本發(fā)明涉及藥物制備與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及非肽類小分子化合物作為mc4r激動劑及其特異突變體藥物伴侶的應(yīng)用。所述的非肽類小分子化合物命名為bms-470539，利用bms-470539作為制備mc4r激動劑以及特異mc4r突變體藥物伴侶的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黑皮質(zhì)素受體家族包含5個不同生理功能g蛋白偶聯(lián)受體(黑皮質(zhì)素受體1-5)¹。黑皮質(zhì)素受體-1主要作用于黑色素細(xì)胞的著色和抗炎，黑皮質(zhì)素受體-2主要作用類固醇生成，黑皮質(zhì)素受體-3主要作用于采食效率和營養(yǎng)分配，黑皮質(zhì)素受體-4主要調(diào)節(jié)食物攝入和能量調(diào)節(jié)，黑皮質(zhì)素受體-5則作用于外分泌，特別是皮質(zhì)腺分泌^2-7。近年來，成人肥胖率的快速增長已成為影響全世界范圍內(nèi)人類健康的重要問題。有證據(jù)表明黑皮質(zhì)素受體-4(melanocortin-4receptor,mc4r)敲除小鼠和mc4r突變?nèi)祟惐憩F(xiàn)出早期性肥胖并伴隨食欲過盛、高血糖和超高胰島素血癥^8-10。另外，人類遺傳學(xué)研究表明mc4r編碼區(qū)突變代表了最頻繁出現(xiàn)的單基因突變導(dǎo)致肥胖的病例^11-14。基于體外功能研究，mc4r突變體被分為五類：第一類為無效突變受體；第二類為細(xì)胞膜定位缺陷受體；第三類為配體親和缺陷受體；第四類為信號激活缺陷受體；第五類為功能正常突變受體¹⁵。

大多數(shù)非活性mc4r突變體都有不同程度的細(xì)胞膜定位缺陷，配體親和力缺陷，camp信號或perk1/2信號缺陷。因此，如何挽救mc4r突變體的這些功能缺陷成為治療肥胖的研究熱點。如熱休克蛋白hsp70作為分子伴侶能指導(dǎo)mc4r正確折疊從而挽救那些不能正確折疊的突變體¹⁶。還有藥物伴侶pba¹⁷、小分子激動劑thiq¹⁸、小分子拮抗劑ml000253764¹⁹都有一定程度的基因治療作用。然而這些分子或藥物伴侶都只針對某些特異mc4r缺陷突變體，因此，有必要進(jìn)一步挖掘挽救mc4r缺陷突變體的藥物伴侶，為開發(fā)新的個性化抗肥胖藥物奠定基礎(chǔ)。

非肽類小分子化合物bms-470539的化學(xué)名稱為1-[1-(3-甲基-l-組氨酰基-o-甲基-d-酪氨酰)-4-苯基-4-哌啶基]-1-丁酮，分子量為559.697，該化合物最早是針對mc1r受體開發(fā)的激動劑¹⁶。基于mc4r與mc1r能結(jié)合相同的配體，并激活相似的信號通路。提示可以針對bms-470539進(jìn)行其作為mc4r新激動劑的藥理特性研究以及其作為藥物伴侶分子本身對被挽救mc4r突變體的功能研究²⁰。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種非肽類小分子化合物，編號為bms-470539作為黑皮質(zhì)素受體-4(簡稱mc4r)激動劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種編號為bms-470539作為制備特異mc4r突變體藥物伴侶的應(yīng)用。

上述bms-470539化合物的化學(xué)名稱為1-[1-(3-甲基-l-組氨酰基-o-甲基-d-酪氨酰)-4-苯基-4-哌啶基]-1-丁酮，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示,其分子量為559.697。

為了篩選挽救mc4r缺陷突變體的有效藥物，申請人對非肽類小分子化合物bms-470539進(jìn)行了研究。申請人首先研究了bms-470539對mc4r野生受體作用，發(fā)現(xiàn)它能與mc4r特異性結(jié)合并激活其下游信號通路。接著，為開發(fā)其對mc4r突變體的挽救作用，申請人選擇了10個mc4r的第二類突變體(n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q和c271y)，6個mc4r的第三類突變體(g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y和a219v)和4個mc4r的第四類突變體(d90n，s136f，a175t和c326r)進(jìn)行了相關(guān)藥物挽救靶向篩選試驗。發(fā)現(xiàn)bms-470539能特異性的挽救其中某些缺陷突變體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。

具體地，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

申請人通過配體親和力測試、camp和perk1/2信號分子的激活檢測，發(fā)現(xiàn)bms-470539與mc4r具有高親和力(如圖2和表1所示)，bms-470539還以劑量依賴的形式誘導(dǎo)mc4r產(chǎn)生信號分子camp(如圖3和表1所示)，并誘導(dǎo)mc4r產(chǎn)生高水平的perk1/2(如圖4、5所示)。從而發(fā)現(xiàn)bms-470539是mc4r的激動劑。

申請人通過對camp信號激活的檢測，發(fā)現(xiàn)bms-470539能較好恢復(fù)mc4r二類突變體中n62s、c84r、m161t、p260q，三類突變中g(shù)55v，i102t、l106p，以及四類突變中a175t、c326r產(chǎn)生camp信號分子的能力(如圖6、7、8及表2、3所示)。

申請人通過對perk1/2蛋白的wb檢測，發(fā)現(xiàn)bms-470539能較好恢復(fù)三類突變g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，以及四類突變體s136f，a175t，c326r產(chǎn)生perk1/2信號分子的能力(如圖9、10和表3所示)。

更詳細(xì)的技術(shù)方案如《具體實施方式》所述。

附圖說明

圖1：是非肽類小分子化合物bms-470539的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2：是bms-470539誘導(dǎo)下mc1r、mc3r、mc4r和mc5r產(chǎn)生信號分子camp的水平。

圖3：是mc1r、mc3r、mc4r和mc5r分別與bms-470539配體親和力結(jié)果。

圖4：是mc4r在不同時間bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子perk1/2水平的wb結(jié)果圖。

圖5：是mc4r在不同濃度bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子perk1/2水平的wb結(jié)果圖。

圖6：是第二類mc4r突變體在10^-5mbms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子camp的水平柱狀圖。

圖7：是第三類mc4r突變體在不同濃度bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子camp的折線圖。附圖標(biāo)記說明：圖7中的a圖是g55v、δ88-92、i102t突變體與wt受體在不同濃度bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子camp的折線圖；圖7中的b圖是l106p、d126y、a219v突變體與wt受體在不同濃度bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子camp的折線圖。

圖8：是第四類mc4r突變體在不同濃度bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子camp的折線圖。

圖9：是第三類mc4r突變體在10^-5mbms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子perk1/2水平的wb結(jié)果圖。附圖標(biāo)記說明：圖9中的a圖為wb檢測圖；圖9中的b圖為wb結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖。

圖10：是第四類mc4r突變體在10^-5mbms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生信號分子perk1/2水平的wb結(jié)果圖。附圖標(biāo)記說明：圖10中的a圖為wb圖；圖10中的b圖為wb結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖。

具體實施方式

為理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1基本制備實施例

本發(fā)明選取商用質(zhì)粒pcdna3.1(+)(購自clontech公司)作為表達(dá)載體，構(gòu)建了野生型(wt)人的mc4r(hmc4r)的表達(dá)載體：pcdna3.1-hmc4r-wt。即在pcdna3.1(+)的多克隆位點插入了一個編碼野生型hmc4r基因的表達(dá)序列(nm_005912.2)。

本發(fā)明以構(gòu)建好的pcdna3.1-hmc4r-wt為模板，利用快速定點突變試劑盒(購自stratagene公司)構(gòu)建了20個命名為n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q，c271y，g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r經(jīng)功能鑒定的第二、三、四類mc4r突變體表達(dá)載體。

本發(fā)明將不表達(dá)mc4r受體人腎胚胎細(xì)胞(hek293t)作為mc4r及突變體的瞬時表達(dá)系統(tǒng)，用于檢測配體親和力、camp信號和perk1/2信號。hek293t細(xì)胞(購自atcc公司)于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)體系為含10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以0.14×10⁶個/ml的密度接種細(xì)胞到6孔板中，30h后(待細(xì)胞貼壁伸展開)，采用磷酸鈣法²¹轉(zhuǎn)染mc1r突變體和野生型陽性對照質(zhì)粒，48h后收樣。

本發(fā)明對bms-470539作為mc4r激動劑的功能鑒定涉及配體親和力檢測(見實施例2)、camp信號激活能力檢測(見實施例3)以及產(chǎn)生信號分子perk的能力檢測(見實施例4)。

同時，對bms-470539作為mc4r突變體藥物伴侶的挽救功能鑒定涉及產(chǎn)生信號分子camp的能力檢測(見實施例5、6)以及產(chǎn)生信號分子perk的能力檢測(見實施例7)。

實施例2對bms-470539與mc1r、mc3r、mc4r、mc5r親和力的檢測

hek293t細(xì)胞收樣前，用無血清培養(yǎng)基(購自gibco公司)洗細(xì)胞2次，將不同終濃度(10^-10～10^-5m)配體bms-470539(購自bachem公司)與100,000cpm的放射性標(biāo)記配體¹²⁵i-ndp-msh(購自密西西比大學(xué)肽放射性碘標(biāo)記服務(wù)中心)(50μl)在37℃共同溫育轉(zhuǎn)染mc1r、mc3r、mc4r和mc5r的hek293t細(xì)胞(購自atcc公司)1h，終止反應(yīng)后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液即pbs(137mmnacl，2.7mmkcl，1.4mmkh2po4，4.3mmna2hpo4，ph7.4)洗去未被結(jié)合的標(biāo)記物，加入100μl的0.5nnaoh收集細(xì)胞后，利用伽馬閃爍計數(shù)儀測定細(xì)胞中與受體結(jié)合的¹²⁵i-ndp-msh的總量，即得出mc1r、mc3r、mc4r和mc5r與配體bms-470539的結(jié)合能力。利用graphpadprism5軟件分析實驗數(shù)據(jù)作出非線性回歸s型曲線，計算得到受體與配體結(jié)合的有效中濃度值(ic50)和最大濃度值(bmax)。

通過競爭結(jié)合試驗，申請人發(fā)現(xiàn)bms-470539除對mc1r表現(xiàn)出很強的親和力外，對mc4r受體也有相當(dāng)高的親和力，而對mc3r的親和力了下降4倍。mc5r則只在10^-5m的bms-470539刺激下與之有微弱的親和力。結(jié)果見圖2和表1。

表1mc1r、mc3r、mc4r、mc5r與bms-470539的親和力以及在bms-470539誘導(dǎo)下產(chǎn)生camp信號的特征

表1說明：^a表示與mc1r受體相比p<0.05；^b表示與mc1r受體相比p<0.01；^c表示與mc1r受體相比p<0.001；n/a表示沒有檢測到。

實施例3bms-470539誘導(dǎo)mc1r、mc3r、mc4r和mc5r產(chǎn)生信號分子camp的能力檢測

hek293t細(xì)胞收樣前，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，并將含0.5mm的異丁基甲基黃嘌呤的無血清培養(yǎng)基(購自gibco公司)在37℃溫育已轉(zhuǎn)染mc1r、mc3r、mc4r和mc5r的hek293t細(xì)胞15min，然后將不同終濃度(10^-10～10^-5m)的bms-470539刺激處理細(xì)胞，37℃溫育1h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放冰上，吸棄培養(yǎng)基，加入含180μg/ml茶堿的0.5n高氯酸提取細(xì)胞內(nèi)camp，利用放射免疫分析(ria)方法²²進(jìn)行信號分子camp產(chǎn)生的劑量依賴性測定，并利用graphpadprism5軟件計算其有效中濃度(ec50)和最大濃度值(rmax)。

本實施例的測定結(jié)果與配體親和力測定結(jié)果一致，camp活性誘導(dǎo)試驗表明，bms-470539除能誘導(dǎo)mc1r產(chǎn)生camp外,還能刺激mc4r產(chǎn)生劑量依賴性camp，其ec50為472.4nm；rmax為1887.4pmol/10⁶個細(xì)胞。結(jié)果見圖3和表1。

實施例4bms-470539誘導(dǎo)mc4r產(chǎn)生信號分子perk的能力檢測

利用常規(guī)的westernblot(簡稱wb)方法來檢測perk(磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶)的水平。hek293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型mc4r載體24h后，再用無血清培養(yǎng)基(購自gibco公司)使hek293t細(xì)胞饑餓24h。在收樣日，用bms-470539進(jìn)行誘導(dǎo)。收樣前先用hepes緩沖液【150mmnacl和20mmhepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸),ph7.4】洗細(xì)胞2次，再加裂解液【hepes緩沖液中含0.5％np-40(乙基苯基聚乙二醇),2mmedta(乙二胺四乙酸),1mmna3vo4(釩酸鈉)和1mmnaf(氟化鈉)】收集細(xì)胞。總蛋白濃度用bradford法²³測定。每孔上樣總蛋白35mg，用10％sds–page膠分離后轉(zhuǎn)到pvdf膜上。pvdf膜用10％脫脂奶粉(含0.2％tween-20)室溫封閉4h后，加兩種一抗4℃孵育過夜，其中一抗兔抗perk1/2(體積比為1:2000)和鼠抗β-tubulin(作為內(nèi)參抗體，體積比為1:5000)用含5％牛血清白蛋白即bsa的tbst(購自上海生工生物工程有限公司)來稀釋。第二天，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔(體積比為1:1500)和抗鼠(體積比為1:5000)的二抗igg室溫下孵育2h，所述的二抗用10％脫脂奶粉稀釋。最后用ecl顯色法²⁴顯色。然后用圖像處理軟件imagej對蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描。erk1/2的磷酸化水平通過perk1/2與β-tubulin的比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

結(jié)果表明bms-470539可以誘導(dǎo)mc4r受體產(chǎn)生erk信號。bms-470539作用5min時，能誘導(dǎo)mc4r產(chǎn)生3.7倍于基礎(chǔ)水平的perk1/2，但作用30min到60min就回落到了基礎(chǔ)水平，如圖4所示。從劑量依賴性結(jié)果看來，10^-7m的bms-470539就能誘導(dǎo)mc4r產(chǎn)生4.0倍于基礎(chǔ)水平的perk1/2，更高濃度的bms-470539誘導(dǎo)差異不顯著，如圖5所示。

實施例5bms-470539對第二類mc4r突變體camp活性的影響

bms-470539對第二類mc4r突變體camp活性的影響采用ria方法²²測定，具體步驟為：hek293t細(xì)胞收樣前一天，用10^-5m終濃度的bms-470539處理已轉(zhuǎn)染n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q，c271y和wt質(zhì)粒的細(xì)胞24小時。第二天，細(xì)胞收樣前，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，并將含0.5mm的異丁基甲基黃嘌呤的無血清培養(yǎng)基在37℃溫育細(xì)胞15min，再加10^-6mndp-msh作用37℃溫育1h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板放冰上，吸棄培養(yǎng)基，加入含180μg/ml茶堿的0.5n高氯酸提取細(xì)胞內(nèi)camp，利用ria方法²²進(jìn)行信號分子camp水平測定，并利用graphpadprism5軟件計算其濃度值。

ria檢測結(jié)果表明bms-470539增加了n62s，c84r，m161t和p260q產(chǎn)生的camp水平，而對i69r,p78l,g98r,y157s,w174c沒有顯著影響，結(jié)果如圖6所示。

實施實例6bms-470539對第三、四類mc4r突變體camp信號活性的影響

bms-470539對第三、四類mc4r突變體camp信號活性的影響采用ria方法²²測定。具體步驟是：細(xì)胞收樣前，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，并將含0.5mm的異丁基甲基黃嘌呤的無血清培養(yǎng)基在37℃溫育已轉(zhuǎn)染g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r和wt質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞15min，然后將不同終濃度(10^-7m～10^-5m)的bms-470539在37℃刺激處理細(xì)胞1h。將細(xì)胞培養(yǎng)板放冰上，吸棄培養(yǎng)基，加入含180μg/ml茶堿的0.5n高氯酸提取細(xì)胞內(nèi)camp，利用ria²²進(jìn)行信號分子camp產(chǎn)生的劑量依賴性測定，并利用graphpadprism5軟件計算其濃度值。

ria檢測結(jié)果表明，bms-470539能誘導(dǎo)第三類突變g55v，i102t和l106p產(chǎn)生劑量依賴性camp，以及誘導(dǎo)第四類突變a175t和c326r產(chǎn)生劑量依賴性camp，但對其它三、四類突變沒有顯著影響，結(jié)果見圖7、圖8和表2所示。

表2bms-470539對野生型和第三、四類mc4r突變體camp和perk1/2信號的影響

表3的說明：“↑”：表明與基礎(chǔ)水平相比表達(dá)或活性提高；“↓”：表明與基礎(chǔ)水平相比表達(dá)或活性降低；“-”：表明與基礎(chǔ)水平相比沒有顯著改變。

實施實例7bms-470539對第三、四類mc4r突變體perk1/2信號活性的影響

bms-470539對第三、四類mc4r突變體perk1/2信號活性的影響利用wb方法檢測。具體步驟為：用hek293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r和wt質(zhì)粒24h后，再用無血清培養(yǎng)基使hek293t細(xì)胞饑餓24h。在收樣日，用10^-5mbms-470539誘導(dǎo)5min。收樣前先用hepes緩沖液【150mmnacl和20mmhepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸),ph7.4】洗細(xì)胞2次，再加裂解液【hepes緩沖液中含0.5％np-40(乙基苯基聚乙二醇),2mmedta(乙二胺四乙酸),1mmna3vo4(釩酸鈉)和1mmnaf(氟化鈉)】收集細(xì)胞。總蛋白濃度用bradford法²³測定。每孔上樣總蛋白35mg，用10％sds–page膠分離后轉(zhuǎn)到pvdf膜上。pvdf膜用10％脫脂奶粉(含0.2％tween-20)室溫封閉4h后，加兩種一抗4℃孵育過夜，其中一抗為兔抗perk1/2(體積比為1:2000)和鼠抗β-tubulin(作為內(nèi)參抗體，體積比為1:5000)用含5％牛血清白蛋白即bsa的tbst(購自上海生工生物工程有限公司)來稀釋；第二天，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔(體積比為1:1500)和抗鼠(體積比為1:5000)的二抗igg室溫下孵育2h，所述的二抗用10％脫脂奶粉稀釋。最后用ecl顯色法²⁴顯色。然后用圖像處理軟件imagej對蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描。erk1/2的磷酸化水平通過perk1/2與β-tubulin的比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

wb檢測結(jié)果表明，bms-470539能誘導(dǎo)所有第三類mc4r突變體g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y和a219v產(chǎn)生perk1/2，以及誘導(dǎo)第四類突變體s136f，a175t和c326r產(chǎn)生perk1/2，發(fā)明效果如圖9、圖10和表2所示。

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