本發明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種白細胞免疫球蛋白樣受體(leukocyteig-likereceptorB4，LILRB4)作為靶基因在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應用。
背景技術：
：糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染和精神因素等多種因素引發的機體胰島功能減退、胰島素抵抗，最終導致糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征。Ⅱ型糖尿病患者有大血管和微血管并發癥，包括動脈粥樣硬化癥、冠心病、末梢血管病、高血壓、腎病、神經病和視網膜的風險顯著增加。糖尿病是繼癌癥、心血管疾病之后的第三大健康疾病。據統計，全球糖尿病患者已超過3億人，其中Ⅱ型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)占90％以上，到2030年，患病人數將超過4億。值得注意的是，當前兒童、青少年以及青年人群中T2DM前期發病率劇增，這也意味著在未來的糖尿病的發病人群將擴大，防治難度將會大大增加。當前市場上已有許多藥物靶點被發現并被應用于糖尿病治療領域，但由于靶點機制問題，很多傳統的抗T2DM藥物存在低血糖、心血管事件、體重增加等副作用，這限制了它們的使用。非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損傷肝因素造成的以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病例綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷。包括單純性脂肪肝，非酒精性脂肪肝炎，以及終末肝臟疾病如肝硬化和肝細胞癌。此外，脂肪肝還可損害消化系統功能，降低人體免疫力、減弱解毒功能，影響激素代謝，嚴重影響了人們的身體健康和生活質量，也給社會帶來沉重負擔。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加。研究結果顯示，在糖尿病人群中，NAFLD患病率可高達80％[1]。在有些患者中肝臟脂肪沉積可能是影響其T2DM發展的主要因素[2]。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分發展，不僅促進脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細胞癌。T2DM合并NAFLD將大大增加由于肝硬化、肝細胞癌和心血管并發癥導致的死亡風險[3]。目前，雖然控制高脂血癥在T2DM伴NAFLD患者中的治療作用仍有待探究，但是NAFLD的治療主要包括針對糖尿病和心血管風險因子的積極控制。研究表明，在合并T2DM和NAFLD的患者中，只有噻唑烷二酮類藥物吡格列酮顯示出肝臟組織學的明顯改善。因此未來我們應該制定特異的篩選標準以及治療方案以期應用于臨床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。白細胞免疫球蛋白樣受體B4(LILRB4)，分子量為50kDa左右，屬于一種新的細胞表面受體家族成員，它是一種抑制性受體，主要表達于單核細胞、巨噬細胞中[4]。LILRB4胞質區內含有兩個ITIM(cytoplasmicimmunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs)區域，ITIM可以募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或SHIP等而發揮作用。體外實驗中，LILRB4活化可以降低CD11b、HLA-DR、FcγRⅡI或LPS刺激誘導的白細胞活化[4,5]。最近的研究顯示，抗原呈遞細胞中增加的LILRB4表達在抑制免疫耐受中發揮關鍵作用[6]。另外，破壞gp49B1，一種人類LILRB4的小鼠同源物，可以增加膠原誘導的關節炎、IgE介導的過敏反應和LPS誘導的敗血癥休克的傾向性[7,8]。但是，LILRB4具體如何調節下游信號通路而發揮其抑制性作用仍不清楚。考慮到LILRB4只有兩個胞質內的Ig樣功能域，區別于含有4個Ig樣功能域的其他抑制性LILR，提示LILRB4可能結合特異性的配體而發揮其抑制作用。但是LILRB4生理和病理過程中作用仍不清楚。參考文獻：1.FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009；50:204-2102.LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013；43:51-643.CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016；59:1112-11204.CellaM,DohringC,SamaridisJ,DessingM,BrockhausM,LanzavecchiaA,ColonnaM.Anovelinhibitoryreceptor(ilt3)expressedonmonocytes,macrophages,anddendriticcellsinvolvedinantigenprocessing.JExpMed.1997；185:1743-17515.BuJY,ShawAS,ChanAC.Analysisoftheinteractionofzap-70andsykprotein-tyrosinekinaseswiththet-cellantigenreceptorbyplasmonresonance.ProcNatlAcadSciUSA.1995；92:5106-51106.ZhouH,WangZD,ZhuX,YouY,ZouP.Cd8+foxp3+tcellsfromrenaltransplantrecipientsinquiescenceinduceimmunoglobulin-liketranscripts-3and-4ondendriticcellsfromtheirrespectivedonors.TransplantProc.2007；39:3065-30677.ZhouJS,FriendDS,LeeDM,LiL,AustenKF,KatzHR.Gp49b1deficiencyisassociatedwithincreasesincytokineandchemokineproductionandseverityofproliferativesynovitisinducedbyanti-typeⅡcollagenmab.EurJImmunol.2005；35:1530-15388.KatzHR.Inhibitionofpathologicinflammationbyleukocyteig-likereceptorB4andrelatedinhibitoryreceptors.ImmunolRev.2007；217:222-230技術實現要素：為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于提供一種白細胞免疫球蛋白樣受體B4(LILRB4)基因的表達與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關系，提供一個用于治療非酒精性脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因LILRB4的新用途，進而把LILRB4基因應用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。本發明的目的通過以下技術方案實現：本發明以野生型C57小鼠與LILRB4基因敲除小鼠為實驗對象，通過高脂飲食(Highfatdiet,HFD)誘導的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，DIO)研究LILRB4基因的功能，結果發現與野生型WT小鼠對比，LILRB4基因敲除小鼠在HFD后體重變化不明顯，但是其空腹血糖水平高于對照組WT小鼠，LILRB4基因敲除小鼠的肝功能明顯差于WT小鼠。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發現LILRB4基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質成分、糖原含量病理染色結果等均說明HFD組的LILRB4-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質蓄積顯著增加。這表明LILRB4基因敲除會加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發生，LILRB4基因能夠改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發生。本發明人的研究證明了：在高脂誘導的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，LILRB4具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質蓄積，保護肝功能，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。針對LILRB4的上述功能，提供LILRB4作為藥物靶標在篩選保護肝臟及糖代謝的藥物中的應用。針對LILRB4的上述功能，提供LILRB4作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應用。以上藥物是指能夠促進LILRB4基因表達的藥物。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：(1)本發明發現LILRB4基因的新功能，即LILRB4基因具有能夠保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。(2)基于LILRB4在保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是LILRB4基因敲除小鼠的構建策略圖。圖2是WT和LILRB4-KO小鼠的體重、空腹血糖結果圖；A為小鼠體重結果圖，B為空腹血糖水平統計圖(*：p＜0.05vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組)。圖3是WT和LILRB4-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)比較圖(*：p＜0.05vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組)。圖4是LILRB4-KO和WT小鼠的肝臟重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統計柱狀圖(#：p＜0.05vsWTHFD組)。圖5是WT和LILRB4-KO和WT小鼠的油紅O染色和糖原染色結果圖。具體實施方式通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。實驗用動物及飼養：實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6(WT)小鼠和肝臟特異性LILRB4基因敲除(LILRB4-KO)小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；肝臟特異性LILRB4基因敲除小由LILRB4-Floxed小鼠與受蛋白啟動子控制、肝細胞特異性表達的Cre轉基因小鼠Albumin-Cre(購自TheJacksonLaboratory，貨號003574)雜交得到，構建策略見圖1。肝臟特異性LILRB4基因敲除小鼠的構建：根據基因信息利用CRISPRDesign(網址：http://crispr.mit.edu/)分別在小鼠LILRB4基因外顯子1前端非翻譯區和內含子2中各設計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為LILRB4-sgRNA1：ggTAGGATGTCAGAGTTGCAGCGTGG；LILRB4-sgRNA2：ggATTCCTCAAAATGGTGATGGGGGG此外還設計了一個用于同源修復的供體質粒(DonorVector)，它包括兩側同源臂、中間的外顯子1和2、以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經過限制性內切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續的體外轉錄實驗。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體的構建：根據引物設計原則，設計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產物經表1中所示限制性內切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。表1構建供體載體所需引物序列及對應酶切位點引物名稱引物序列酶切位點LILRB4LA-FGGGGTACCGTTCTTGTGTTGCTCTATGCTTTTKpnILILRB4LA-RGCGTCGACTGCAACTCTGACATCCTAATTCTTSalILILRB4M-FTCTACCGGTGCGTGGTGTAGCACACATAACAgeILILRB4M-RGACCTTAAGATCACCATTTTGAGGAATTGACACAflIILILRB4RA-FCGACGCGTGGGGGGTTGACATTTATGGGMluILILRB4RA-RATAAGAATGCGGCCGCACAGTGCTCCCTCCCTTTTANotI④打靶載體的轉錄：對CRIPR/Cas9系統包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體pST1374-Cas9(Addgene44758)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質粒為轉錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉錄，獲得加帽的mRNA產物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產物加尾，獲得成熟的mRNA產物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。⑤LILRB4flox條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產物與供體質粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續的繁殖，最終獲得LILRB4flox純合小鼠。⑥肝臟特異性LILRB4基因敲除小鼠的制作將上述LILRB4flox小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉基因小鼠交配，篩選得到LILRB4flox/flox/Albumin-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到肝臟細胞特異性LILRB4基因敲除小鼠。實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質：20％；碳水化合物：20％；脂肪：60％，總的熱量質量比：5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質:20％；碳水化合物：70％；脂肪：10％，總的熱量質量比：3.85kcal/g。飼養環境及條件：SPF級實驗動物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。【實施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(dietinducedobesity，DIO)獲得(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和LILRB4-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個組別。(2)模型通過高脂飼料誘導操作流程：采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關分析，明確LILRB4基因對脂肪肝、Ⅱ型糖尿病發揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和LILRB4-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測1次。實驗第11周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力。第12周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(TissueFreezingMedium)包埋作為病理分析用。【實施例2】小鼠體重、血糖水平測定(1)小鼠空腹體重，食量檢測1)體重檢測。①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周稱重，將一塑料小桶放在動態電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數據。飼料量檢測：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態電子天平上記錄小鼠的飼料量。(2)空腹血糖水平檢測實驗將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，ONETOUCH)電池，按右側開關，將試紙正確放入左側插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應代碼的數字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數。Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結果如圖2所示，HFD組的LILRB4-KO小鼠體重與HFD組的WT小鼠體重沒有明顯差異(見圖2A)；經空腹血糖檢測發現在HFD組的小鼠從第6周、8周、10周、12周的空腹血糖水平明顯較相應NC對照組升高，HFD組的LILRB4-KO小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT組小鼠空腹血糖水平(見圖2B)。表明LILRB4基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養狀態下的糖代謝穩態，LILRB4基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，LILRB4基因可抑制高脂誘導引起的Ⅱ型糖尿病的發生。【實施例3】葡萄糖耐量實驗(intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)實驗第11周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據10μL/g計算葡萄糖的注射體積。(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經腹腔注射葡萄糖液。(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數值和檢測時間。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第11周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和LILRB4-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復至空腹血糖水平，且LILRB4-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時一直處于高于WT小鼠的血糖水平(圖3A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)，發現WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，LILRB4-KOHFD組的AUC顯著大于WTHFD組的AUC(圖3B)，表明LILRB4可維持糖代謝穩態。【實施例4】肝臟大體外觀及肝臟油紅O、糖原染色(1)終末肝臟組織取材1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發潤濕。2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養皿中，迅速稱重。4)石蠟標本：切取部分肝臟置于10％中性福爾馬林中固定。冰凍標本：切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。2.肝臟組織處理及病理染色相關實驗1)肝臟脫水，透明，浸蠟切取10％中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標記的包埋框內，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機器上設置以下程序，①脫水：75％酒精(45分鐘)→75％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→無水酒精(1小時)→無水酒精(1小時)；②透明：二甲苯(1小時)→二甲苯(1小時)；③浸臘(65℃)：石蠟(1小時)→石蠟(1小時)。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進機器籃筐內，啟動上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時清洗機器備用。2)肝臟組織切片使用切片機切片(切片厚度5μm)。3)肝臟組織糖原染色將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱(30分鐘)→二甲苯中(5分鐘×3次)→100％酒精(1分鐘)→90％酒精(1分鐘)→70％酒精(1分鐘)→蒸餾水洗→高碘酸(10分鐘)→自來水洗去切片上的浮色→雪夫試劑浸染(10-15分鐘)→自來水洗數下→蘇木素(1分鐘)→蒸餾水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分鐘×3次)→在二甲苯未干時封片，拍照。4)肝臟組織油紅O染色①將冰凍肝臟組織切片在通風櫥中風干30分鐘，4％多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。②以60％異丙醇處理1分鐘。③用油紅O(公司sigma，貨號O0625，濃度0.5克/100mL100％異丙醇)染色30分鐘。④之后以60％異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。⑤用Mayer’s蘇木素染液(5滴)淡染細胞核。⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍，充分水洗，水洗至細胞核藍化。⑦用甘油明膠封片，拍照。肝臟重量及肝重體重比結果見圖4所示，在HFD組的LILRB4-KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高(如圖4)。進一步通過組織切片，進行油O和糖原染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養條件下發生了顯著的病理改變。通過肝臟油紅O染色，可以觀察到在HFD飼養條件下，WT小鼠和LILRB4-KO小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到NC組小鼠的肝細胞發生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細胞形態已幾乎完全破壞，而LILRB4-KO組小鼠的肝細胞形態變化更為嚴重(如圖5上)。通過肝臟糖原染色來檢測肝臟損傷程度，可以發現在HFD組的LILRB4-KO小鼠肝糖原的含量相比于WT組小鼠明顯減少(如圖5下)，說明HFD組LILRB4-KO小鼠肝臟損傷程度更為嚴重。這些結果說明LILRB4基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。上述結果顯示LILRB4-KO小鼠在HFD的誘導下發生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結果表明LILRB4基因對改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發明結果說明LILRB4基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120>白細胞免疫球蛋白樣受體B4在治療非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>LILRB4-sRNA1<400>1ggtaggatgtcagagttgcagcgtgg26<210>2<211>26<212>DNA<213>LILRB4-sRNA2<400>2ggattcctcaaaatggtgatgggggg26<210>3<211>32<212>DNA<213>LILRB4LA-F<400>3ggggtaccgttcttgtgttgctctatgctttt32<210>4<211>32<212>DNA<213>LILRB4LA-R<400>4gcgtcgactgcaactctgacatcctaattctt32<210>5<211>30<212>DNA<213>LILRB4M-F<400>5tctaccggtgcgtggtgtagcacacataac30<210>6<211>33<212>DNA<213>LILRB4M-R<400>6gaccttaagatcaccattttgaggaattgacac33<210>7<211>28<212>DNA<213>LILRB4RA-F<400>7cgacgcgtggggggttgacatttatggg28<210>8<211>36<212>DNA<213>LILRB4RA-R<400>8ataagaatgcggccgcacagtgctccctccctttta36<210>9<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>9agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>10<211>50<212>DNA<213>loxp1-R<400>10atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>11<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>11gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>12<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>12ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52當前第1頁1 2 3