本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗及其制備方法。
背景技術：
：雞減蛋綜合征(EggDropSyndrome，EDS)是由腺病毒引起的以產蛋高峰期產蛋量下降，產畸形蛋軟殼蛋和無殼蛋為特征，其臨床特征為雞群產蛋突然下降，大量出現軟殼蛋和畸形蛋，蛋殼顏色變淺，給生產帶來很大的經濟損失。1976年荷蘭科學家vanEck等首次報道此病以來，許多國家及地區都報道了此病的流行。我國于20世紀80年代末在肉用種雞群中發現減蛋綜合征以來，許多地區均有該病的流行。禽腦脊髓炎(AvianEncephalomyelitis,AE)又名流行性震顫,，是由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的一種主要危害4周齡以下雛雞，以侵害雛雞中樞神經系統，引起雛雞非化膿性腦炎為主要病理特征的病毒性傳染病，病雛主要表現為運動失調、頭頸震顫和后趾麻痹等神經癥狀。具有突然出現和難以預測持續期等特點，能造成雛雞的損失和母雞產蛋率的下降，成為當前世界上危害養禽業發展的主要疫病之一。我國自80年代中期有此病發生的報道以來，在全國各地均有發生和流行，給養雞業造成了較大的損失。目前減蛋綜合征、禽腦脊髓炎嚴重危害家禽養殖業的發展，在各種防控措施中，疫苗的免疫仍為最重要的措施，研制出抗原滴度高、免疫劑量小、免疫效果好的減蛋綜合征、禽腦脊髓炎二聯苗是一項具有重要意義的工作。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，該二聯滅活疫苗中含有的禽腦脊髓炎病毒HM08株，保藏號為：CGMCCNO.7759，該毒株在SPF雞胚中增殖，0.2ml病毒液的含量≥107.0EID50，免疫原性好，產生的抗體水平高，交叉保護性好，該二聯滅活疫苗能夠產生高水平的抗體，持續期長。本發明的另一目的在于提供雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的制備方法，該方法簡單，安全。本發明的目的采用如下技術方案實現。雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，含有滅活的雞減蛋綜合征病毒AV127株和禽腦脊髓炎病毒HM08株，所述禽腦脊髓炎病毒HM08株的保藏號為CGMCCNO.7759。2.根據權利要求1所述雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，其特征在于0.3ml所述二聯滅活疫苗中雞減蛋綜合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽腦脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。一種制備所述雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的方法，包括如下步驟：(1)病毒液的制備：將雞減蛋綜合征病毒AV127株和禽腦脊髓炎病毒HM08株分別接種易感鴨胚和SPF雞胚，得到減蛋綜合征病毒液和禽腦脊髓炎病毒液；(2)病毒液的滅活：將減蛋綜合征病毒液和禽腦脊髓炎病毒液分別滅活，得到滅活的減蛋綜合征病毒液和禽腦脊髓炎病毒液。(3)水相制備：將滅活的禽腦脊髓炎病毒液與雞減蛋綜合征病毒液混合，然后與吐溫-80混合均勻，制得水相；(4)油相制備：將白油和司本－80混合均勻，作為油相。(5)乳化：將水相和油相混合均勻，即得雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗。在本發明中，0.3ml所述二聯滅活疫苗中雞減蛋綜合征病毒AV127株的含量≥2000HAU，禽腦脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50。優選的技術方案中，步驟(1)中減蛋綜合征病毒液的血凝價≥1:10240，0.2ml禽腦脊髓炎病毒液的病毒含量≥107.0EID50。優選的技術方案中，步驟(2)中滅活的減蛋綜合征病毒液和禽腦脊髓炎病毒液中甲醛的體積百分濃度為0.15％-0.25％優選的技術方案中，步驟(3)中混合病毒液與吐溫-80按照體積比為96∶4進行混合。優選的技術方案中，步驟(4)中所述白油和司本－80混合的體積比為94∶6。優選的技術方案中，步驟(5)所述水相和油相混合的體積比為1:2-4。有益效果：本發明雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗中含有的禽腦脊髓炎病毒HM08株，是申請人自行分離、篩選、鑒定的，該毒株在雞胚上培養的毒價高，0.2ml病毒液病毒含量≥107.0EID50，毒價為已報道毒株細胞培養的100倍以上，免疫原性好，交叉保護性好，對雞和環境均安全。本發明二聯滅活疫苗，免疫后抗體水平高、持續時間長，保護率高，能較好地控制禽腦脊髓炎與雞減蛋綜合征的發生與流行。本發明制備雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的方法，簡單，安全。因為制備方法中對病毒液進行了濃縮，所以提高單位體積疫苗中的抗原含量，有效降低了使用劑量，達到同樣的免疫效果。附圖說明圖1RT-PCR擴增電泳結果，其中1是MarkerDL2000，2是VP1，3是VP2。具體實施方式實施例1禽腦脊髓炎HM08株的篩選與鑒定1.病毒的分離將具有禽腦脊髓炎病理特征的病雛處死，無菌采集病、死雛雞腦組織后混合，反復凍融3次后在無菌容器中研磨，用PBS緩沖液制成1∶3的懸液，按1000IU/ml加入青霉素、鏈霉素，經3000r/min離心20分鐘后，取上清液，經卵黃囊接種6日齡的SPF雞胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日齡，觀察雞胚病變，如接種后12日內未出現明顯病變，將胚腦取出，勻漿，用同批尿囊液或PBS緩沖液按1∶3制成懸液，置滅菌的容器中凍融3次，3000r/min離心20分鐘，取上清液，進行下一代傳代培養。若出現雞胚病變后，收獲典型病變雞胚的腦組織混合，勻漿，用同批尿囊液或PBS緩沖液按1∶3(體積比)制成懸液，置滅菌的容器中凍融3次，3000r/min離心20分鐘，取上清液，-20℃保存備用。2.禽腦脊髓炎病毒有限稀釋法純化將本實施例標題1中病變雞胚腦組織處理后得到的上清液，按1∶10、1∶100、1∶1000倍稀釋，分別經卵黃囊接種6日齡的SPF雞胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育。孵化至18日齡，觀察雞胚病變。棄去72小時以內的死亡雞胚。收獲72小時以后的、具有發育遲緩、矮小、腦部水腫、肌肉進行性萎縮、腳趾變形和檳榔肝等AE特征性病變的雞胚。選取接種最高稀釋倍數的上清液、且在12日內出現典型禽腦脊髓炎病變的雞胚腦組織，混合、勻漿，用同批尿囊液按體積比為1∶3混合制成懸液，置滅菌的容器中反復凍融3次，3000r/min離心20分鐘，取上清液，再次同上法處理，卵黃囊接種6日齡的SPF雞胚10枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育，孵化至18日齡，觀察雞胚病變。收獲典型病變雞胚的腦組織混合，勻漿，與2倍體積的同批尿囊液混合，制成懸液，置滅菌的容器中凍融3次，3000r/min離心20分鐘，取上清液，用于病毒進一步純化，直至同批腦組織懸液不同稀釋度接種雞胚后發病率均達到100％，得到E1代種毒。3.E1代種毒對雞胚的毒力將E1代種毒作1∶100倍稀釋，經卵黃囊途徑接種6日齡的SPF雞胚20枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃繼續孵育。定時照蛋，及時取出死亡胚。觀察接種12天后出現雞胚活性減弱、發育不良、矮小、肌肉萎縮、腳趾變形和檳榔肝等AE特征性病變。結果如表1。20枚胚中24小時死亡胚有3枚；至接種12天后，有8枚死亡，9枚活胚，且均出現發育不良、矮小、肌肉萎縮、腳趾變形、檳榔肝等AE特征性病變，病變率達100％。表1E1代種毒對雞胚的毒力測定結果4.種毒對雛雞的毒力用不同含量的E1代種毒病毒液，腦內分別接種1日齡、7周齡的SPF雞，每只雞接種后觀察21天統計AE典型癥狀的發病率，結果表明：攻毒劑量為200EID50、500EID50、1000EID50/0.03ml/只，對1日齡的SPF雞，接種后7～14天出現精神沉郁、站立不穩、喜臥、癱瘓和共濟失調等AE典型的神經癥狀，AE典型癥狀的發病率分別可以達到10/10、10/10、10/10；對7周齡的SPF雞，攻毒劑量為200EID50、500EID50、1000EID50/0.03ml/只，接種后7～19天出現精神沉郁、站立不穩、喜臥、癱瘓和共濟失調等AE典型的神經癥狀，AE典型癥狀的發病率分別達到8/10、10/10、10/10。5.毒種的傳代將E1代種毒病毒液進行1∶100倍稀釋后，經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚10枚，每胚接種0.2ml。接種后，置37℃繼續孵化，每8小時照蛋一次，及時取出死亡胚，棄去72小時以內的死亡雞胚，收獲72小時以后的死亡雞胚或具有AE特征性病變的雞胚：雞胚發育遲緩、矮小、腦部水腫、肌肉進行性萎縮、腳趾變形和檳榔肝。從72小時以后的死亡雞胚和具有AE特征性病變的雞胚中收集腦組織混合，用同批尿囊液按體積比為1∶3混合制成懸液，勻漿，置滅菌的容器中反復凍融3次，3000r/min離心20分鐘，取上清液，分裝，標記為E2代種毒。病毒如此反復傳到E15代。6.種毒病毒含量測定測量各代次種毒的病毒含量。用滅菌生理鹽水將種毒作10倍稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6這4個稀釋度，每個稀釋度經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚5枚，每胚接種0.2ml。接種后，置37℃繼續孵化，每8小時照蛋一次，及時取出死亡胚，棄去72小時以內的死亡雞胚，視72小時以后的死亡雞胚或具有下列癥狀之一：雞胚發育遲緩、矮小、腦部水腫、肌肉進行性萎縮、腳趾變形和檳榔肝為AE病變。根據雞胚死亡及病變個數，按Reed—Muench法計算病毒含量。各代次種毒的病毒含量見表2。表2各代次種毒病毒含量測定結果種毒代次病毒含量：EID50/0.2mlE1105.56E2107E3107E4107E5107E6107.5E7107.4E8107.36E9107.2E10107.3E11107.2E12107.3E13107.4E14107.3E15107.367.E15代種毒特異性試驗用生理鹽水將E15代種毒稀釋為104EID50/0.2ml，與等量抗AE特異性血清和陰性血清分別混合，37℃作用60分鐘，經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚各5枚，同時設病毒對照組、陽性血清對照組、陰性血清對照組和生理鹽水對照組，同條件觀察12天，判定結果。特異性試驗分組及結果如表3所示，接種后連續觀察12天，病毒中和組、陰、陽性血清對照組、空白對照組一致，雞胚均活，未出現雞胚病變；病毒對照組和陰性血清中和組雞胚AE典型癥狀的病變率均達100％。特異性試驗結果說明E15代種毒是禽腦脊髓炎病毒。表3E15種毒代特異性檢測8.無菌檢驗按照現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。E15代種毒分別接種TG小瓶，37℃培養3天，無菌生長。轉種的TG小管、GP小管、GA斜面培養5天后均無菌生長。接種支原體液體培養基、再轉接固體培養基，觀察結果均陰性。雞胚外源性病毒檢測，特異性血清中和后接種雞胚無一死亡，尿囊腔、尿囊膜HA價均為零。細胞外源性病毒檢測，禽網狀內皮組織增生癥病毒、禽白血病病毒、紅細胞吸附試驗均為陰性。9.E15代種毒的PCR檢測根據GenBank上公布的AEV病毒基因序列，針對保守基因VP1和VP2分別設計了1組引物。針對基因VP1的上游引物：GGACAAGGAACCACAGGGAC，下游引物：TCCAGTGGCGTGTAGAAAGG。針對基因VP2的上游引物：ACGGTAGACCAGAGTTCAGTTAG，下游引物：ATGGCACCTTCATCCTTACA。將E15代種毒用0.1mol/LPBS(pH7.2)緩沖液按1：3稀釋,反復凍融3次,5000r/min離心20分鐘,取上清。用Trizol試劑(Gibco公司產品)從上清液中抽提RNA。提取出的RNA用經DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水溶解,用于合成第一條cDNA鏈。用5μlRNA作為模板,使用延長反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。分別用基因VP1或VP2引物進行PCR擴增。PCR產物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳,用DNA分子質量標準確定產物的大小。擴增的片段送上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。采用DNAStar軟件對測得的VP1基因的核苷酸序列和VP2基因序列進行分析,并分別與GenBank中AEV毒株的相應序列進行比較。圖1可見，VP1擴增片段約510bp，VP2擴增片段約420bp，與目的片段大小吻合。VP1擴增片段與GenBank中AY275539.1、AY466473.1、AY517471.1、JN986828.1的同源性分別為94.2％、99.8％、99.8％、94％。VP2擴增片段與GenBank中EU327593.1、AY275539.1、AY517471.1的同源性分別為81％、98.6％、100％。因此，PCR檢測結果也證明E15代種毒是禽腦脊髓炎病毒。10.紅細胞凝集價測定：用滅菌生理鹽水將E15代種毒作2倍梯度稀釋，進行紅細胞凝集價測定。結果均為陰性。11.免疫原性：以E15代種毒制備疫苗，將疫苗以不同免疫劑量頸部皮下注射21日齡SPF雞10只，設同日齡SPF雞5只對照，免疫3周后用AEV同源毒株腦內接種攻毒(每只雞劑量為1000個EID50)，觀察14～21天，結果免疫雞全部保護，對照雞全部發病。結果說明此病毒的免疫原性好。將E15代種毒命名為禽腦脊髓炎病毒HM08株。保藏信息如下：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所。分類命名：禽腦脊髓炎病毒。參椐的生物材料：HM08株。保藏號：CGMCCNO.7759。保藏日期：2013年6月20日。實施例2雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的制備1.制苗用毒種來源：雞減蛋綜合征病毒AV127株，購自中國獸醫藥品監察所。禽腦脊髓炎病毒HM08株，保藏號：CGMCCNO.7759。2.病毒液的制備：(1)雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液的制備：將雞減蛋綜合征病毒AV127株接種易感鴨胚，收獲鴨胚液作為雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液。具體方法如下：接種：取雞減蛋綜合征病毒AV127株，用滅菌生理鹽水作適當稀釋(如10-1或10-2)，尿囊腔內接種8～10日齡易感鴨胚，每胚0.1ml，接種后密封針孔，置36～37℃繼續孵育，不必翻蛋。孵育和觀察：鴨胚接種后，每日照蛋1次，將72小時以前死亡的鴨胚棄去。此后，每4～8小時照蛋1次，死亡的鴨胚隨時取出置于2～8℃冷卻；直至120小時，不論死亡與否，全部收回，氣室向上，置于2～8℃冷卻。收獲：將冷卻的鴨胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術剝除氣室部位卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取鴨胚液作為雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液。在雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液中，加入抗生素(每毫升抗原中青霉素終濃度800單位，鏈霉素終濃度800單位)，測定紅細胞凝集價，紅細胞凝集價應≥1∶10240(按現行《中國獸藥典》附錄微量法測定)。同時按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。注意：在吸取胚液前，對每個鴨胚均應注意檢查，凡出現腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。(2)禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液的制備：具體方法如下：接種取禽腦脊髓炎病毒HM08株，用滅菌PBS緩沖液稀釋，卵黃囊接種5～6日齡SPF雞胚，每胚0.2ml(1000EID50)，置37℃孵育，不必翻蛋。孵育和觀察前3日內，每天照蛋一次，棄去死亡胚；3日后，每8個小時照蛋一次，及時取出死亡胚，置2-8℃冷卻。收獲孵化致16日齡，將雞胚全部取出，置2-8℃冷卻過夜。取2-8℃冷卻的雞胚，用強力碘消毒蛋殼氣室部位經75％酒精二次消毒后，以無菌方法去除蛋殼，分別收集具有AE特征性病變雞胚的尿囊液、絨毛尿囊膜(CAM)和胚體。將絨毛尿囊膜(CAM)和胚體用組織搗碎機勻漿，用收獲的雞胚尿囊液與無菌PBS或生理鹽水作為稀釋液，按體積比1:2(組織1份，稀釋液2份)制成懸液，凍融3次后，置滅菌容器中，3000轉離心20分鐘，取上清作為禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液，置-20℃備用。其中，AE特征性病變雞胚是指：72小時以后的死亡雞胚或具有下列癥狀之一的雞胚：雞胚發育遲緩、矮小、腦部水腫、肌肉進行性萎縮、腳趾變形和檳榔肝。經檢測，0.2ml禽腦脊髓炎HM08株病毒液的病毒含量應≥107.0EID50。同時按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。注意：在吸取胚液前對每個雞胚均應注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液渾濁及有任何污染可疑者，棄去不用。3.病毒液的滅活：采用甲醛分別滅活雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液和禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液。雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液在滅活前需要濃縮，才能保證每羽份二聯滅活疫苗中雞減蛋綜合征病毒的含量≥2000HAU。禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液需要進行適當的稀釋，然后滅活，才能保證每羽份二聯滅活疫苗中禽腦脊髓炎病毒的含量≥105.0EID50。滅活病毒液中甲醛的體積百分數為0.15％-0.25％。(1)病毒液的濃縮或稀釋：將雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液和禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液分別進行連續離心澄清(連續離心轉速：10000rpm/min)，除去病毒液中的大顆粒，使其成為透明或半透明溶液。用病毒超濾濃縮系統(購自美國Millipore公司，超濾膜孔徑：300KD)將雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液進行適當濃縮，獲得濃縮病毒液。用超濾濃縮過程中產生的濾出廢液接種雞胚，均應無血凝性。用生理鹽水對澄清后的禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液進行適當倍數的稀釋。(2)病毒液的滅活：將上述濃縮或稀釋后的病毒液分別置無菌滅活罐內，加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合。加完甲醛溶液后用無菌壓縮空氣將其壓入另一無菌滅活罐內，置37℃下滅活，雞減蛋綜合征病毒AV127株滅活病毒液中甲醛的體積百分數為0.15％-0.25％，滅活36小時；禽腦脊髓炎病毒HM08株滅活病毒液中甲醛的體積百分數為0.15％-0.25％，滅活48小時。從滅活病毒液中取樣進行滅活檢驗。滅活病毒液置2～8℃保存。4.半成品檢驗：(1)無菌檢驗：按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。(2)病毒含量測定：分別檢測濃縮或稀釋后病毒液中病毒含量，換算至原病毒液，應該達到：雞減蛋綜合征病毒AV127株病毒液的紅細胞凝集價應≥1∶10240，0.2ml禽腦脊髓炎HM08株病毒液的病毒含量應≥107.0EID50。(3)滅活檢驗：雞減蛋綜合征病毒AV127株滅活病毒液滅活檢驗：取滅活病毒液，經尿囊腔接種10日齡易感鴨胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃孵育，觀察120小時，雞胚非特異性死亡應不超過1枚，對所有胚液分別測定紅細胞凝集價，均應不出現血凝，并盲傳1代，測定紅細胞凝集價，均應不出現血凝。禽腦脊髓炎病毒HM08株滅活病毒液滅活檢驗：取滅活病毒液，經卵黃囊接種5～6日齡SPF雞胚10枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，棄去72小時內死亡雞胚，觀察12天，雞胚非特異性死亡應不超過1枚。所有雞胚均健活均無AE病變，取上述雞胚的腦，按1:3(體積比)制成懸液，再接種5-6日齡SPF雞胚10個，每胚0.2ml，孵化至18日齡，剖檢，應無AE病變。5.雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的制備：(1)油相制備：將注射用白油和司本－80按照體積比為94：6混勻，作為油相。(2)水相制備：將雞減蛋綜合征病毒AV127株滅活病毒液和禽腦脊髓炎病毒HM08株滅活病毒液混合，得到混合病毒液；將混合病毒液與吐溫-80按照體積比96∶4混合，充分攪拌直至吐溫-80完全溶解，即得水相溶液。(3)乳化：將油相和水相按照體積比3∶1混合，攪拌均勻獲得雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗。具體操作步驟如下：將3份油相放入乳化罐內，啟動乳化罐攪拌機攪拌，同時徐徐加入水相一份，加完后繼續攪拌10～15min，打開均質機進出口開關，啟動均質機，使乳化液經均質機進入另一罐，如此反復乳化數次(一般6～8次)，乳化后取10ml疫苗，以3000r/min離心15分鐘，應不出現分層現象。制苗過程中，可以根據兩種病毒液具體的病毒含量，對病毒液的濃縮或稀釋倍數及混合的體積比進行調整，只要保證每羽份(0.3ml)雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗中，雞減蛋綜合征病毒AV127株含量≥2000HAU，禽腦脊髓炎病毒HM08株含量≥105.0EID50即可。6.作用與用途禽腦脊髓炎滅活疫苗用于預防禽腦脊髓炎。7日齡以上雞均可免疫接種，接種后14日產生免疫力，免疫期為10個月。7.用法與用量每只雞頸部皮下注射0.3ml。實施例3雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗雙倍劑量接種安全試驗按實施例2制備3批次雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗(批號：20130328、20130427、20130909，0.3ml二聯滅活疫苗中AV127株含量為2000HAU，HM08株含量為105.0EID50)。考察對象為7日齡SPF雞(購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司)和7日齡三黃肉雞(購自南京石佛寺養雞場)。各批雞購回后，適應數天，核實雞的全身狀況和臨床疾病情況，剔除弱雞，選擇健康雞進入試驗。對SPF雞分別雙倍劑量(0.6ml/只)頸部皮下注射三批雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，每次設1組不接種，作為對照；對三黃肉雞分別雙倍劑量(0.6ml/只)頸部皮下注射三批雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，每次設1組不接種，作為對照。接種后觀察14天內是否出現由疫苗引起的任何局部和全身反應，接種后14天、28天各隨機抽取試驗雞5～10只，剖檢注射部位，檢查疫苗的吸收情況。結果：用雙倍劑量雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗對7日齡SPF雞和7日齡三黃肉雞進行接種。接種后14日內，未觀察到臨床異常，采食、飲水正常，健康情況良好，未發現由疫苗引起的任何局部和全身反應，具體見表4。接種后14天，各組取5～10只雞剖檢注射部位，80％以上肉眼可見少量粟粒樣大小顆粒未吸收完全；注射后28天剖檢，70％以上疫苗已基本吸收，注射部位未見由疫苗接種引起的異常反應，具體見表5。因此，雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗雙倍劑量接種是安全的。表4雙倍劑量接種雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗后14天內臨床觀察結果表5雙倍劑量接種雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗的吸收檢驗結果實施例4雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗免疫效力試驗按實施例2方法制備雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗(批號：20130328、20130427、20130909，抗原含量見實施例3)，并按下列方法進行成品的效力檢驗。1.血清學效力檢驗：每批苗取1月齡SPF雞15只，其中10只作為免疫組，每只SPF雞頸部皮下注射0.3ml所述二聯滅活疫苗；另5只作為對照組，不免疫。免疫后21天采血，分離血清，測定AE抗體中和指數，參照現行《中國獸藥典》方法進行；免疫后28天采血，分離血清，測定雞減蛋綜合征抗體水平，參照現行《中國獸藥典》方法進行血凝抑制試驗。三批次二聯滅活疫苗組免疫后21天，AE抗體中和指數分別為101.50、102.17、102.85，均不低于101.1的標準，達到合格標準具體，見表6；免疫后28天，雞減蛋綜合征平均血凝抑制抗體效價分別為8.4log2、8.8log2、9.1log2，均不低于7log2的標準，對照組均不高于2log2，達到合格標準，具體見表7。表6三批次二聯苗AE抗體中和指數測定結果批號AE抗體中和指數20130328101.5020130427102.1720130909102.85表7三批次二聯苗雞減蛋綜合征血凝抑制檢驗結果2.禽腦脊髓炎免疫攻毒保護效力檢驗：取本實施例標題2中免疫21天后的免疫組SPF雞和對照SPF雞用禽腦脊髓炎病毒HM08株的病毒液進行腦部接種，攻毒劑量為1000EID50/0.03ml/只，觀察至21天，對照組全部發病，具有腦脊髓炎的典型癥狀，免疫組全部正常。結果表明：免疫組攻毒后保護率達到100％，對照組發病率為100％，具體見表8。表8三批次二聯苗禽腦脊髓炎攻毒保護效力試驗結果實施例5雞減蛋綜合征和腦脊髓炎二聯滅活疫苗與同類產品比較試驗為了對比本發明雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗與目前市場銷售的其他同類產品的免疫效果，按實施例2方法制備雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗，批號為20130909，抗原含量見實施例3。購買北京獸醫生物藥品廠的雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性腦脊髓炎四聯滅活疫苗產品(生產批號：127304；產品批準文號：獸藥生字(2008)010322042；)作為同類制品對照疫苗，該產品中減蛋綜合征病毒HSH23株病毒液血凝價≥1:10240，禽腦脊髓炎病毒VanRoekel株含量≥105.0EID50/0.2ml，頸部皮下或肌肉注射。為了與同類制品相區分，下述實驗中，將本發明雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗簡稱為自制疫苗。將SPF雞設為自制疫苗組、同類制品組和對照組，自制疫苗組和同類制品組分別有20只雞，對照組10只雞。接種方法：自制疫苗組與同類制品組均采用頸部皮下注射與其組名對應的疫苗，自制疫苗組按照劑量0.3ml/只接種，同類制品組按照劑量0.5ml/只接種，對照組不接種。接種后7日、14日、21日，自制疫苗組、同類制品組分別隨機抽取10只雞采血，測定減蛋綜合征抗體和AE抗體中和指數。接種后21日，用禽腦脊髓炎病毒HM08株病毒液0.03ml(含1000EID50)和禽腦脊髓炎病毒強毒株LC-95株(購于山東省農業科學院家禽研究所)病毒液0.03ml(含1000EID50)分別腦內接種免疫組(自制疫苗組與同類制品組)10雞，對照組各5只雞，觀察21日，統計各組發病情況。接種28日后，自制疫苗組、同類制品組分別抽取10只雞采血，測定減蛋綜合征抗體水平。通過測定免疫后抗體產生期、血清學效力檢驗、交叉攻毒保護試驗對比兩種疫苗的免疫效果。1.雞減蛋綜合征病毒抗體產生期測定結果：兩種疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周齡SPF雞后，雞減蛋綜合征病毒抗體在免疫后7天產生，抗體產生期比較試驗的結果表明：采用自制苗免疫SPF雞后7天、14天、21天，產生的抗雞減蛋綜合征病毒抗體效價分別為3.6log2、7.7log2、8.8log2，均高于同類苗免疫相同時間后產生的抗體水平。結果見表9。雞減蛋綜合征病毒抗體大于7log2為合格。表9SPF雞雞減蛋綜合征抗體產生期比較結果2.禽腦脊髓炎病毒抗體產生期中和指數測定結果：兩種疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周齡SPF雞后，禽腦脊髓炎病毒抗體在免疫后7～14天產生，抗體產生期比較試驗的結果表明：采用自制苗免疫SPF雞后7天、14天、21天，AE抗體中和指數分別為100.35、101.27和101.87，均高于同類苗免疫相同時間后產生的抗體水平，自制苗免疫SPF雞后第14天，AE抗體中和指數達到合格；同類制品免疫后第21天，AE抗體中和指數才達到合格。上述結果說明，自制苗顯著縮短了免疫窗口期。結果見表10。表10SPF雞禽腦脊髓炎抗體產生期比較結果3.雞減蛋綜合征效力檢驗：自制疫苗按0.3ml/只免疫SPF雞后28天，雞減蛋綜合征病毒抗體水平為9.1log2；同類制品免疫組雞減蛋綜合征病毒抗體水平為7.6log2，對照組抗體水平為0log2。說明自制二聯苗中雞減蛋綜合征的抗體效價較同類產品高1.5個滴度，結果見表11。表11雞減蛋綜合征血清學效力檢驗結果(log2)4.禽腦脊髓炎血清學效力檢驗結果：各批苗免疫后21天AE抗體中和指數如下，自制疫苗免疫組為101.87，同類制品免疫組抗體水平為101.35，說明自制二聯苗中禽腦脊髓炎的抗體效價高于同類產品，結果見表12。表12AE抗體中和指數測定結果組別AE抗體中和指數自制疫苗101.87同類制品101.355.禽腦脊髓炎交叉攻毒試驗結果：各組用禽腦脊髓炎病毒HM08株和LC-95株分別攻毒。自制苗免疫后21天，分別用HM08株和LC-95株攻毒均獲得100％保護；而同類制品用HM08株攻毒的保護率僅為70％，LC-95株攻毒的保護率為90％，結果見表13。表13禽腦脊髓炎交叉攻毒保護結果實施例6雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗對蛋雞及其子代的免疫效力檢測實施例2制備的雞減蛋綜合征和禽腦脊髓炎二聯滅活疫苗(自制滅活疫苗，批號為20130909，抗原含量見實施例3)對蛋雞及其子代的免疫效力。將自制滅活疫苗與同類制品：雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、傳染性腦脊髓炎四聯滅活疫苗(購自北京獸醫生物藥品廠，該產品含有禽腦脊髓炎病毒VanRoekel株)分別免疫18周齡海蘭蛋種雞20只，自制疫苗按照劑量0.3ml/只接種，同類制品按照劑量0.5ml/只接種，另20只不免疫作對照。免疫后7天、14天、21天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月采血，測定減蛋綜合征抗體水平和AE抗體中和指數。并收集免疫后1個月、2個月、3個月、4個月、5個月前后3天的雞蛋各30枚；孵化至5-6日齡時，各取10個雞胚，按照現行《中國獸藥典》進行禽腦脊髓炎雞胚敏感性試驗，以檢測自制滅活疫苗免疫蛋雞后對子代的保護率及保護時間。1.雞減蛋綜合征病毒抗體測定結果：自制苗0.3ml免疫18周齡海蘭蛋雞后，7天開始產生抗體，28天效檢抗體水平達到8.5log2，免疫持續期測定到10個月，抗體水平仍有3.7log2，且抗體水平遠高于同類制品。結果見表14。表14：蛋雞減蛋綜合征抗體水平結果2.AE抗體中和指數測定：自制苗0.3ml免疫18周齡海蘭蛋雞后，7天開始產生抗體，免疫持續期可達10個月，且抗體水平遠高于同類制品。自制苗免疫蛋雞后可以對子代提供3個月的保護，保護率高于同類制品，結果見表15、表16。表15禽腦脊髓炎病毒對蛋雞抗體持續期比較結果表16各滅活疫苗對雞胚的敏感性試驗當前第1頁1 2 3