本發明屬于材料領域，涉及一種膠原蛋白微纖維及其制備方法。
背景技術：
：在日常生活中突發性事故的急救治療，在醫院對病人的手術過程中的創傷止血，特別是戰爭中受傷戰士的救護，病患者的局部快速且有效的止血非常重要。因為未受控制的出血是導致突發事故，術中大出血或戰場傷亡的主要原因。在伊拉克戰爭中，戰場上有50％陣亡人員是由于出血過多導致的。盡早的控制出血成為降低患者傷亡的最佳策略。創傷止血材料是應用于創傷出血救治，是救護常用的物品，創傷止血材料的研究對于創傷救治具有重要意義。止血帶是能控制出血的救生器材，但對于人體很多部位如胸、腹、頭、頸等止血帶是無法使用或無效的。臨床常用的止血材料如止血紗布、止血繃帶存在著局限性：如止血時間較長、易與傷口粘連而不易換藥、對傷口的感染和化膿無能為力，同時對于不規則形狀、深、窄、動脈破裂等現場常見創傷的止血效果很不理想。因此，隨著醫學界對止血材料止血性能要求的提高，開發止血效果更佳、更適用于臨床的新型止血材料勢在必行。技術實現要素：本發明的目的是一種膠原蛋白微纖維及其制備方法。本發明提供的制備膠原蛋白微纖維的方法，包括如下步驟：1)以離體的哺乳動物的真皮和/或皮下組織層為原料，去除所述原料中的非膠原蛋白成分得到粗產物；2)去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質，得到所述膠原蛋白微纖維。上述方法的步驟1)中，哺乳動物為豬、牛或馬；所述步驟1)中，去除所述原料中的非膠原蛋白成分的步驟包括：將所述原料依次用酸、緩沖液、表面活性劑、水、酸、水、緩沖液浸泡。其中，所述水均為純化水；所述酸均為醋酸、鹽酸、檸檬酸的水溶液或乳酸的水溶液；所述酸的質量百分濃度均為0.5-4％，具體可為2％或3％；所述緩沖液均為PBS緩沖液，pH值均為7-8，具體為7.4；所述表面活性劑為TritonX-100、Tween-80或Tween-40的水溶液；濃度為0.5-3g/100ml，具體為0.6g/100ml或1g/100ml；所述水為純化水。第一次用酸浸泡步驟中，時間為2-24h，具體為5h或10h；溫度為4-50℃，具體為10℃；第二次用酸浸泡步驟中，時間為5-72h；溫度為4-50℃；用緩沖液浸泡步驟中，時間均為20-60min，溫度均為4-30℃；用表面活性劑浸泡步驟中，時間為10-72h，具體為48h；溫度為20-50℃；所述用水浸泡的次數為2-5次，優選三次；每次浸泡的時間為4-30min，優選5min。所述步驟2)中，去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質的步驟包括：將步驟1)所得粗產物與酸混合。所述酸為醋酸、鹽酸、檸檬酸的水溶液或乳酸的水溶液；所述酸的質量百分濃度為0.01-0.5％，具體為0.1％；所述步驟1)所得粗產物與酸的用量比為0.1-6g：100mL；所述方法還包括如下步驟：在所述步驟1)之后，所述步驟2)去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質步驟之前，將步驟1)所得粗產物于水中孵育，孵育完畢后進行一次脫水；所述孵育步驟中，溫度為35-50℃，具體為37℃；時間為0-72h，具體為24h或48h，且所述時間不為0；所述步驟1)所得粗產物與水的質量比為1:0.25-3，具體為1:3或1:2；在所述步驟2)去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質步驟之后，將體系進行一次粉碎，過濾，棄濾液，將濾渣中和，再過濾，收集所得固體，二次脫水，干燥，回潮，再進行二次粉碎。具體的，所述一次脫水為離心脫水；所述一次粉碎步驟中，粉碎時間為2-10min，具體為5min；所述中和步驟是在堿溶液或緩沖液中進行；所述堿溶液和緩沖液的pH值均為7-14，具體為7.4；所述堿溶液具體為NaOH或KOH的水溶液；所述緩沖液具體為PBS緩沖液；中和的時間為30-240min，具體為60min；所述二次脫水步驟中，所用脫水劑為無水乙醇或乙醇的水溶液；所得固體與所用脫水劑的重量比為1:1-1:10，具體可為1:3或1:5；所述乙醇的水溶液的質量百分濃度為75％-98％或95-98％；用無水乙醇脫水的步驟包括：先用無水乙醇進行第一步脫水后，棄溶液留殘渣，再用無水乙醇對其進行第二步脫水；所述第一步和第二步脫水的時間具體均為5-30min；用乙醇的水溶液脫水的步驟包括：先用75％的乙醇水溶液進行一次脫水，再用95-98％的乙醇水溶液進行二次脫水；所述一次和二次脫水的時間具體均為5-30min。該方法能夠減少乙醇用量。所述干燥步驟中，溫度為室溫；所述回潮步驟中，溫度為18-25℃；濕度為30-40％；時間為7-14d；所述二次粉碎步驟中，時間為1-30min；溫度為4-40℃。所述步驟2)中，所述水均為純化水；另外，按照上述方法制備得到的膠原蛋白微纖維及該膠原蛋白微纖維在止血或制備止血產品中的應用，也屬于本發明的保護范圍。本發明所制備的膠原蛋白微纖維與目前其他的膠原蛋白微纖維專利相對比，制備工藝簡化，不需要引入復雜的生產設備，從而避免了在生產過程中難以控制微生物，重金屬等因素，能夠滿足工業化生產的要求。與目前市場上已有的海綿止血材料相對比，本發明所制備的膠原蛋白止血微纖維適用于大面積彌漫性出血，具有止血速度快，止血效率高、重金屬含量合格等優點，具有廣闊的應用前景。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、一、去除原料中的非膠原蛋白成分1、由專人從規范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的豬皮，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存；2、將冷凍的材料解凍后對其進行充分清洗，同時除去不適合加工的部分；3、使用質量百分濃度為2％的醋酸浸泡處理解凍后的原料10h，溶液溫度控制在10℃左右，其目的是破壞細胞結構，脫除細胞以及非膠原蛋白結構；將處理后的原料使用pH值為7.4的PBS緩沖液進行浸泡清洗60min，使其最終pH值為7.4；4、將原料清洗后使用0.6g/100ml的表面活性劑TrironX-100的水溶液浸泡處理48h，處理溫度為20℃，目的是進一步除去原料中的非膠原蛋白成分，隨后使用純化水浸泡清洗，清洗時間為30min，清洗次數為5次，清洗后使用離心甩干機甩干；5、將表面活性劑處理后的樣品使用質量百分濃度為3％的醋酸浸泡處理，處理溫度為10℃，處理時間為10h；將處理好的樣品使用純化水浸泡沖洗5次，每次5min；隨后使用pH值為7.4的PBS緩沖液進行緩沖處理，時間為60min，得到粗產物；二、去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質：6、將處理后的粗產物與純化水混合，粗產物與水的質量比為1:3，孵育溫度為37℃，孵育時間為24h；隨后進行離心脫水；7、將孵育后的樣品與質量百分濃度為0.1％的醋酸混合進行一次粉碎，步驟1)所得粗產物與醋酸的用量比為6g：100mL，粉碎時間為5min；8、將打碎后的樣品進行過濾，濾掉未完全打碎的材料，收集濾渣進行用pH值為7.4的PBS緩沖液中和60min，發現有沉淀生成，將沉淀進行過濾，棄濾液，收集所得固體；9、將所得固體使用乙醇進行二次脫水，首先使用75％的乙醇進行脫水前處理，脫水時間為5min；隨后使用98％的乙醇溶液進行脫水，脫水時間為5min；該脫水步驟可使得微纖維形態較好。10、將脫水后的膠原蛋白長纖維進行室溫干燥，同時將得到的膠原蛋白長纖維進行回潮，回潮溫度為25℃，濕度為40％，回潮時間為7d；11、將回潮后的膠原蛋白長纖維使用低速粉碎機進行粉碎，粉碎時間為5min，溫度為20℃，制得膠原蛋白微纖維材料。實施例2：一、去除原料中的非膠原蛋白成分1、由專人從規范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的豬皮，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存；2、將冷凍的材料解凍后對其進行充分清洗，同時除去不適合加工的部分；3、使用質量百分濃度為3％的醋酸浸泡處理解凍后的原料5h，溶液溫度控制在10℃左右，其目的是破壞細胞結構，脫除細胞以及非膠原蛋白結構；將處理后的原料使用pH值為7.4的PBS緩沖液進行浸泡清洗60min，使其最終pH值為7.4；4、將原料清洗后使用1g/100ml的TrironX-100溶液浸泡處理48h，目的是進一步除去原料中的非膠原蛋白成分，隨后使用純化水浸泡清洗，清洗時間為5min，清洗次數為5次，清洗后使用離心甩干機甩干；5、將表面活性劑處理后的樣品使用質量百分濃度為3％的醋酸浸泡處理，處理溫度為10℃，處理時間為12h；將處理好的樣品使用純化水浸泡沖洗5次，每次5min；隨后使用pH為7.4的PBS緩沖液進行緩沖處理，時間為60min，得到粗產物；二、去除步驟1)所得粗產物中的非膠原蛋白質：6、將處理后的粗產物與純化水混合，粗產物與水的質量比為1:3，孵育溫度為37℃，孵育時間為48h；隨后進行離心脫水；7、將孵育后的樣品與質量百分濃度為0.1％的醋酸混合進行粉碎，步驟1)所得粗產物與醋酸的用量比為6g：100mL，粉碎時間為5min；8、將打碎后的樣品進行過濾，濾掉未完全打碎的材料，收集濾渣進行用pH值為7.4的PBS緩沖液中和60min，發現有沉淀生成，將沉淀進行過濾，棄濾液；9、使用乙醇進行脫水，首先使用75％的乙醇進行脫水前處理，脫水時間為5min；隨后使用98％的乙醇溶液進行脫水，脫水時間為5min；該脫水步驟可使得微纖維形態較好。10、將脫水后的膠原蛋白長纖維進行室溫揮發，同時將得到的膠原蛋白長纖維進行回潮，回潮溫度為25℃，濕度為40％，回潮時間為7d；11、將回潮后的膠原蛋白長纖維使用低速粉碎機進行粉碎，粉碎時長為10min，粉碎溫度為8-10℃，制得膠原蛋白微纖維材料。實施例3：膠原蛋白微纖維的理化性能檢測1、吸水率、吸水速度測試分別取實施例1、實施例2所制備的凍干后樣品，約為100mg，稱重m1，精確至0.001g。隨后加入存有過量生理鹽水的平面皿中，記錄樣品全部吸滿水的時間，即吸水速度。隨后用濾紙吸走樣品表面多余水分，稱重m2。計算吸收水分重量與樣品重量之比，重復測量5次，求得平均值，即可得到膠原蛋白微纖維相對于自身重量的吸水率(公式1)，具體結果見表1。吸水率＝(m2-m1)/m1*100％(1)可以發現：實施例1樣品的吸水速度、吸水率與實施例2樣品無明顯差別。2、脂肪含量分別取實施例1、實施例2所制備樣品，根據《中華人民共和國藥典》二部“胰酶脂肪檢測”中的方法檢測各膠原蛋白微纖維的脂肪含量。實驗結果見表1。結果表明，兩種處理方式得到的膠原蛋白微纖維樣品脂肪含量無明顯差異，均低于1％。3、DNA殘留測試分別取實施例1、實施例2所制備的樣品，根據《中華人民共和國藥典》三部“外源性DNA殘留量測定法”中的方法二“熒光染色法”檢測各膠原纖維的DNA殘留。實驗結果見表1。結果表明，兩個樣品的DNA含量均小于2ng/mg，則可以判定本專利的脫細胞工藝能夠去除免疫原性，在臨床手術使用具有較高安全性。表1脂肪含量和DNA含量測試結果4、細胞毒性參照醫療器械行業標準GB/T16886.5-2003中細胞毒性檢測中的MTT法，分別檢測實施例1、實施例2所制備樣品的細胞毒性。實驗結果見表2。結果表明，兩個樣品均無細胞毒性，臨床手術使用具有較高安全性。5、重金屬檢測參照《中華人民共和國藥典》二部附錄ⅧH“重金屬檢查法”，分別檢測實施例1、實施例2中所制備樣品的重金屬。重金屬指在試驗條件下能與硫代乙酰胺或硫化鈉作用顯色的金屬雜質。結果發現，實施例1、實施例2所得膠原蛋白微纖維材料中的重金屬含量合格，表明，并未在實驗操作過程中引入重金屬。實施例4、膠原蛋白微纖維的兔耳動脈止血試驗在兔子耳部中央動脈處用碘伏進行消毒和醫用酒精進行脫碘，后做1cm*1cm大小的創口，切斷中央動脈并撕下表皮，動脈血涌出后先用無菌醫用紗布吸收，然后將0.2g干燥的實施例1、2膠原蛋白微纖維或云南白藥施加于創面，并用無菌醫用紗布按壓止血，記錄完全止血時間，平行測試三次。具體時間見表2所示。結果顯示：和目前臨床上廣泛使用的云南白藥相比，膠原蛋白微纖維在兔耳創面的止血效果更好。并且，在實驗過程中發現，膠原蛋白微纖維在吸血后能夠堆積聚集，有效堵塞創口。實施例5、膠原蛋白微纖維的兔肝臟止血試驗在兔肝葉上做1cm*1cm創面，血液涌出后先用無菌紗布吸收，然后將0.2g干燥的實施例1、2所得膠原蛋白微纖維或云南白藥施加于創面，并用無菌醫用紗布按壓止血，記錄完全止血時間，平行測試三次。具體時間見表2所示。結果顯示，膠原蛋白微纖維的止血速度明顯優于云南白藥組；且可以發現，膠原蛋白微纖維對實質性臟器的止血效果更好。這是因為膠原蛋白微纖維在吸血后可以堵塞血管，相對于動脈出血，臟器出血則為隱蔽的毛細管滲血，出血速度慢，所以相對而言，其止血時間短。表2兔耳創面和圖肝臟創面完全止血時間組別耳創面止血時間(s)肝臟創面止血時間(s)實施例1101±870±5實施例295±669±6云南白藥組267±9198±11由實施例4、5可以證明，實施例1、2所制備的膠原蛋白微纖維具有優異的止血性能，適用于彌漫性的臟器出血術。當前第1頁1 2 3