百分比是指所述樣品的底物峰面積與單獨的底物對照樣品的峰面積的比值。該比值越大，表明底物殘余量越多，酶催化反應消耗的底物越少，即表觀酶活性越弱。

本發明小分子共價抑制劑的分子結構見圖4。-C(＝O)-NH-N*H2為共價基團，N*為共價結合原子。本發明小分子共價抑制劑與AdoMetDC的對接構象見圖5，其中M8M為PDB結構3DZ5中的AdoMetDC共價抑制劑。這個小分子的共價結合原子N*均位于共價抑制劑M8M的共價N原子位置(球狀點顯示其原子半徑)，因此能夠與Pyr68的O原子形成共價鍵。周圍的關鍵相互作用殘基在M8M對應圖中進行了標明。

實施例5

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

實施例6

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

實施例7

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

實施例8

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

實施例9

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

實施例10

小分子共價抑制劑在制備抑制S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的藥物上的應用，其特征在于，該小分子抑制劑的結構式為：

上述的實施例僅為本發明的優選技術方案，而不應視為對于本發明的限制，本申請中的實施例及實施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發明的保護范圍應以權利要求記載的技術方案，包括權利要求記載的技術方案中技術特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內的等同替換改進，也在本發明的保護范圍之內。