本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

基于不同的臨床特點(diǎn)，貧血有不同的分類。如：按貧血進(jìn)展速度分急、慢性貧血；按骨髓紅系增生情況分增生性貧血(如溶血性貧血、缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞貧血等)和增生低下性貧血(如再生障礙性貧血)。

臨床上常從貧血發(fā)病機(jī)制和病因的分類：

1.紅細(xì)胞生成減少性貧血

造血細(xì)胞、骨髓造血微環(huán)境和造血原料的異常影響紅細(xì)胞生成，可形成紅細(xì)胞生成減少性貧血。

(1)造血干祖細(xì)胞異常所致貧血

1)再生障礙性貧血(AA)AA是一種骨髓造血功能衰竭癥，與原發(fā)和繼發(fā)的造血干祖細(xì)胞損害有關(guān)。部分全血細(xì)胞減少癥的發(fā)病機(jī)制與B細(xì)胞產(chǎn)生抗骨髓細(xì)胞自身抗體，進(jìn)而破壞或抑制骨髓造血細(xì)胞有關(guān)。

2)純紅細(xì)胞再生障礙貧血(PRCA)PRCA是指骨髓紅系造血干祖細(xì)胞受到損害，進(jìn)而引起貧血。依據(jù)病因，該病可分為先天性和后天性兩類。先天性PRCA即Diamond-Blackfan綜合征，系遺傳所致；后天性PRCA包括原發(fā)、繼發(fā)兩類。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分原發(fā)性PRCA患者血清中有自身EPO或幼紅細(xì)胞抗體。繼發(fā)性PRCA主要有藥物相關(guān)型、感染相關(guān)型(細(xì)菌和病毒，如微小病毒B₁₉、肝炎病毒等)、自身免疫病相關(guān)型、淋巴細(xì)胞增殖性疾病相關(guān)型(如胸腺瘤、淋巴瘤、漿細(xì)胞病和淋巴細(xì)胞白血病等)以及急性再生障礙危象等。

3)先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血(CDA)CDA是一類遺傳性紅系干祖細(xì)胞良性克隆異常所致的、以紅系無(wú)效造血和形態(tài)異常為特征的難治性貧血。根據(jù)遺傳方式，該病可分為常染色體隱陛遺傳型和顯性遺傳型。

4)造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病這些疾病造血干祖細(xì)胞發(fā)生了質(zhì)的異常，包括骨髓增生異常綜合征及各類造血系統(tǒng)腫瘤性疾病如白血病等。前者因?yàn)椴B(tài)造血，高增生，高凋亡，出現(xiàn)原位溶血；后者腫瘤性增生、低凋亡和低分化，造血調(diào)節(jié)也受到影響，從而使正常成熟紅細(xì)胞減少而發(fā)生貧血。

(2)造血微環(huán)境異常所致貧血

造血微環(huán)境包括骨髓基質(zhì)，基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子。

1)骨髓基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞受損所致貧血骨髓壞死、骨髓纖維化、骨髓硬化癥、大理石病、各種髓外腫瘤性疾病的骨髓轉(zhuǎn)移以及各種感染或非感染性骨髓炎，均可因損傷骨髓基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞，造血微環(huán)境發(fā)生異常而影響血細(xì)胞生成。

2)造血調(diào)節(jié)因子水平異常所致貧血干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素(IL)、粒-單系集落刺激因子(GM-CSF)、粒系集落刺激因子(G-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、血小板生長(zhǎng)因子(TGF)、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)等均具有正負(fù)調(diào)控造血作用。腎功能不全、肝病和垂體或甲狀腺功能低下等時(shí)產(chǎn)生EPO不足；腫瘤性疾病或某些病毒感染會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較多的造血負(fù)調(diào)控因子如TNF、IFN、炎癥因子等，均可導(dǎo)致慢性病性貧血(ACD)。

(3)造血原料不足或利用障礙所致貧血

造血原料是指造血細(xì)胞增殖、分化、代謝所必需的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類、維生素(葉酸、維生素B12等)、微量元素(鐵、銅、鋅等)等。任一種造血原料不足或利用障礙都可能導(dǎo)致紅細(xì)胞生成減少。

1)葉酸或維生素B₁₂缺乏或利用障礙所致貧血由于各種生理或病理因素導(dǎo)致機(jī)體葉酸或維生素B12絕對(duì)或相對(duì)缺乏或利用障礙可引起的巨幼細(xì)胞貧血。

2)缺鐵和鐵利用障礙性貧血這是臨床上最常見(jiàn)的貧血。缺鐵和鐵利用障礙影響血紅素合成，有稱該類貧血為血紅素合成異常性貧血。該類貧血的紅細(xì)胞形態(tài)變小，中央淡染區(qū)擴(kuò)大，屬于小細(xì)胞低色素性貧血。

2.溶血性貧血(HA)

即紅細(xì)胞破壞過(guò)多性貧血。

3.失血性貧血

根據(jù)失血速度分急性和慢性，慢性失血性貧血往往合并缺鐵性貧血。可分為出凝血性疾病(如特發(fā)性血小板減少性紫癜、血友病和嚴(yán)重肝病等)所致和非出凝血性疾病(如外傷、腫瘤、結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、消化性潰瘍、痔和婦科疾病等)所致兩類。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗紅細(xì)胞低下性貧血活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗紅細(xì)胞低下性貧血活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為40％和60％。

本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明組合物在制藥領(lǐng)域中的新的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及組合物作為制備治療紅細(xì)胞低下性貧血藥物中的應(yīng)用。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 化合物Harrisotone A的制備

化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。

實(shí)施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌3h。3h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₀Br₃O₆:793.1137；found 793.1134.

實(shí)施例3 Harrisotone A的O-(二乙氨基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的淡黃色固體(246.1mg,64％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.13(s,2H),4.19(s,2H),3.52(d,J＝5.3Hz,4H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),2.85(s,12H),2.64(d,J＝13.5Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,1H),2.11(s,2H),2.04(s,1H),1.98(s,1H),1.88(s,1H),1.77(d,J＝5.0Hz,7H),1.70(d,J＝15.5Hz,7H),1.61(s,1H),1.54(s,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.10(s,24H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.18(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.15(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),52.53(s),51.93(s),50.76(s),47.69(s),45.04(s),39.51(s),36.43(s),30.63(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.57(s),18.04(s),12.27(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₈₀N₃O₆:770.6047；found:770.6044。

實(shí)施例4 Harrisotone A的O-(哌嗪基)乙基衍生物的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無(wú)水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到化合物IV的淡棕色固體(286.9mg,71％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.21(s,2H),3.53(d,J＝6.2Hz,4H),3.09(s,2H),3.05(s,2H),2.66(s,12H),2.57–2.53(m,4H),2.33(d,J＝15.0Hz,15H),2.24(s,1H),2.14(s,2H),2.10(s,1H),2.00(s,1H),1.88(d,J＝10.5Hz,3H),1.79(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.63(s,1H),1.55(s,1H),1.46(s,1H),1.15–1.05(m,8H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.28(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.25(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),54.35(s),54.16(s),53.66(s),50.78(s),45.24(s),45.06(s),39.49(s),36.45(s),30.61(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.58(s),18.04(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₇₇N₆O₆:809.5905；found:809.5901。

實(shí)施例5 組合物抗紅細(xì)胞低下性貧血實(shí)驗(yàn)

一、組合物對(duì)失血小鼠的治療作用

ICR小鼠30只，♀♂各半，均分成5組(n＝10)。除生理鹽水組外，其它組每只小鼠從眼眶靜脈放血0.5ml，24h后再取血測(cè)全部各組指標(biāo)，然后連續(xù)灌胃給藥1周且給藥之后每天放血0.5ml，末次給藥1h后，從眼眶靜脈叢取血用F-800全血小板分析儀進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(10¹²/L)。

組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的40mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的60mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

表1組合物對(duì)因失血所致紅細(xì)胞減少的治療作用

與模型組比較：*p<0.05

結(jié)果表明，放血小鼠經(jīng)服用組合物治療7天后，與模型組比較，其紅細(xì)胞顯著高于模型組，接近生理鹽水組。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

二、組合物對(duì)環(huán)磷酰胺致紅細(xì)胞減少的治療作用

對(duì)小鼠骨髓造血功能損傷的防治作用ICR小鼠50只，♀♂兼用，均分成5組(n＝10)，即生理鹽水組、造模組、組合物1.2mg/kg組、化合物III 1.2mg/kg組和化合物IV 1.2mg/kg組，口服給藥，每天1次。第0、5、10日除生理鹽水組外，其它各組小鼠分別腹腔注射環(huán)磷酸胺80mg/kg，然后繼續(xù)給藥3天。于末次給藥后1h，從眼眶靜脈叢取血，測(cè)紅細(xì)胞數(shù)(10¹²/L)。

表2組合物對(duì)環(huán)磷酰胺所致紅細(xì)胞的影響

與模型組比較：**p<0.01

結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，環(huán)磷酸胺能使小鼠骨髓損傷，造成外周血細(xì)胞下降，組合物組與模型組比較，可明顯對(duì)抗環(huán)磷酸胺所致小鼠紅細(xì)胞下降。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

三、組合物對(duì)苯所致紅細(xì)胞減少的治療作用

對(duì)再生障礙性貧血小鼠的影響：昆明種小鼠50只，♀♂兼用，均分成5組(n＝10)，除生理鹽水組外，其它組小鼠皮下注射苯0.5ml/kg，連續(xù)12天，造模的當(dāng)日，同時(shí)口服給藥，每天1次，共18天，末次給藥后1h，眼眶靜脈叢取血，測(cè)紅細(xì)胞。

表3組合物對(duì)苯所致紅細(xì)胞減少的治療作用

與模型組比較：**p<0.01

結(jié)果表明，組合物組與模型組比較，可明顯對(duì)抗苯所致再生障礙性貧血小鼠紅細(xì)胞的下降。而化合物III和化合物IV無(wú)此作用。

結(jié)論：組合物能夠顯著升高紅細(xì)胞，可以用來(lái)制備治療貧血的藥物。而化合物III和化合物IV不能夠顯著升高紅細(xì)胞，不能用來(lái)制備治療貧血的藥物。

實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。

實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。